فإن الكتاب أود أن أنوه بالمساهمة الفنية للجلوريا A بينافيدس. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية 13PRE16390001 (SR)، NIH T32HL07918 (PAK)، NIH T32HL007457 (TM)، P30DK056336 (BKC)، مضاعفات السكري NIDDK اتحاد (DiaComp، www.diacomp.org) DK076169 منحة (subaward VDU)، ومركز اوبراين P30 DK079337 (VDU).

وقد تم استعراض كافة البروتوكولات وصفها في هذه المخطوطة لجمع الدم والعزلة والتحليل والتي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسساتي في جامعة ألاباما في برمنغهام. 1. عزل الخلية (معدلة من Histopaque سيغما الدريخ البروتوكول رقم 1119 وبيوتيك Miltenyi MicroBead إيجابي والبروتوكولات اختيار سلبي) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الدم الكامل (تم جمعها في ACD أو أنابيب EDTA) في 500 x ج لمدة 15 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار يتأرجح دلو (التسارع = 5-6، وليس الفرامل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطبقة العليا التي تحتوي على صفائح البلازما الغنية (الحزب الثورى) مع ماصة نقل حتى يبقى 1 سم فوق طبقة الخلايا (كرات الدم الحمراء معطف / ​​الشهباء). جانبا PRP في درجة حرارة الغرفة لتجهيز في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل معطف الشهباء لالعقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، وتمييع إلى 24 مل مع RPMI القاعدية أو إلى 4x على الأقل بدءا حجم معطف الشهباء. ملاحظة: في النصف العلوي من طبقة RBC قد حافي ليتم تضمينها على الرغم من أن هذا سيؤدي إلى زيادة حجم RPMI نسبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدرج الكثافة ومنخفض الكثافة باستخدام Ficoll مع الثقل النوعي من 1.077 (1077) عن الطبقة العليا وارتفاع كثافة Ficoll مع الثقل النوعي من 1.119 (1119) عن الطبقة السفلى في ثلاثة أنابيب مخروطية 15 مل (3 مل لكل منهما). لتنفيذ هذه الخطوة، أولا إضافة 1077 إلى كل أنبوب. باستخدام 5 مل ماصة الضيقة إضافة 1119 إلى الجزء السفلي من الأنبوب من خلال وضع غيض ماصة تحت 1077 وببطء الافراج عن كاشف دون خلط مع التدرج العليا. وينبغي أن يكون ما مجموعه 6 مل من وسائل الإعلام التدرج الكثافة الحالية في هذه المرحلة مع مرحلة اضح عن الانفصال في 3 مل علامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الآلي، إضافة 8 مل من الدم المخفف (من الخطوة 1.3) بلطف إلى كل أنبوب التدرج باستخدام الإعداد الطاقة المنخفضة لمنع إزعاج من طبقات متدرجة. يجب أن يكون الحجم الكلي 14 مل في هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (accele6 التموينية، لا الفرامل). ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن يكون ثلاثة نطاقات خلية متميزة واضح (الشكل 1A). نطاقات العلوي (بين 1077 والبلازما) يحتوي على خلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) والصفائح الدموية، والفرقة الوسط (بين 1007 و 1119) يحتوي على خلايا النوى (PMNs) وانخفاض الفرقة (أقل من 1119) يحتوي على كرات الدم الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع MNC وPMN بشكل منفصل باستخدام ماصات زجاجية معقمة دون إزعاج نطاقات الخلايا الأخرى. الجمع بين السكان MNC من كل أنبوب إلى أنبوب 50 مل العقيمة المخروطية. كرر هذا للسكان PMN كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مجلدات من RPMI إلى كل أنبوب يحتوي على MNC وPMN الكسور على التوالي لتخفيف التدرج الكثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend MNC بيليه الخلية والخلية بيليه PMN في 1 مل RPMI تحتوي على 0.5٪ نقي للغاية الدهنية خالية من حمض BSA (RPMI-BSA) ونقل إلى 1.5 مل أنابيب عقيمة. بيليه الخلايا باستخدام picofuge الفوق لمدة 30ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend كل بيليه الخلية في 80 ميكرولتر RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من حبة المغناطيسي المسمى antiCD14 الضد إلى الأنبوب الذي يحتوي على جزء MNC لاختيار إيجابية من وحيدات. للالأنبوب الذي يحتوي على جزء الخلية PMN، إضافة 20 ميكرولتر من حبة المغناطيسي المسمى antiCD15 الأجسام المضادة لاختيار إيجابية من العدلات. احتضان كل تعليق خلية لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل تعليق الخلية مع 1 مل سائل الإعلام RPMI-BSA وبيليه كما كان من قبل و resuspend كل بيليه في 500 ميكرولتر RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم فصل الخلايا المسمى في المجال المغناطيسي للخلية تنشيط الفرز المغناطيسي (MACS) فاصل. إعداد الأعمدة MACS LS (واحد لكل تعليق خلية) عن طريق وضع العمود على فاصل MACS والغسيل مع 3 مل من RPMI-BSA قبل إضافة تعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تطبيق الايقاف الخلية، وغسل كل عمود 3X مع 3 مل من RPMI-BSA سائل الإعلام (تأكد من السماح للدري وسائل الإعلامن تماما بين يغسل). جمع التعليق الخلية التدفق من خلال ويغسل العمود في أنبوب العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل حيدات والعدلات، وإزالة العمود من المجال المغناطيسي بعد غسل النهائي وأزل الخلايا المحددة بشكل إيجابي في أنبوب العقيمة مع 5 مل من RPMI-BSA باستخدام المكبس العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الخلايا الليمفاوية بيليه جزء التدفق من خلال غسل من الشركات المتعددة الجنسيات من الخطوة 1.15 في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 80 ميكرولتر RPMI-BSA. إضافة 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD61 وCD235a واحتضان تعليق خلية لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. تكرار فصل MACS كما كان من قبل، وجمع تدفق الرغم تحتوي على الخلايا الليمفاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتكوير حيدات، العدلات، اللمفاويات والكسور، كما كان من قبل أجهزة الطرد المركزي (الخطوة 1.9) وتجاهل supernatants. يجب معلق الكريات الخلايا في 1 مل خارج الخلية تدفق وسائل الاعلام (XF-DMEM) لفرز الأصوات. &lt;ر /&gt; ملاحظة: يجب 8 مل من الدم الكامل يؤدي إلى 1-5 × 10 6 حيدات / مل، و5-20 × 10 6 الخلايا الليمفاوية والعدلات / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الصفائح الدموية، الطرد المركزي PRP (الخطوة 1.2) لمدة 8-10 دقيقة في 1،500 XG في درجة حرارة الغرفة. إزالة البلازما ويغسل مرة واحدة مع بيليه الخلية معقمة 5 مل PBS تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل PGI 2، repellet وتعليق بيليه النهائي في 1 مل من برنامج تلفزيوني PGI 2 العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الصفائح الدموية عن طريق قياس العكر مرة واحدة وعلقت الصفائح الدموية في برنامج تلفزيوني PGI 2 العازلة معمل كما وصفها Walkowiak آخرون باستخدام المعادلة التالية: [6.23 / (2.016 - عبس 800)] - عامل التخفيف 3.09 س = # × 10 8. الصفائح الدموية / مل 12. </li></ol> 2. طلاء للخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلوي تاك (لاصق الخلية): إضافة 90 ميكرولتر خلية لاصقة إلى 180 ميكرولتر DIH 2 0، 540 ميكرولتر من 0.1 N ثنائي الصوديومكربونات (درجة الحموضة 8.0)، وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،8 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم. إعداد لوحات XF (24 جيدا، V7 microplates) بواسطة طلاء كل جيدا مع 30 ميكرولتر من خلية لاصقة المعدة. ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا لاصقة خلية جديدة لكل استخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة ثم اللصق الخلية نضح ويغسل الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني (1 مل / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ عدد خلايا معزولة على حيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات والصفيحات وتقديمهم إلى حجم مناسب باستخدام XF-DMEM للسماح كثافة البذر من 250K خلايا / جيد للحيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات، و 25 × 10 6 / جيد لالصفائح الدموية. بدلا من ذلك، لقياس استجابة انفجار الأكسدة، العدلات يمكن المصنف في 125K خلايا / جيد. يجب أن يكون حجم بذر النهائي لكل ميكرولتر 200 تعليق خلية / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 1 ثانية مع عدم وجود الفرامل. تدوير لوحة 180 ˚ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى مع عدم وجود الفرامل في 300 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب المجلد جيدا النهائيأوميا إلى 660 ميكرولتر مع XF-DMEM واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل XF الفحص. ملاحظة: Photomicrographs الخلايا مطلي قبل وبعد الفحص يمكن استخدامها لضمان الطلاء الكافية ويستبعد مفرزة الخلية. </li></ol> 3. إعداد 24 جيدا خارج الخلية الجريان الفحص بلايت (XF24) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات XF يبحث مع حل calibrant مدة لا تقل عن 2 ساعة قبل الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10X مخزونات 0.5 ميكروغرام / مل أوليغوميسين، 0.6 ميكرومتر FCCP، و 10 ميكرومتر في antimycin A-XF DMEM وتحميل 75 ميكرولتر من الحلول الأسهم في الموانئ حقن خرطوشة في الترتيب أعلاه. إذا القياسات انفجار الأكسدة هي التي يمكن الحصول عليها، حقن 10X الأسهم من 100 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية يمكن حقنها بعد antimycin-A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة خرطوشة رطب وتحميلها وتنفيذ أعمال الفحص XF. وقد وصفت وسائل تفصيلية لتحليل وتفسير التغيرات سواء استهلاك الأوكسجين ودرجة الحموضة في المنشورات السابقة 9،13،14 ولا دiscussed في التفاصيل هنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد XF مقايسة، ونضح جميع ولكن 50 ميكرولتر من مشاركة XF-DMEM بعد الفحص لمنع فقدان الخلايا من لوحة وإضافة 50 ميكرولتر العازلة RIPA تحلل الخلية وإجراء فحص البروتين للتطبيع. </li></ol>

<ol>
	<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cognitive+impairment,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).</li><li>Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+mitochondrial+quality+control,+and+oncogenesis.">Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis.</a> Autophagy. 2, 80-84 (2006).</li><li>Cordero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients:+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease.">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).</li><li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5'-triphosphate+synthase+activity.">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li><li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+membrane+potential,+mass,+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes.">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ageing+and+Alzheimer's+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets.">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li><li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins.">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li><li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy.">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li><li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autoimmunity,+arthritis,+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene.">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li><li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections:+case+report.">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li><li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation.">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).</li></ol>

VDU هو عضو في المجلس الاستشاري العلمي العلوم البيولوجية فرس البحر.

يمثل هذا البروتوكول تجميع عدة تقنيات تستخدم عادة لعزل خلايا الدم بطريقة مناسبة لتحليل الطاقة الحيوية. تقنيات متجاورة قدمت هي مفيدة لأساليب العزل الأخرى (أي تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية) لقدرتها على عزل أعداد كبيرة من الخلايا في ظروف وسائل الإعلام التي تسيطر عليها مع الحد الأدنى من الضغوط المفروضة على خلايا معزولة. فمن لديه عيب العزلة المطولة حتى مع الحد الأدنى من انقطاع. يخدم هذا البروتوكول كأساس لعزل خلايا الدم الأولية من بالكائن البشري، والتي يمكن استقراء في إعدادات السريرية والبحوث متعدية. MACS الانفصال هو موثوق بها تقنية عزل الخلية التي توفر إمكانية عزل الخلايا مباشرة من الدم الكامل، ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب كميات أكبر من الأجسام المضادة وليس الأمثل لعزل جميع أنواع الخلايا متميزة أربعة كما هو موضح في هذا الأسلوب. لديه هناك بالتابعين أي دليل لإثبات أن اختيار إيجابية من الكريات البيض التي كتبها نتائج الانفصال MACS في التنشيط باستخدام بروتوكول عزلتنا. الأعمدة MACS تعمل بواسطة امتصاص الخلايا المسمى في مجال مغناطيسي باستخدام الأجسام المضادة مترافق إلى 50 جزيئات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic نانومتر. ثم يتم مزال الخلايا المسمى قبالة العمود. يتم تطبيق الاختيارات الإيجابية والسلبية في هذا البروتوكول لضمان العزلة السريع والنقاء. إذا تم الحصول على عدم كفاية أعداد الخلايا من العزلة أو النقاء هو في السؤال، وأكثر الأجسام المضادة يمكن أن تضاف إلى العينة وفقا لتعليمات البائع والمقطع الثاني من خلال العمود LS قد يؤدي إلى مزيد من النقاء (الجدول 2). وجدت لدينا مختبر نقاء عالية وكفاءة الطلاء باستخدام بروتوكول القائمة من خلال تحليل الايقاف الخلية النهائي عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية 8. تحليل تدفق خارج الخلية لديها القدرة على رصد كل استهلاك الأوكسجين وتحمض وسائل الإعلام في الوقت الحقيقي على ذلك من بعد التمديدالأقطاب الكهربائية لها. استهلاك الأكسجين كما لوحظ من قبل استجابة التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات هو NADPH أوكسيديز تعتمد كما هو موضح عن طريق تثبيط مع DPI 8. شهدنا الوقت فقدان القدرة تعتمد في انفجار التأكسدي مع العزلة لفترات طويلة أو المقايسات XF الموسعة. وقد تم تصميم هذا البروتوكول وضعت للاستخدام على XF24 ولكن هو أيضا متوافقة مع XF96 في حوالي ثلث إلى نصف واحد من الخلية XF24 بذر الكثافة (الشكل 3). في تصميم هذا البروتوكول، وكان مطلوبا الالتزام البروتوكولات القائمة لكل تقنية لتحقيق الأداء الأمثل مع التعديلات التي أدخلت فقط للسيطرة على الأوضاع وسائل الإعلام لتحليل الطاقة البيولوجية. بعد اتقان التقنيات، مثل بروتوكول يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات والبحوث متعدية لقياس السمية أو فعالية استراتيجيات العلاج، واستكشاف الخصائص الأيضية من المرض، والإنتاج أكسدة بواسطة الوحيدات ونيوتrophils في حالات الالتهابات.

مراقبة صحة الطاقة البيولوجية للخلايا المناعية (وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات) والصفائح الدموية من الدم وقد اعترف لبعض الوقت كأداة تشخيصية يمكن أن تكون مفيدة لتقييم صحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد. هناك هيئة الناشئة الأدب وعزا عدد من الأمراض مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية وأمراض الاعصاب لضعف الميتوكوندريا 1،2. هذا هو المهم سريريا منذ ضعف الميتوكوندريا يمكن الشروع في سلسلة من الأحداث الخلوية التي تعزز مسارات الإشارات الموالية للالتهابات أو تؤدي إلى موت الخلية. وتتميز العديد من الدراسات وظيفة الميتوكوندريا من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى والصفائح الدموية في ظروف مثل فيبروميالغيا، ومرض السكري، والصدمة الإنتانية، ومرض الزهايمر 3-7. على سبيل المثال، تقييم دراسة حديثة أن الطاقة الحيوية من الصفائح الدموية كعلامة من أجل وظيفة الميتوكوندريا وجدت أن الصفائح الدموية من النوع 2 DIABETقد المرضى جيم تقلص الميتوكوندريا 7،8 استهلاك الأوكسجين. من هذه النتائج وغيرها، فمن الواضح أن وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات، والصفائح الدموية يمكن أن تكون علامات بديلة وذلك اعتبارا من التغيرات في الطاقة الحيوية في ظل ظروف مرضية لأنها مسح جهاز الدورة الدموية ويمكن أن تعكس التغيرات الأيضية المحلية والعالمية. لتحديد ما إذا كان هذا النهج له قيمة النذير أو التشخيص طريقة إنتاجية عالية من التحليل وكان المطلوب هو طريقة متسقة لإعداد الخلية. الأساليب لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الكريات البيض والصفيحات الدموية وقد شاركت سابقا عزل الميتوكوندريا أو تقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا سليمة 4،9. الاستفادة من تقييم الطاقة البيولوجية الخلوية باستخدام تدفق خارج الخلية (XF) محلل هو أن وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا يمكن أن تنشأ مع ركائز الذاتية والمعلمات الجهاز التنفسي مثل تسرب بروتون والجهاز التنفسي القصوىيمكن تحديد القدرات. نحن وغيرنا قد استخدمت هذه التكنولوجيا لإظهار أن ملامح الطاقة البيولوجية في الصفائح الدموية، وحيدات الخلايا اللمفية المعزولة من الدم البشري يمكن أن تنشأ ومقارنة بين أنواع الخلايا 8. بالإضافة إلى ذلك، كل من العدلات وحيدات تمتلك قدرة التأكسدي في انفجار التي يتم تنشيطها oxidases NAPDH وتستهلك الأكسجين لتشكيل الفائق. الأهم من ذلك، هذا المسار هو عنصر أساسي من المناعة الفطرية والالتهابات الجهازية عن طريق التضمين. على سبيل المثال، فقد تبين أن ترتبط التغييرات في قدرة التأكسدي انفجار مع مختلف أمراض المناعة الذاتية مثل التصلب المتعدد، والتهاب المفاصل، والالتهابات المتكررة 10،11. حاليا لا توجد إنتاجية عالية المقايسات الكمية المتوفرة لقياس انفجار التأكسدي في العينات السريرية. هذا أمر مهم لأن تميز قدرة التأكسدي انفجار العدلات وحيدات قد تخدم أيضا كأداة تشخيصية هامة لعدة patholoخيس. كانت التحديات التقنية الرئيسية انخفاض الحساسية لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام تقنيات تخطيط الاستقطاب التقليدية والحاجة إلى استخدام الخلايا المرفقة عند استخدام تقنيات صفيحة ميكروسكوبية فلوروميتريك أكثر حساسية. في هذا الفيديو عملية، ونحن تصف حل تقني لهذه المشاكل. نحن بالتفصيل الأساليب لعزل، والطلاء وقياس الطاقة الحيوية من وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات، والصفائح الدموية وانفجار التأكسدي من وحيدات والعدلات من الدم البشري، وهذا الأسلوب هو مناسبة لتقييم السريرية من الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار للمحققين أن يكون الوصول إلى السكان المريض والقدرة على الحصول على عينات دماء جديدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-094-833</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"><a name="RANGE!A3">CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</a></td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-501</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD61 MicroBeads, human&#160; for platelets</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-051-101</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD14 MicroBeads, human&#160; for monocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-201</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD15 MicroBeads, human&#160; for granulocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-046-601</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">LS Columns</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-042-401</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">02-684-26</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">11835-030</td>
			<td style="width:215px;">with L-glutamine and without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Prostaglandin I2, sodium salt</td>
			<td style="width:215px;">Cayman</td>
			<td style="width:215px;">18220</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">1.5 ml semi-micro cuvettes</td>
			<td style="width:215px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:215px;">SC-2410</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">10771</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">11191</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:215px;">Roche</td>
			<td style="width:215px;">3117405001</td>
			<td style="width:215px;">fatty-acid ultra-free</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8139</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">100850-001</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">MT90113PB</td>
			<td style="width:215px;">w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">L-Glutamine, 200mM (100x)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">G7528</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8574</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Cell-Tak (cell adhesive)</td>
			<td style="width:215px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">CB-40242</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">O4876</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A8674</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C-2920</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent A</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0113</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent S</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0015</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent B</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0114</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Vendor</td>
			<td style="width:215px;">Product #</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Seahorse</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-090-976 and 24039</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

ومن المعروف ضعف الميتوكوندريا أن تلعب دورا هاما في عدد من الحالات المرضية مثل تصلب الشرايين، والسكري، والصدمة الإنتانية، والأمراض العصبية ولكن تقييم التغيرات في وظيفة الطاقة البيولوجية في المرضى الذين يعانون من التحدي. على الرغم من أن الأمراض مثل السكري أو تصلب الشرايين الحاضر سريريا مع ضعف الجهاز محددة، مكونات النظامية من الأمراض، مثل ارتفاع السكر في الدم أو التهاب، ويمكن تغيير وظيفة الطاقة البيولوجية في تعميم الكريات البيض أو الصفائح الدموية. وقد اعترف هذا المفهوم لبعض الوقت ولكن تم تقييد التطبيق على نطاق واسع من قبل عدد كبير من الخلايا الأولية اللازمة لتحليل الطاقة البيولوجية. وقد تم التغلب على هذا القيد من خلال الجمع بين التقنية خصوصية تقنيات حبة العزل المغناطيسي، وتقنيات التصاق الخلية، والتي تسمح للخلايا لضمها دون تفعيل لmicroplates، وحساسية من التكنولوجيات الجديدة مصممة للإنتاجية عالية هيئة التصنيع العسكريقياس التنفس roplate. مثال على هذه المعدات هو محلل تدفق خارج الخلية. يستخدم مثل هذه الأجهزة عادة الأكسجين ودرجة الحموضة تحقيقات حساسة لقياس معدلات التغير في هذه المعلمات في الخلايا الملتصقة، ومن ثم يمكن المتعلقة الأيض. نحن هنا من التفصيل الطرق لعزل وطلاء من وحيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات والصفيحات، من دون تفعيل، من الدم البشري وتحليل وظيفة الميتوكوندريا الطاقة البيولوجية في هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح كيفية التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات ويمكن أيضا أن يقاس في نفس العينات. منذ استخدام هذه الأساليب فقط 8-20 مل دم الإنسان لديهم إمكانات لرصد الجيل أنواع الاكسجين التفاعلية والطاقة الحيوية في عملية إعداد سريرية.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets at JoVE.com

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

الكريات البيض في الدم والصفائح الدموية ويمكن أن تستخدم كعلامة للصحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد وذلك لديها القدرة على رصد العمليات المرضية وتأثير العلاجات. نحن هنا تصف طريقة لعزل وقياس وظيفة الميتوكوندريا وانفجار التأكسدي في هذه الخلايا.

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

bioenergetics-oxidative-burst-protocols-for-isolation-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.9K Views.  University of Alabama at Birmingham.  الكريات البيض في الدم والصفائح الدموية ويمكن أن تستخدم كعلامة للصحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد وذلك لديها القدرة على رصد العمليات المرضية وتأثير العلاجات. نحن هنا تصف طريقة لعزل وقياس وظيفة الميتوكوندريا وانفجار التأكسدي في هذه الخ...

Video: Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect of breast milk (BM). Unless access to clean water and appropriate infant formula is reliable, the WHO does not recommend cessation of breastfeeding for HIV-infected mothers. Numerous factors likely work in tandem to reduce BM transmission. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though what remains largely unclear is the contribution of these cells to the antiviral qualities of BM. Presently we aimed to isolate cells from human BM in order to measure antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), one of the most essential and pervasive innate immune responses, by BM phagocytes against HIV targets. Cells were isolated from 5 human BM samples obtained at various stages of lactation. Isolation was carried out via gentle centrifugation followed by careful removal of milk fat and repeated washing of the cell pellet. Fluorescent beads coated with HIV envelope (Env) epitope were used as targets for analysis of ADCP. Cells were stained with the CD45 surface marker to identify leukocytes. It was found that ADCP activity was significant above control experiments and reproducibly measurable using an HIV-specific antibody 830A.

Breast milk transmits human immunodeficiency virus (HIV), though only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though these cells are understudied. Here we describe the isolation of breast milk leukocytes and an analysis of their phagocytic capacity.

عزل الكريات البيض عن حليب الثدي البشري للاستخدام في فحص الفيغوسية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...