פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה של פעילות NF-kappa-B ו- AP-1 במקרופגים עיתונאיים המתרבים על שכבות חלבון סופחים ותרומת מסלולי איתות תאים, כמו קולטני אגרה, לתגובה זו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות שלה, המאפשרת לתרבות התאים לנתח במהירות עבור פעילות NF-kappa-B ו- AP-1 באמצעות חקירה אנזימטית פשוטה. התחל על ידי המסת PMMA בכלורופורם בריכוז סופי של 20 מיליגרם למיליליטר בבקבוקון זכוכית 20 מיליליטר במכסה המנוע של אדים.
מניחים בר מגנטי בבקבוקון, ומערבבים את התערובת במשך שעתיים לפחות. כאשר כל המוצקים כבר מומסים, להעביר 400 microliters של פתרון PMMA למרכז של כל שקופית מיקרוסקופ זכוכית borosilicate לכל תנאי מתוכנן על מעיל ספין, ולסובב את PMMA על השקופית במשך שתי דקות ב 3, 000 סיבובים לדקה. לאחר מכן אחסנו את השקופיות המצוות בספין בקופסה נקייה עם ריסוס אתנול של 70%.
לאחר מכן, בארון בטיחות ביולוגי, השתמש במלקעים סטריליים ובטכניקה אספטית כדי לחבר בארות דביקות של שמונה תאים למגלשות מצופות PMMA, תוך לחיצה חזקה על החלק העליון של כל באר דביקה כדי לוודא שהם מחוברים בחוזקה. יש לדאוג בשורה בארות דביקות עם הקצוות של שקופית מיקרוסקופ, כך כל בארות לצרף את השקופית ולא לדלוף. הדגירה את השקופיות הדביקות המחוברות היטב ב 37 מעלות צלזיוס לילה כדי לאבטח את כלבי הים.
לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מים נטולי אנדוטוקסין בתרבות התאים לכל באר עבור דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבדוק את כלבי הים למחרת בבוקר. בסוף הדגירה, שאפו את המים, ודאגו לא להפריע לציפוי PMMA. לשטוף כל באר שלוש פעמים עם 300 microliters של מים טריים נטולי אנדוטוקסין במשך שעה אחת לשטוף ואחריו אחד 12 שעות לשטוף 24 שעות לפני השימוש כדי להסיר כל ממס שנותר.
ואז UV לעקר את השקופיות במשך 30 דקות. כדי להשיג lysates תא 3T3, כאשר תרבות תא 3T3 להגיע 70%confluence בבקבוקי תרבות T150, לשטוף כל תרבות עם חמישה מיליליטר של PBS, ולטפל בתאים עם חמישה מיליליטר של בעלי חיים ללא מקור, אנזים דיסוציאציה תא רקומביננטי לכל בקבוקון ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות. בסוף הדגירה, בעדינות להטות כל בקבוקון קדימה ואחורה כמה פעמים כדי לנתק את התאים לפני נטרול האנזים עם חמישה מיליליטר של PBS לכל תרבות.
בריכת התאים ניתוק בצינור צנטריפוגה יחיד 50 מיליליטר, ולהשתמש פיפטה כדי לשבור את כל גושי התא. לאחר הספירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. שאף את העל-טבעי, והוסף מחדש את התאים בריכוז של פי 10 לשש התאים למיליליטר ב-PBS טרי.
לאחר מכן להקפיא את התאים במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות שעתיים עד המדגם קפוא לחלוטין לפני הצבת פתרון התא הקפוא באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד מופשר לחלוטין. כדי להעריך את ההשפעות של שכבת חלבון מסופגת על פעילות NF-kappa-B/AP-1 בתתיווך קולטן דמוי אגרה, לאחר גידול מקרופאגים כתב בבקבוק בגודל מתאים ל 70%confluence, לנתק את התאים עם פתרון דיסוציאציה אנזימטי המתאים כפי שהוכח. תן שימוש חוזר בתאים בריכוז של פי 7.3 מ-10 לחמשת התאים למיליליטר במדיום ההתמדה, ואליק את התאים באופן שווה בין שלושה צינורות.
לטפל בצינור הראשון של תאים עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של מעכב TLR4 במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, לטפל בצינור השני עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן נגד TLR2 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשאיר את הצינור השלישי בטמפרטורת החדר ללא טיפול. בזמן שהתאים דגירה, להוסיף 200 microliters של lysate ו 10% נסיוב חזיר עוברי לשלוש בארות דביקות לכל תנאי. אפשרו לחלבונים לספוג ב-37 מעלות צלזיוס לתקופת הניסיון המתאימה לפני שאתם שאפו את פתרונות החלבון עם פיפטה חדשה של פסטר לכל באר ושטפו את משטחי המברח הדביקים שלוש פעמים עם 250 מיקרוליטרים של PBS לבא במשך חמש דקות לכביסה.
בסוף הטיפול מקרופאג הכתב, להוסיף 200 microliters של פתרון התא לכל באר. הוסף Pam3CSK4 לריכוז סופי של 150 ננוגרם למיליליטר לשתי בארות כפקד חיובי TLR2 כפי שמודגם בשרטוט. לשליטה חיובית TLR4, להוסיף lipopolysaccharide לריכוז הסופי של 1.5 מיקרוגרם למיליליטר לשתי בארות.
לאחר 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, צלחת 20 microliters של על טבעי מכל באר כפולה בצלחת 96 באר, כולל שלוש בארות עם 20 microliters של מדיום בדיקה לכל גם את בקרת הרקע. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של כתב SEAP שיסיעו מגיבים לכל באר, וכסו את הצלחת עם חותם דבק עבור דגירה של שעתיים וחצי ב-37 מעלות צלזיוס. מעבירים את שאר העל-טבעי לצינור אחד של 1.5 מיליליטר לצריף דביק, ומכבידים על הפסולת באמצעות צנטריפוגה.
לאחר מכן העבר את העל-טבעיים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח ציטוקינות פרוינפלמה במורד הזרם על ידי ELISA. בסוף הדגירה, להסיר את החותם דבק מהצלחת, ולקרוא את הספיגה על קורא צלחת ב 635 ננומטר. השריית שקופיות מיקרוסקופ מצופות PMMA ב-70%אתנול למשך שעה מסירה את ציפוי ה-PMMA, ואילו עיקור של 70% אתנול או UV משפיע על זווית המגע במים של כיסויים מצופים fPTFE.
ניתוח כתם מערבי של ליזטים 3T3 חושף את נוכחותם של חלבון HMGB1 והלם חום 60, שני דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק מתועד היטב. הקליטה של ליגנדים TLR מן lysate על משטחי פולימר ניתן לאשר על ידי culturing כתב מקרופאגים במשך 20 שעות על משטחי פולימר סופח חלבון ולאחר מכן בעקיפין להעריך את פעילות NF-kappa-B/AP-1 באמצעות הערכה אנזימטית. פעילות זו מצטמצמת בעקבות עיכוב של איתות TLR2 או TLR4.
יתר על כן, מקרופאגים עיתונאי הגדילו באופן משמעותי את פעילות NF-kappa-B/AP-1 בתגובה לליסט סופוח בהשוואה ל-FBS או פלזמה טרום-סופחים וללא חלבון טרום-סופחת. בנוסף, כמויות קטנות של לייסאט מדולל בסרום לגרום גדל באופן משמעותי NF-kappa-B/ AP-1 תגובות לעומת סרום לבד, עם דילול יעיל הנמוך ביותר תלוי על פני השטח פולימר. כדי למנוע זיהום אנדוטוקסין של משטחים מצופים, לעבוד באזורים נקיים, לכסות את המשטחים כאשר לא בשימוש, ולהשתמש במים כיתה תרבות התא ומאגרים עבור שטיפות.
בעקבות הליך זה, immunoassays יכול להתבצע על supernatants הנותרים כדי להעריך הפרשת חלבון, מקרופאגים ניתן לנתח על ידי cytometry זרימה וניתוח ביטוי גנים qPCR.
