אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).

1. הכנת נייד ומדיה (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולהרחיב פיברובלסטים אנושיים עם תקשורת DMEM המכילה 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts צלחת אדם (איור 1) על גבי צלחת 24 גם בצפיפות המתאימה לכל גם ביום שלפני התמרה. הערה: דילולים סדרתי הבאים מומלצים (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K ו6.25K) בגלל שיש לי תאים מסוגים שונים יכולת התקשרות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים לעוד יום אחד במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור, על מנת להבטיח את התאים יש דבק באופן מלא ומורחבים. </li></ol> 2. בצע התמרה (יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של התמרה, לבדוק את צפיפות התאים ובחר בארות צפיפות היעילה ביותר (איור 2). עדיף לבחור שלוש צפיפויות שונות: (80 ~ 90%) גבוהים, (20 ~ 40%) באמצע (50 ~ 70%) ונמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה לפחות 1 לפני התמרה, לשאוב fibroblתקשורת AST מהתאים ולשנות 300 μl החדש של מדיום פיברובלסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סט אחד של 4 צינורות וירוס סנדאי שונים מ-80 ° C האחסון. להפשיר צינור אחד באותו הזמן באמבט מים C ° 37 לכמה שניות, ולאחר מכן לקחת את הצינורות החוצה מאמבט המים. אחרי זה, להפשיר אותם לטמפרטורת חדר; צינורות צנטריפוגות ב 6,000 XG במשך 10 שניות ומניחים אותם על קרח עד שימוש. אל מחדש הקפאה ולהפשיר את הווירוס מאז כותרות לא לשמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכרכים מצויינים של כל אחד מארבעת צינורות וירוס סנדאי (אוקטובר -4, KLF-4, c-Myc וסוקס-2) לצינור מיקרו צנטריפוגות. ודא כי הפתרון הוא מעורב היטב על ידי pipetting בעדינות. לדוגמא, אם 50K תאים / גם אחד lookwell צלחת 24 גם לתמרה: (כייל מבוסס על תעודת ניתוח מחיים טכנולוגיים, יכול להיות שונה מיצווה כדי תצווה) צינור hOct-4 = 6.0 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 5 μl צינור hSox-2 = 6.5 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 4.6 μ; L צינור hKlf-4 = 6.3 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 4.8 μl צינור HC-Myc = 7.8 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 3.8 μl סה&quot;כ = 18.2 μl של ארבעה גורמי וירוס תערובת / טוב אחד (50K תאים) של צלחת 24 גם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לצפיפויות תא; להוסיף 2X, 1X, ו0.5x נפח של תערובת הווירוס לתוך הבאר. נער בעדינות את הצלחת קדמית לגב, משמאל ומימין (2X: 36.4 μl של תערובת וירוס, 1X: 18.2 μl ו0.5x: 9.1 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור ודגירת הלילה. </li></ol> 3. החלפה של תרבות בינונית (יום 3 והיום 5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר התמרה, להחליף את המדיום עם 500 בינוני פיברובלסטים μl טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, לשנות בינוני עם תקשורת פיברובלסטים טרי. </li></ol> 4. להכין מנות MEF לעמית התרבות (יום 8) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תאי MEF ב60 תרבות מנות מ&quot;מ עם 10% FBS הכיל מדיום DMEM דה אחדy לפני passaging פיברובלסטים transduced על מזין תאי MEF. הערה: אנו משתמשים 5 x 10 5 של MEF בכל מנה 60 מ&quot;מ. </li></ol> 5. התחל משותף תרבות transduced תאים עם תאי מזין MEF (יום 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ציפוי תאי transduced, לשאוב 10% FBS הכיל DMEM תקשורת ממנות מזין MEF ולהוסיף טריים 10% FBS הכיל מדיום DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המדיה מfibroblasts transduced שנמצאים בצלחת 24 היטב ולשטוף תאי פעם אחת עם D-PBS. הוסף 200 μl של 0.25% טריפסין / EDTA לתוך תאי פיברובלסטים ביישום לוח 24 גם צלחת. לאחר פחות מ -5 דקות דגירה עם טריפסין / EDTA, כאשר התאים מתחילים להתנתק מהצלחת, אוסף את התאים עם מדיום גידול ב15 מיליליטר צינור חרוטי. אז צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 4 דקות. הערה: איגום 2X, 1X, ווירוס 0.5x פיברובלסטים transduced מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום supernatant ולשטוף מחדש להשעותהתא גלולה עם 4-5 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי לנטרול מטריפסין. אז צנטריפוגות ב135 XG במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים כמו צפיפות דילול סדרתי ולהתחיל לתרבות משותפת עם תקשורת פיברובלסטים על MEF: כגון 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, ו1/128 ל60 מנה מ&quot;מ. בהתאם לשיעור המוות של תאים במהלך השבוע של התמרה הראשון, אחד עשוי שלא צריך לדלל עד 1/2 או 1/128 צפיפות. לשים בצד את התאים שנותרו כדי לחלץ רנ&quot;א הכל כביקורת חיובית לtransgene RT-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 60 מנות מ&quot;מ ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך לילה. </li></ol> 6. Feed תאי גזע עוברי האנושי בינוניים ולפקח על תאים (יום 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשנות את תקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. אחרי זה, לשנות בינוני יומי עם מדיום ES אנושי: 800 מיליליטר DMEM/F12 + 200 מיליליטר החלפת נוק סרום + 10 מיליליטר של L-גלוטמין + 10 מיליליטר של 10 חומצות אמינו מ&quot;מ MEM מינימום שאינו חיוניות+ 1 מיליליטר של 2-mercaptoethanol + 10 / מיליליטר ng הבסיסי פיברובלסטים Growth Factor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם שינוי בתקשורת יומיומי עם תקשורת ES אדם טרי. אחרי שבוע, לבדוק את הכלים פעם אחת לכל 2 ~ 3 ימים תחת מיקרוסקופ להיווצרות של גושי תאים כמו מושבה-ES. בהתאם לסוג התא, התרבות תיקח יותר או פחות זמן לפני שהמושבות נמצאות. </li></ol> 7. בחירת המושרה pluripotent גזע מושבות תאים ומרחיב את התאים (יום 20 ~) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה שבועות לאחר התמרה, מושבות צריכה להיראות גדלו כראוי לקטיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני לקטוף את המושבות, להכין מזין MEF בצלחת 24 גם. הערה: אנו משתמשים 12.5 x 10 5 של MEF בצלחת אחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשנות בינוני של מנות MEF מתקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. באופן ידני לבחור מושבה אחת בכל פעם מתחת למיקרוסקופ בקטיף מכסה המנוע ולהפוך את הגושים קטנים יותר על ידי pipetting ולהעביר אותםגבי הכין חדש MEF dishes.Try לאסוף כמה שיבוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר ולהרחיב את כל טוב מצלחת 24 גם לצלחת גם 6 בתחילה. ואז מצלחת 6 היטב ל60 מ&quot;מ כלים לפני התפשטות נוספת. </li></ol> 8. אפיון iPSCs האדם (לאחר 10 מעברים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs צלחת אדם בצלחת 24 גם ותרבות במהלך 4-5 ימים עם שינוי תקשורת מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחלת assay Immunofluorescence, לשטוף את הצלחת עם D-PBS פעם אחת. ואז לתקן את התאים באופן מיידי בparaformaldehyde 0.4% למשך 30 דקות. אחרי זה לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאים קבועים עם 0.1% טריטון ב PBS פתרון X-100 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון permeablization (0.1% פתרון X-100 טריטון), ולאחר מכן להוסיף 0.5% פתרון חסימת BSA במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע זיהוי של Nanog, אוקטובר -4, SSEA (antig העוברי בשלב מסויםen) וTRA-1-81 (אנטיגן הסרטני דחייה) באמצעות נוגדן אנטי אנושי ב0.5% פתרון BSA (לבדוק את טבלת חומר לשיעור דילול נוגדנים). דגירה העיקרית נוגדן ל2 שעות בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 1 שעות של דגירה עם 488 עיזים נוגדני IgG אנטי עכבר Alexa פלואוריד כנוגדן 2 nd, אשר בדילול 1:2,000 ב0.5% פתרון BSA בטמפרטורת חדר. להכתים את כל הגרעינים של כל תאי MEF מזין וhiPSCs עם DAPI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RT-PCR של אישור transgene <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ה-mRNA הכולל מתא גלולה באמצעות ריאגנטים מיצוי RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם שעתוק לאחור על aliquots (1 מיקרוגרם) של רנ&quot;א הכל וcDNA הנגזר לPCR הגברה על ידי הפוך transcriptase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תערובות PCR להכיל 2 μl של תבנית cDNA, 10 μl של תערובת אמן 2X PCR, 2 μl של 2 pmol של פריימרים(קדימה: μl 1 הפוך: μl 1) ו -6 μl של DW. כדי לזהות את ביטוי גנים, לעשות RT-PCR עם פריימרים המופיעים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RT-PCRs עם גן GAPDH כביקורת על יעילות של תגובות ההגברה. לחזות ולנתח מוצר ה-PCR ב -1% אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors.">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon.">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA.">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation,+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures.">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .</li><li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells.">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

תכנות מחדש של תאים סומטיים אדם לhiPSCs מחזיק הבטחות חסרות תקדים בביולוגיה בסיסית, תרופות אישיות, והשתלה 12. בעבר, דורות iPSC אדם הנדרשים וירוס ה-DNA כי יש סיכון אינטגרציה לתוך הגנום המארח, אשר יכול ליצור מוטציות גנטיות לא רצויות המגבילות את יישומים קליניים נוספים כגון טיפולי פיתוח תרופות והשתלה 13. עם מסיבה זו, מחקרים רבים כבר דיווחו לייצר וקטור וiPSCs האנושי המערכת ללא transgene על ידי מספר שיטות אלטרנטיביות, אבל באותו הזמן, את היעילות של בידוד &#39;רגל הדפסה חינם&#39; צריכה להיחשב iPSCs אדם. לדוגמא, צריך להיות וירוס RNA רמה מינימאלית של סטייה גנטית בהשוואה לשיטות אחרות 14, למרות שאין פרסום לרצף הגנום כולו כדי להדגים את &#39;בטיחות גנומי &quot;של דור iPSC תיווך וירוס סנדאי עדיין. כאן, אנו מציגים שיטה ליצירה hiPSCs עםסנדאי וירוס שבו יש יעילות גבוהה תכנות מחדש בדרך יעילה וחסכונית. IPSCs האדם וכתוצאה מכך הם ללא transgene עם תחזוקה של קווי דמיון תאיים ומולקולריים לhESCs בפוטנציאל שגשוג והתפתחותי. אנחנו יכולים לתכנת מחדש את מקורותיה השונים של פיברובלסט (&gt; 4) באותו הזמן עם רק סט אחד של סנדאי וירוס. ובשיטה שלנו, אנחנו מיישמים confluences תאים שונים והבדלי מינון נגיף. זו טכניקת שילוב &#39;לערבב ולהתאים &quot;ניתן למקסם את יעילות תכנות מחדש. Fibroblasts (ממטופל אחד) בכל אחד גם יש רמת זיהום בנגיף שונה, אבל על ידי איגום יחד, האפשרות של קבלת מושבות hiPSCs יכולה להגדיל מבוססת על הניסיון שלנו. נושאים אחרים של הווריאציה המשובט בין קווי hiPSC הם קצב התפשטות, מצורף תא / הישרדות, מעמדו של איון כרומוזום X 15, בידול פוטנציאלים 16, וכו &#39;ואכן, ראיתי שכל שבט יש שונהאף אוזן גרון נטייה עצבית, שאפשר לנבא על ידי מדידת רמת הביטוי של אשכול mir-371. בנוסף יש לנו הצלחנו ביצירת iPSCs אדם מmyoblasts אדם בשיטה זו, אשר טוענת כי סנדאי וירוס יכול לשמש לסוגי תאים רבים ושונים בתהליך תכנות מחדש. יתר על כן, בשיטה שלנו, יש לנו שנוצרו hiPSCs בלמעלה מ 10 fibroblasts מחלה הקשורה שונה. בממוצע, יכולים להיות מושגת 5-10 שיבוטים hiPSC מפיברובלסטים אחד. למרות הגזירה של תאי iPS אנושיים ללא transgene עם סנדאי וירוס היא שיטת תכנות מחדש היעילה ביותר שיכולים להיות הנתיבים המעשיים ביותר, יש כמה מגבלות שיש להתחשב בפרוטוקול זה; - בהתאם לכל אצווה סנדאי וירוס, כייל הנגיף צריך להיות מחושב עבור משרד הפנים בקנה אחד (כפי שמתואר ב2.4). - אנו הבחנו הווריאציה של infectivity בין תאים סומטיים שונים, אשר גם צריכה טיטרציה נוספת לRobuזיהום ויראלי st. - תכנות מחדש בתיווך וירוס סנדאי יכול להיחשב כאחת האפשרויות הטובות ביותר למטרות מחקר. אבל לניסוי הקליני, שזה לא יכול להיות הבחירה הראשונה, שכן אין נושא רישוי עם החברה שפיתחה את מערכת וירוס סנדאי במקור. - זה לוקח בערך חודשים עד שהתאים סומטיים לתכנות מחדש חופשיים מtransgenes, וזו הסיבה שאנחנו צריכים לבדוק את ביטוי transgene לאחר לפחות 10 מעברים. - זה נראה כאילו שמספר המעבר של פיברובלסטים התרבותיים העיקריים עשויים להשפיע על היעילות של תכנות מחדש עם סנדאי וירוס, למרות שאין לנו השוואה ישירה. שיעור הריבוי גם צריך להיות נחוש. יש צורך במחקרים נוספים כדי לקבוע את ההשפעה של מספרי מעבר fibroblasts והתפשטותם על יעילות תכנות מחדש. - במחקר זה, אנו משתמשים בשכבת מזין עכבר לדור hiPSC ותחזוקה, אבל מערכת חופשית מזין יכולה להיות alternativדרך דואר במחקר עתידי. הפרוטוקול הנוכחי שלנו היה צעד חשוב לקראת לימוד hiPSCs מטופל ספציפי עבור מודלים מחלה, רפואת רגנרטיבית, ויישומים אחרים.

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת pluripotency העצמי לחדש במבחנה ויש לי, שיכול להיות שעשוי להיות שימושי עבור מודלים מחלה, להקרנת סמים, ולפתח טיפולים מבוססי תאים לטיפול בפציעות מחלות ורקמות. עם זאת, יש לי hESCs הגבלה לטיפול בתחליפי תא בגלל מחסומים חיסוניים, אונקולוגי ואתיים, וללמוד גנים הקשורים למחלות, יכול להיות מבודד hESCs ספציפי למחלה באמצעות אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) מתקרב, אבל זה עדיין מאתגר מבחינה טכנית ותרומות העובר הן די נדירות. סוגיות אלה קשורות להתקדמות בביולוגיה של תאי גזע, מה שהוביל להתפתחותם של תאים מושרה pluripotent גזע (hiPSCs). iPSCs האנושי לתכנות מחדש מבחינה גנטית מתאי סומטיים מבוגר אנושיים ונמל תכונות גזע pluripotent דמוי תא דומה לhESCs, מה שהופך אותם למקור שימושי עבור רפואת רגנרטיבית כגון דגילוי שטיח, דוגמנות מחלה וטיפול בתאים ב1,2 אופן ספציפי למטופל. עד עכשיו, יש כמה 3, מערכת אספקת חלבון 5-7 (מערכת BAC וtransfection וקטורים) שאינו וירוס בתיווך 4 transductions גן, ושיטות ליצירת iPSCs אדם, לרבות בתיווך וירוסים (רטרווירוס וadenovirus). למרות שמשלוח של גנים בתיווך וירוס יכול להבטיח רמה מסוימת של יעילות, וקטורים ויראליים יכולים להשאיר טביעת רגל גנטית, כי הם להשתלב בכרומוזומים מארח לבטא גנים תכנות מחדש באופן בלתי מבוקר. גם כאשר אינטגרציה נגיפית של גורמי שעתוק יכולה להפעיל או להשבית גנים מארח 8, זה יכול לגרום לסטייה גנטית בלתי צפויה ואת הסיכון להיווצרות גידול ב5,9. מצד השני, ההקדמה הישירה של חלבונים או RNA לתאים סומטיים דווחו, אבל יש כמה חסרונות כגון transf עתיר עבודה, חוזר ונשנהection, ורמה הנמוכה של תכנות מחדש של 7,10. וקטורי adenovirus אפילו episomal ולא שילוב, וירוס adeno הקשורים, ופלסמיד עדיין יחסית פחות יעילים 11. מסיבות אלה, סביר לבחור שיטות תכנות מחדש ללא שילוב עם יעילות גבוהה של דור iPSC ומומים גנטיים פחות. במחקר זה, אנו משתמשים בתכנות מחדש המבוסס סנדאי וירוס. שיטה זו ידועה להיות שאינה משתלב בגנום המארח ובעקביות מייצרת iPSCs האנושי ללא אינטגרציות transgene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">CytoTune-iPS Reprogramming Kit</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1378002</td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated&#160;</td>
			<td>Global stem</td>
			<td>GSC-6105M&#160;</td>
			<td>5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:195px;">&#160;invitrogen</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td>353935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Y-27632</td>
			<td style="width:195px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:119px;">1254</td>
			<td>10 uM (Stock: 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES&#160;</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>10 ng (Stock : 100 ug)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Knock-out serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)</td>
			<td style="width:195px;">&#160;invitrogen</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine-200 mM (100X), liquid</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td>21985023</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hausser Phase Contrast Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">SSEA-4</td>
			<td style="width:195px;">DSHB</td>
			<td>MC-813-70</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tra-1-81</td>
			<td style="width:195px;">cell signaling</td>
			<td>4745S</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal Oct4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5279</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Nanog</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1997</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Alexa Flouor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>948492</td>
			<td>1/2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td style="width:195px;">cellgro</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td>205313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">PCR Master Mix [2X]</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">K0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">picking hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NU-301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">dissecting scope&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation human induced pluripotent stem cells from human somatic cells with sendai-virus

לפני כמה שנים, הקמת התאים האנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) הובילה עידן חדש ביו. שימושים פוטנציאליים של iPSCs אדם כוללים פתוגנזה מודלים של מחלות גנטיות אנושיות, טיפול בתאים עצמיים לאחר תיקון הגן, והקרנת תרופה מותאמת אישית על ידי מתן מקור של תאים רלוונטיים מטופל ספציפי וסימפטום. עם זאת, ישנם מספר מכשולים להתגבר, כגון ביטול ביטוי transgene גורם תכנות מחדש שנותר לאחר ייצור iPSCs האדם. חשוב מכך, ביטוי transgene שייר בiPSCs אדם שלא עברו התמיינות יכול לעכב בידול נכון ולהטעות את הפרשנות של מחלה רלוונטית בפנוטיפים מבחנה. עם מסיבה זו, ללא אינטגרציה ו / או iPSCs אדם נטול transgene פותחו באמצעות מספר שיטות, כגון אדנווירוס, מערכת piggyBac, וקטור minicircle, וקטורי episomal, אספקת חלבון ישירה ומסונתזת ה-mRNA. עם זאת, יעילות של reprogramming תוך שימוש בשיטות ללא אינטגרציה הוא נמוך למדי ברוב המקרים. כאן, אנו מציגים שיטה לבודד iPSCs אדם באמצעות סנדאי וירוס מערכת מבוססת תכנות מחדש (וירוס RNA). שיטת תכנות מחדש זה מראה תוצאות עקביות ויעילות גבוהה באופן חסכוני.

fibroblasts הנגוע בדרך כלל לא מראה שינויים מורפולוגיים במספר ימים לאחר התמרה וירוס סנדאי, אבל חמישה ימים לאחר מכן, הם מתחילים לקבל צורות שונות (איור 1). כפי שתואר בפנל ימני של איור 1, אין לי תאים פיברובלסטים מורפולוגיה טיפוסית יותר. יש להם צורה עגולה וגדול יותר מגרעין ציטופלסמה. גם כאשר התמרה מתבצעת ב80% confluency הסלולרי, זה נראה כאילו הם פחות מחוברות בהרבה אחרי שהם מתחילים לתכנת מחדש. אם סוגים של שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים לראות ברוב טובים, fibroblasts transduced מוכן להיות מצופים במנות תרבות MEF-מזין. בפרוטוקול שלנו, אנחנו ממוזערים בקנה מידה תרבית תאים וגם נתנו אפשרויות שונות תכנות מחדש, כגון העסקת צפיפות שונה פיברובלסטים תא וכייל נגיף, וMEF כמה יחס מחדש ציפוי שלאחר מכן, אשר תגדיל את יעילות דור hiPSCs ( <sטרונג&gt; איור 2). לפני התמרה, הבארות עם confluency שונה (נמוך, בינוני וגבוה) ניתן לבחור עבור התמרה סנדאי וירוס נוספת; מיוצג כצבע אדום, ירוק, וצהוב בצלחת. בתחילת תכנות מחדש על מתקני האכלת MEF, קשה להבחין בין סוגי transduced תא, אבל אחרי יותר משבוע מהתרבות משותפת, fibroblasts לתכנות מחדש באופן חלקי מופיע ונראה כמו צורה דמוית ES משוחרר (איור 3). בגלל סיבה זו, כאשר מושבות iPSC אדם מוכנות לpassaging לתוך צלחת מזין MEF חדשה, מסיק ידני הוא דרך יעילה יותר להעברה במקום ניתוק עם אנזים. באיור 3 ואיור 4, מתחת למיקרוסקופ יש רק iPSCs אדם קצוות ברורים, אשר עושים הבחנה ברורה בין iPSCs האנושי (נחשב כ &#39;תאים לתכנות מחדש באופן מלא &quot;) ותאים לתכנות מחדש באופן חלקי&quot; על ידי מורפולוגיה. תאים לתכנות מחדש באופן מלא loבסדר כמו קומפקטי וצפוף. במיוחד יש לי מושבות גבול ברור, ואילו תאים לתכנות מחדש באופן חלקי נראים כמו איסוף יחד כדי להפוך את המושבה אבל מאוד להפסיד ושביר להישבר. גם אם אנחנו עושים pipetting בעדינות שהוא בקלות מנותק. גם לאחר נטרול מושבות לתכנות מחדש באופן חלקי iPSCs האדם (בהרחבתם וpassaging), iPSCs אדם לתכנות מחדש באופן מלא צריך להיות מתוחזק על ידי קטיף ידני. לאחר קטיף מושבות והרחבת השיבוטים hiPSC במספר שבועות, ביטוי של סמני stemness צריך להיות נחוש. לאחר ההתרחבות של שיבוטים hiPSC, אנחנו לאמת אותם עם סטים שונים של בדיקות, כוללים מכתים נוגדן (SSEA4, אוקטובר -4, TRA-81 וNanog) וRT-PCR של סמן pluripotent (הנתונים אינם מוצגים) כבקרת איכות. בהשוואה לH9, שני hiPSCs שונה הם חיובי לSSEA4, אוקטובר -4, TRA-81, וNanog. תוצאה זו מוכיחה כי iPSCs אדם הבודד שנרכש באיכות pluripotent ( <strong&gt; איור 5). לבסוף, איור 6 מראה שאנחנו לא יכולים לזהות כל ביטוי transgene בשיבוטי hiPSC על ידי RT-PCR. לפחות מעל 10 hiPSCs מעברים, פריימרים ספציפיים (טבלת 1) לאקסוגניים אוקטובר -4, סוקס-2, KLF-4 ו-c-Myc ניתן להשתמש בדגימות בקרה חיוביות עם רמת ביטוי transgene חזקה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig1.jpg" /> איור 1. שינוי מורפולוגי לאחר התמרה וירוס סנדאי. לפני התמרה, fibroblasts להראות צורה טיפוסית כמו ציר-(משמאל). כשמונה ימים לאחר התמרה, מורפולוגיה של שינוי תא transduced כמו הרבה יותר צורה עגולה (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51406/51406fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ על h</a>ere כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig2.jpg" /> איור 2. תרשים של תכנית אינדוקציה כדי להבטיח יעילות מרבית. יכולים להיות מצופה בארבעה סוגי תאים שונים בצלחת 24 גם (מ 1 עד 4). בגלל יכולת ההתקשרות שלהם והישרדות תא יכולים להיות שונות תלויים בסוגי התאים, הוא הציע לצלחת צפיפות תאים שונה (מ200K ל6.25K תאים לכל היטב). בנוסף, ריכוז נגיף יכול להיות מותאם (0.5x, 1X ו2X). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig3.jpg" /> איור 3. כינונה של מושבה תא גזע pluripotent מושרה מו transducedibroblast. כבשבועות לאחר מחדש ציפוים לMEFs, מושבות עגולות אמורות להופיע ולהיראות כמו מושבות תאי גזע עובריים אנושיות. בדרך כלל יש לי מושבות iPSC אדם לתכנות מחדש באופן מלא לגבולות מאוד ברורים. (חץ: לתכנות מחדש באופן מלא מושבות אנושיות iPSC, ראש חץ: iPSCs אדם לתכנות מחדש באופן חלקי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51406/51406fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig4.jpg" /> איור 4. הרמת מושבות תאים אנושיות מושרה pluripotent גזע. מושבות iPSC אנושיות לעתים קרובות מוקפות בתאים לתכנות מחדש באופן חלקי (משמאל). מתחת למיקרוסקופ, לקטוף את המושבה כמו-ES בלבד, מתפרק לגושים קטנים ולאחר מכן העברה (מימין). אחרי 2 ~ 3 מעברים,<html> יש מושבות שלא עברו התמיינות hiPSC (תחתונה ושמאל). (חץ: מושבות לתכנות מחדש באופן מלא אדם iPSC, ראש חץ: אדם לתכנות מחדש באופן חלקי iPSCs) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51406/51406fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig5.jpg" /> איור 5. מכתים Immunofluorescence עם סמני pluripotent בתאי גזע. Assay Immunofluorescence תערוכות iPSCs אדם יש stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, סמני pluripotent אוקטובר 4as וDAPI הוא שליטה עבור מכתים גרעין. () מייצג מכתים H9 כמו לדוגמא שליטה. (ב) ו (ג) להראות שיבוטים iPSC אנושיים.et = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig6.jpg" /> איור 6. אישור על רמת ביטוי transgene. לפחות אחרי תרבות 10-מעבר של iPSCs אדם, השתקת Sox2 אקסוגניים, KLF-4, c-Myc, ואוקטובר -4 רמות ביטוי גנים הוא אושר על ידי תגובות שרשרת פולימראז reverse transcriptase. hGAPDH היא בקרה פנימית. לביקורת חיובית, RNA מופק fibroblasts transduced שאריות (יום 7 לאחר הדבקת סנדאי וירוס). (1 ליין: דה מרקר, נתיבים 2 - 6: GAPDH, Klf4, c-myc, אוקטובר -4, וסוקס-2 בשליטה חיובית, נתיבים 7-11: GAPDH, Klf4, c-myc, אוקטובר -4, וסוקס -2 בhiPSCs). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="305" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> שם פריימר </td> &lt;td&gt; רצף </td></tr><tr><td> hOCT4 (F) </td><td> CCC GAA AGA GAA AGC GAA CCA G </td></tr><tr><td> hOCT4 (R) </td><td> AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA </td></tr><tr><td> hMYC (F) </td><td> TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G </td></tr><tr><td> hMYC (R) </td><td> TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG </td></tr><tr><td> hSOX2 (F) </td><td> ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G </td></tr><tr><td> hSOX2 (R) </td><td> ATG CGC TGG TTC ACG CCC GCG CCC AGG </td></tr><tr><td> hKLF4 (F) </td><td> ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G </td></tr><tr><td> hKLF4 (R) </td><td> GCT GCC CGC GCT GGC AGG GCT CGA C </td></tr><tr><td> hGAPDH (F) </td><td> AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG </td></tr><tr><td> hGAPDH (R) </td><td> GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT </td></tr></tbody></table> טבלת 1. פריימרים RT-PCR לאישור transgene. אלה הם רצפי פריימר המשמשים לטרהאישור nsgene. מ &#39;T הוא 50.6 ° C בכל קבוצות פריימר.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus at JoVE.com

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

efficient-generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Google

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine.  כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת. 

Video: Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (HiPSCs)  

To begin, take a flask of cultured fibroblast cells, coat a 10-centimeter cell culture plate suitable for hiPSC culture with four milliliters of cold coating solution per plate, and incubate the plate for one hour at 37 degrees Celsius. Afterward, remove the media from the fibroblasts and wash them with four milliliters of pre-warmed PBS per flask. Aspirate the PBS and associate the fibroblasts with four milliliters of Trypsin-EDTA per flask by incubating for five to seven minutes at 37 degrees Celsius.Monitor cell detachment using a phase contrast microscope, and if needed, tap against the side of the flask to detach the cells from the plastic surface. Transfer the detached cells to a 50-milliliter conical tube and wash the empty flasks with six milliliters of pre-warmed fibroblast medium. Collect and pool the remaining cells in the conical tube.Then centrifuge the cells at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Aspirate the supernatant and re-suspend the cell pellet in three milliliters of fresh, pre-warmed PBS. Count the cells, transfer 1.5 times 10 to the sixth fibroblasts into a new conical tube and fill up with PBS to the five millimeter mark.Centrifuge the tube at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, re-suspend the cell pellet in five milliliters of electroporation medium, and centrifuge again. In the meantime, aspirate the coating solution from the coated 10-centimeter cell culture plate and add seven milliliters of pre-warmed fibroblast medium.At the end of the centrifugation, discard the supernatant and re-suspend the cell pellet in electroporation medium with a concentration of 1.5 times 10 to the sixth cells in 250 microliters. Transfer the 250 microliter cell suspension to an electroporation cuvette with a four millimeter gap distance. Next, prepare a plasma transfection mix by adding four micrograms of each plasmid to a total volume of 50 microliters of electroporation medium.Transfer the transfection mix to the cuvette, mix gently by flicking, and electroporate with one pulse at 280 volts. Finally, transfer 150 microliters of the electroporated fibroblasts to the prepared 10-centimeter cell culture plate. Agitate the plate thrice in all directions to distribute the cells, and incubate overnight.Fibroblasts present in a long, spindle-like phenotype, the size of 150 to 300 nanometers. After reprogramming, colonies with 50 micrometer small hiPSCs occur displaying distinct borders. The hiPSCs are distinguished by a high nuclei to body ratio and increased proliferation rate.