אנו מודים לג&#39;ניס פישר למתן פלסמיד כטב&quot;מ-EGFP :: MSP-300 KASH. נוגדן mAB24B10 הושג ממחקרי Hybridoma הבנק התפתחותית שפותח בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה. מניית repo-GAL4 (BL7415) התקבלה ממרכז מלאי בלומינגטון באוניברסיטת אינדיאנה. תמיכה מהאגודה האמריקנית לסרטן המוסדי מענק המחקר (IRG # 58-006-53) למרכז אוניברסיטת פרדו לחקר הסרטן היא הודה בהכרת תודה. Jingqun מא נתמך על ידי מחקר חקלאי בבית הפרד assistantship במזון וחקלאות מאוניברסיטת פרדו.

1. דור ואפיון של EGFP :: KASH דרוזופילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהג הצלב Gal4 טס לכטב&quot;מ-EGFP :: MSP-300 KASH זבובים. לחלופין, זבובי רקומביננטי שנושאים גם את נהג Gal4 וtransgene כטב&quot;מ-EGFP :: MSP-300 KASH יכולים להיות שנוצרו תוך שימוש בטכניקות גנטיות סטנדרטיות. גישה שנייה זה יתרון אם מספרים גדולים של צאצאים נדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין ביטוי של סמן EGFP :: KASH תוך שימוש בטכניקות במיקרוסקופ רגיל. הערה: ביטוי EGFP ניתן לצפות על ידי טכניקות מיקרוסקופ רגילות ברקמות דרוזופילה גזורים, קבועים, או בכל זחלים, ואינו דורש שימוש בנוגדן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את דפוס הביטוי של EGFP :: סמן KASH בהאורגניזם כולו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח (ראה PDF חומרים). הערה: נהגי Gal4 רבים, כולל נהג repo-GAL4 מוצג באיור 1, n התערוכהדפוסי onspecific ביטוי ברקמות זחל אחרים כגון בלוטת הרוק (ראו תוצאות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את דפוס ביטוי EGFP :: KASH ברקמה גזור של עניין באמצעות מיקרוסקופיה confocal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את הרקמות של עניין באמצעות פורמלדהיד בריכוז סופי של 4%, וה-DNA כתם באמצעות DAPI בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר כדי להמחיש את הלוקליזציה של EGFP :: KASH תג ביחס ל-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות או באמצעות אובייקטיבי 40X / 1.30 שמן טבילה או אובייקטיבי 20X / 0.75 טבילת שמן, תלוי בגודל של הרקמה של עניין. תנאי עירור / הפליטה הבאה יכולים לשמש לרכישת תמונה: 408 nm/425-475 ננומטר (DAPI); 488 ננומטר / 525-550 ננומטר (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. לבודד את הגרעינים מרקמות הזחל דרוזופילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הציוד לנתיחת רקמות הזחל ובידוד גרעינים שלאחר מכן. שים לב כיעובר Dechorionated השלם יכול לשמש גם כחומר מוצא אם תרצה בכך. מומלץ להשתמש ברקמות זחל גזורים באופן חלקי ולא כל זחלים אם סוג התא של עניין נמצא ברקמות ספציפיות, כגון דיסק דמותי. הפעולה זו מפחיתה ספציפי מחייב, וגם מבטלת בעיות שיכולים להיגרם על ידי ביטוי של כמה נהגי Gal4 בתאי nontarget. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני זוגות מלקחיים חדים (ראה חומרים PDF), צלחת זכוכית אחד siliconized 9 היטב (ראה חומרים PDF), וPBT (1x PBS, pH 7.4; 20-Tween 0.1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prebind נוגדן ה-GFP לחרוזים המגנטיים. יש להתחיל את הצעד הזה לפני תחילת הניתוח. הוסף 10 μl של חרוזים המגנטיים (Invitrogen, ראה חומרים PDF) ו -2 מיקרוגרם של נוגדן ה-GFP (רוש, ראה חומרים PDF) ל400 μl של חיץ לשטוף (1x PBS, pH 7.4; 2.5 מ&quot;מ MgCl 2) בצינור 1.5 מיליליטר . כמות חרוזים ונוגדנים המשמשים יכולה להיות מותאמת במידת צורך על בסיס הסכום של היעד בסאםple והזיקה המחייבת של הנוגדן לחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים ונוגדנים עם סיבוב לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים ונוגדנים במעמד המגנטי (ראה חומרים PDF) ולאפשר חרוזים להיקשר המגנטי למשך כ 1-2 דקות. הסר את supernatant המכיל את הנוגדנים מאוגדים ולשטוף חיץ באמצעות פיפטה 1 מיליליטר. חרוזים יישארו מחויבים לקיר של צינור 1.5 מיליליטר בצד הסמוך למגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מיליליטר של הצפה לשטוף בכל פעם כאמורה בסעיף 2.1.4. הסר את צינור 1.5 מיליליטר מהמדף המגנטי ולהפוך לרגע כדי לערבב את חרוזים ולשטוף חיץ במהלך כל שלב לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את חרוזים הנכנס נוגדנים בחיץ לשטוף עד מוכן להמשיך עם צעד 2.7. לא צריכים להיות מותר חרוזים להתייבש בכל שלב של הפרוטוקול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רקמות זחל בPBT ולהעביר את רקמות גזורים לגם של המנה 9 היטב אחד. בדרך כלל, דיסקציה של האונה אופטית ודיסק דמותי עין מ100 זחלי instar שלישיים מספקת מספיק חומר לניתוח ביטוי גנים במורד הזרם הבא בידוד גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרקמות המבודדות במיצוי מאגר גרעיני (10 HEPES מ&quot;מ-KOH, pH 7.5; 2.5 מ&quot;מ MgCl 2; 10 מ&quot;מ KCl) בצינור 1.5 מיליליטר. העבר את רקמות זחל בודדות למיליליטר Dounce Homogenizer 1 (ראה חומרים PDF) על קרח המכיל 1 מיליליטר של מיצוי מאגר גרעיני טרי. לדגור על קרח למשך 5 דקות. אין צורך להוסיף מעכבי פרוטאז אם RNA הוא להיעקר הבא בידוד גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את הרקמה על ידי 20 משיכות עם העלי הרופף ולאחר מכן דגירה מדגם על קרח דק 10 לאפשר לתאים להתנפח. חלץ את הגרעינים מהתאים באמצעות 15 משיכות עם העלי ההדוק. מספר משיכות עם העלי הרופף והדוק צריך להיות מותאם לרקמות שונות וסוגי תאים; המגון עודף יכול לגרוםטעון גרעינים, בעוד המגון מספיק לא לחלץ את כל הגרעינים מהרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את homogenate, אשר מכיל את הגרעינים ופסולת הסלולר, דרך מסננת נקבובית בגודל 40 מיקרומטר (ראה חומרים PDF) שכבר prerinsed עם חיץ המגון גרעיני. לאסוף את homogenate המסונן בצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות טרום בידוד לניתוח שלאחר מכן כדי לקבוע תשואת גרעינים, שלמות גרעינים, וכדי לקבוע את רמות תעתיק של גנים המטרה לפני גרעיני בידוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 50 μl של homogenate המסונן לצינור 1.5 מיליליטר טרי באמצעות פיפטה. זה הוא המדגם טרום הבידוד. הוסף 500 μl של מגיב Trizol (ראה PDF חומרים, זהירות), להפוך לערבב, ולאחסן ב -20 ° C לבידוד לאחר RNA (שלב 3.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 μl של homogenate המסונן לצינור מיליליטר טרי 1.5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף DAPI לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר, וincמדגם ubate על קרח דק 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הגרעינים צבעוניים DAPI לcoverslip המצופה פולי-ליזין, ומניח בשקופית מיקרוסקופ. לאטום את coverslip באמצעות לק השקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות הגרעינים, ונוכחותם של גרעיני GFP-tagged של עניין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: אין צורך לתקן את הגרעינים, או כתם של ה-GFP אם שקופיות אלה מנותחות במהירות סבירה לאחר הכנה (בתוך 24 hr). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 10 μl של homogenate המסונן לצינור מיליליטר טרי 1.5 ולהוסיף 90 μl של חיץ לשטוף (1x PBS, pH 7.4; 2.5 מ&quot;מ MgCl 2). להוסיף DAPI לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר, ולדגור על קרח למשך 10 דקות. לקבוע את תשואת הגרעינים במדגם טרום הבידוד באמצעות hemocytometer לספור את גרעיני DAPI החיובי באמצעות epifluorescence תחת מטרת מיזוג 10X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים בכריכת הנוגדנים (שהוכנו בסעיף 2.1.6) במעמד מגנטי,ולאפשר את חרוזים המגנטיים להיקשר לאבן שואבת עבור לפחות 2 דקות כפי שתוארו בסעיף 2.1.4. הסר את החיץ לשטוף מהחרוזים הנכנס נוגדנים באמצעות פיפטה 1 מיליליטר, ולהוסיף את homogenate המסונן משלב 2.5 לצינור 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים על מנת לערבב, ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם תסיסה קצה על הקצה. למנוע בועות בצינור במידת האפשר שכן אלו יכולים לגרום להתקבצות של הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים בכריכת הנוגדנים וhomogenate במעמד מגנטי, ולאפשר את חרוזים המגנטיים להיקשר לאבן שואבת עבור לפחות 2 דקות כפי שתוארו בסעיף 2.1.4. הסר את homogenate המכיל שבריר הגרעינים מאוגד באמצעות פיפטה 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם 3x עם 1 מיליליטר של הצפה לשטוף בכל פעם. הסר את צינור 1.5 מיליליטר המכיל חרוזים, גרעינים ולשטוף חיץ מהמדף ולהפוך לערבב כמה פעמים, ואז למקם את הצינור במעמד המגנטי כמתוארבשלב 2.9 ולהסיר את supernatant באמצעות פיפטה 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של חיץ לשטוף את החרוזים, אשר אמור להיות מחויב לגרעיני היעד. זה הוא המדגם שלאחר הבידוד. הכן את הדגימות לבדיקה מיקרוסקופית ומיצוי RNA שלאחר מכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20 μl של מדגם הודעה הבידוד לצינור 1.5 מיליליטר טרי וכתם עם DAPI ולנתח כאמור בסעיף 2.6.2. לספור את ה-GFP / + + DAPI וGFP-/DAPI + גרעינים שנתפסו על ידי חרוזים מגנטיים כדי לקבוע את הטוהר של ה-GFP המועשר + גרעינים במדגם שלאחר הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מגיב Trizol לשאר מדגם הודעה הבידוד, להפוך לערבב, ולאחסן ב -20 ° C לבידוד לאחר RNA (שלב 3.1). הערה: דוגמאות בTrizol יכולות להיות מאוחסנות במשך כמה שבועות אם יש צורך ב -20 ° C. אין זה הכרחי כדי elute הגרעינים מהחרוזים המגנטיים לפני מיצוי RNA באמצעות מגיב Trizol, becausדואר חרוזים לא להפריע לבידוד RNA שלאחר מכן. </li></ol></li></ol> 3. לקבוע רמות תמליל בגרעינים מבודדות מרקמות הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA מהדגימות טרום בידוד ולאחר בידוד הכנה בסעיפים 2.6.1 ו2.11.2 באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי תאר להפקת RNA מבוססת Trizol (ראה חומרים PDF) בשינויים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות משקעים של גלולה RNA, להוסיף 19.2 μl מים RNase חינם ו0.8 μl של מגיב RNASecure (ראה חומרים PDF) לגלולה ולדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית RNases. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז RNA עם פלורסנט לצבוע-RNA מחייב, דוגמת ערכת assay RNA קיוביט (ראה חומרים PDF) באמצעות fluorometer QubitR 2.0 הבאות הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז cDNA באמצעות טרנסקריפטאז הפוך הגברה כגון EpiScrIPT הפוך ערכת טרנסקריפטאז ופריימרים oligodT הבאה הוראות היצרן. הערה: בדרך כלל, 50-100 ng של RNA יוצר cDNA מספיק כדי לבצע ביטוי גנים מרובה מנתח. יש להשתמש בכמויות שווה ערך של טרום בידוד ו-RNA הודעה הבידוד לייצר cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 180 μl מים nuclease ללא מדגם cDNA 20 μl לדלל את הניתוח הזה פי 10 לפני זמן אמת PCR כמוני (qPCR). דילול זה הוא צעד חשוב, כי דגימות cDNA חי יכולות לעכב את qPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת אב qPCR עם פולימראז וdNTPs, 4 pmoles כל אחד מקדימה לאחור תחל, מורכב עם מים סטריליים לסופית עוצמת התגובה של 20 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנן פריימרים qPCR למקד גנים אשר צפוי לבוא לידי ביטוי בסוג התא של עניין, ובשלב ההתפתחותי שבו הרקמה שנאסף. פריימרים עיצוב תוחלת אינטרון אם אפשר, כך שגנומיניתן להבחין בין מוצרי cDNA-PCR. הערה: אם פרופיל ביטוי גנים מסוג תא היעד אינו ידוע, פריימרים נגד eGFP, שצריך לבוא לידי ביטוי באופן ספציפי באוכלוסיית הגרעינים מתויגת, ניתן להשתמש בם כדי לייעל את הפרוטוקול לסוג תא מסוים ורקמות (טבלה 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את רמות התמליל היחסית של כל גן של עניין בדגימות טרום בידוד והודעת בידוד בהשוואה לסדרת דילול של cDNA שהוכנה מכל הרקמה. רמות התעתיק של גנים המטרה צריכה להיות מנורמלות לגן התייחסות כגון Rpl32 (או רצוי כמה גנים התייחסות). </li></ol>

<ol>
	<li>Weake, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcription+initiation+function+of+the+ubiquitous+SAGA+complex+in+tissue-specific+gene+activation.">Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation.</a> Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).</li><li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+chromatin+immunoprecipitation+from+multicellular+complex+samples+using+BiTS-ChIP.">Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP.</a> Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).</li><li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3'-end-seq.">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).</li><li>Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+contributions+of+the+nuclear+and+cytoplasmic+compartments+to+global+gene+expression+in+human+cells.">Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells.</a> BMC Genom. 8, 340 (2007).</li><li>Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+characterization+of+cell-specific+gene+expression+through+fluorescence-activated+sorting+of+nuclei.">Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei.</a> Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue.">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genom. Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Curr Biol. 21, 414-415 (2011).</li><li>Fischer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klarsicht+has+distinct+subcellular+localization+domains+for+nuclear+envelope+and+microtubule+localization+in+the+eye.">Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye.</a> Genetics. 168, 1385-1393 (2004).</li><li>Patterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+Klarsicht+and+nuclear+lamin+in+developmentally+regulated+nuclear+migrations+of+photoreceptor+cells+in+the+Drosophila+eye.">The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KASH+domain+protein+MSP-300+plays+an+essential+role+in+nuclear+anchoring+during+Drosophila+oogenesis.">The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klaroid+encodes+a+SUN+domain+protein+required+for+Klarsicht+localization+to+the+nuclear+envelope+and+nuclear+migration+in+the+eye.">Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye.</a> Fly. 1, 75-85 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד או מאוד להעשיר במיוחד גרעינים מתויגים מאוכלוסיות תאים מעורבות בעוברי דרוזופילה או רקמות זחל. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד מרקמות גזורים גרעינים בכ 1 שעות. טוהר והתשואה של הגרעינים המבודדים חייבים להיקבע באופן ניסיוני לכל סוג ת...

רקמות דרוזופילה כגון מערכת העצבים המרכזית מכילות תערובת מורכבת של סוגי תאים. לכן, כדי לנתח את פרופילי ביטוי גני תא ספציפי מרקמות דרוזופילה, יש צורך קודם כל לבודד אוכלוסייה הומוגנית של תאים ספציפיים בכמויות מספיקות כדי לאפשר ליישומים במורד הזרם. שיטות לבודד תאים מרקמות שלמות כוללות microdissection לייזר, ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) של כל תאים. בעוד FACS נעשה שימוש כדי לבודד את התאים וגרעינים מעוברי דרוזופילה ומelegans Caenorhabditis לביטוי גנים והכרומטין פרופיל 1-3, FACS וmicrodissection הלייזר יכולים להיות קשים לביצוע בהצלחה ברקמות המכילות סוגים מעורבבים מאוד תא או תאים מכילים שעם מורפולוגיה לא סדירה, כגון תאי עצב. כדי להתגבר על הקושי הזה, יכול להיות מבודדים מסוגי תאים ספציפיים גרעינים ולא תאים ומשמשים לדור הבאביטוי פרופיל דואר. חשוב לציין, ניתוח ביטוי mRNA microarray המבוסס באמצעות דגימות RNA גרעיניות מראה תוצאות בדרך כלל דומות לזו שבוצעה באמצעות RNA הכולל 4, 5. יתר על כן, ניתוח ביטוי גנים באמצעות RNA הגרעיני שמש בהצלחה ללמוד ביטוי גנים באורגניזמים רבים, כולל ג elegans, thaliana ארבידופסיס, דרוזופילה, ובני אדם 4, 5 2, 3. לאחרונה כמה גישות תוארו לבידוד של אוכלוסיות ספציפיות של גרעינים שכותרתו מרקמות דרוזופילה המתאימים לניתוח ביטוי גנים ו / או immunoprecipitation הכרומטין. הבידוד אצווה של הכרומטין רקמות ספציפיות לשיטת immunoprecipitation (סיביות שבב) מנצל FACS לבודד את גרעינים קבועים על הבסיס של ביטוי תאים מסוג מסוים של ה-GFP-לוקליזציה הגרעינית 2. גישה זו כבר successfully משמש כדי לנתח את התפלגות שינויי היסטון וגורמי שעתוק באמצעות immunoprecipitation הכרומטין של גרעינים מבודדים מהמזודרם בעוברי דרוזופילה 2. עם זאת, גישות מבוססות FACS עשויות להיות פחות מתאימות לבידוד גרעינים שכותרתו, המהווים רק חלק קטן מאוכלוסייה מעורבת בשל זמן מין המוגבר הדרוש כדי להשיג מספרים מתאימים ליישומים במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה קבוצות יש שימוש בטכניקות בידוד מבוסס זיקה לטהר גרעינים שמסומנים עם epitope ספציפי בסוג תא מסוים. לאחרונה הבידוד של גרעינים מתויגים בסוגי תאים מסוימים בשיטה (שלמה) שפותחו לשימוש בthaliana ארבידופסיס 6, 7 הותאם לשימוש בדרוזופילה 8. בשיטה זו, חלבון היתוך מעטפת גרעין שהוא מצע לin vivo biotinylation הוא coexpresSED עם האנזים ביוטין החיידקים Escherichia בירה בסוגי תאים ספציפיים. גרעינים שכותרתו ביוטין יכולים להיות מטוהרים לאחר מכן מאוכלוסיות מעורבות באמצעות בידוד זיקה מבוסס streptavidin. שימוש בגישה זו, גרעינים תויגו בהצלחה ומבודדת מהמזודרם בעוברי דרוזופילה בי חלבון היתוך מעטפת הגרעין באו לידי ביטוי בשליטה של משפר המזודרם ספציפי 8. המחברים גם נוצרו חלבוני איחוי מעטפת גרעין שיכול לבוא לידי ביטוי בכל סוג תא שבשליטתו של רצף הרגולציה Gal4, 9 כטב&quot;מ. גישה זו היא מסוגלת במהירות בידוד תת קבוצות של גרעינים שכותרתו מאוכלוסיות מעורבות, אבל דורשת שלושה מבנים מהונדסים נפרדים ולכן עשוי להיות מתאים ליישומים גנטיים מסוימים. לאחרונה, גישה שתוארה שביום ראשון (S AD1 והאו&quot;ם C-84) המכיל חלבונים תחום זה בתרגום להממברנה הפנימית של מעטפת הגרעין תויגו עםחלבוני ניאון והביע תחת שליטה של מערכת Gal4/UAS 10. גרעינים היו מבודדים בנוכחות של חומר ניקוי nonionic להסיר את הקרום החיצוני של מעטפת הגרעין, וזיקה מטוהרת באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים נוגדנים אנטי-GFP. גישה זו משמשת בהצלחה לבודד אוכלוסיות קטנות של גרעינים שכותרתו מתת עצביים ספציפיים במוח הבוגר בדרוזופילה 10. כאן, פרוטוקול לבידוד של גרעינים שכותרתו מאוכלוסייה מעורבת של תאים מרקמות זחל דרוזופילה מתואר. שיטה זו פותחה באופן עצמאי, אך דומה לגישה שתוארה על ידי הנרי ואח&#39;. 10 ראשית, גרעינים תויגו עם תג הניאון שבא לידי ביטוי רק בסוגי תאים מסוימים בדרוזופילה melanogaster כדי להקל על הבידוד הבא של גרעינים מתויגים מאוכלוסיות מעורבות באמצעות גישה המבוססת על זיקה. כדי לתייג את הגרעינים,תחום KASH (larsicht K / omology שעות yne NC-1 / S) נוצל. תחום KASH הוא תחום הטרנסממברני שמתאים להממברנה החיצונית של מעטפת הגרעין, בחלקו דרך אינטראקציות עם חלבונים המכיל תחום SUN בתוך המרחב perinuclear 11. תחום KASH טרמינל C-של חלבונים כגון דרוזופילה MSP-300 וKlarsicht מעגן את החלבונים האלה קרום הגרעין החיצוני, בעוד תחומים N-מסוף שלהם אינטראקציה עם חלבוני שלד תא, כגון אקטין או microtubules ב12-14 ציטופלסמה. בונה נוצרה בי תחום KASH של דרוזופילה MSP-300 היה התמזגו לC-הסופית של EGFP, תחת שליטה של רצף Gal4 רגולציה, כטב&quot;מ בוקטור pUAST-attB 15, 16. באמצעות אינטגרציה באתר ספציפי phiC31, זבובים מהונדסים נוצרו בי כטב&quot;מ-EGFP :: transgene MSP-300 KASH הוכנס בלוקוסי attP2 על כרומוזום3L 17. כטב&quot;מ-EGFP :: MSP-300 KASH זבובים ניתן חצו עם זבובים המבטאים את נהג Gal4 בסוג תא מסוים, וכתוצאה מכך הביטוי הממוקד של EGFP בקרום הגרעין החיצוני בסוג התא של עניין. אז יכולים להיות מטוהרים גרעינים שכותרתו מאוכלוסיות תאים מעורבים באמצעות נוגדנים נגד ה-GFP מצמידים את החרוזים מגנטיים. בגישה זו, השימוש בחומרי ניקוי nonionic לא נדרש כי תג EGFP הוא מקומי לצד cytoplasmic של קרום הגרעין החיצוני, ולכן נגיש לנוגדנים. הפרוטוקול המתואר להלן יכול לשמש כדי לבודד / להעשיר את הגרעינים שכותרתו EGFP מסוגי תאים ספציפיים ברקמות זחל דרוזופילה, לכמת את טוהר ואת התשואה של גרעינים מבודדים, וכדי לחלץ RNA הגרעיני מתאים לתגובת שרשרת כמותיים הפוך שעתוק פולימרז (qRT -PCR) ניתוח ביטוי גנים. הבידוד וזיקה לטיהור של גרעינים (לא כולל Tissuנתיחת דואר) יכולה להתבצע בפחות משעה. תוצאות מוצגות מראים כי גרעיני גליה ניתן לבודד בהצלחה מהאונה אופטי זחל ודיסק דמותי בעיניים, ומשמשים לניתוח ביטוי גנים שלאחר מכן. זה צפוי כי גישה זו תהיה שימושית עבור הבידוד / ההעשרה של גרעינים שכותרתו מרקמות עוברי וזחל שבו תאי היעד מהווים פחות מ -5% מכלל האוכלוסייה. כל מניות דרוזופילה ופלסמידים שנוצרו במחקר זה הם זמינים מהמחברים על פי דרישה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1884">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

רקמות עוברי וזחל melanogaster דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית מאוד של סוגי תאים, אשר יכול לסבך את הניתוח של ביטוי גנים ברקמות אלה. לכן, כדי לנתח את פרופילי ביטוי גני תא ספציפי מרקמות דרוזופילה, ייתכן שיהיה צורך לבודד את סוגי תאים ספציפיים עם טוהר גבוה ובתשואות מספיק עבור יישומים במורד כגון פרופיל תעתיק וimmunoprecipitation הכרומטין. עם זאת, המורפולוגיה בלתי סדירה הסלולרית ברקמות כגון מערכת העצבים המרכזית, בשילוב עם האוכלוסייה נדירה של סוגי תאים ספציפיים ברקמות אלה, יכול להוות אתגר לשיטות מסורתיות של בידוד תא כגון microdissection לייזר ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) . כאן, גישה חלופית לאפיון פרופילי ביטוי גני תא ספציפי באמצעות בידוד המבוסס על זיקה של גרעינים מתויגים, ולא תאים שלמים, הוא תאר. גרעינים בג הספציפיסוג ell עניין מסומנים גנטי עם תג EGFP גרעיני מקומי מעטפה באמצעות מערכת הביטוי בינארי Gal4/UAS. יכולים להיות מבודדים גרעינים מתויג EGFP אלה באמצעות נוגדנים נגד ה-GFP שהם מצמידים את חרוזים מגנטיים. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשר בידוד של גרעינים עולה בקנה אחד מסוגי תאים מסוימים במערכת העצבים המרכזית דרוזופילה הזחל בטוהר גבוה וברמות מספיקות לניתוח ביטוי, גם כאשר אלו סוגי תאים מהווים פחות מ -2% מכלל האוכלוסייה בתא רקמות. גישה זו יכולה לשמש כדי לבודד גרעינים ממגוון רחב של דרוזופילה עוברית וסוגי תאי זחל באמצעות Gal4 נהגים ספציפיים, ועשויה להיות שימושי עבור בידוד גרעינים מסוגי תאים שאינם מתאימים לFACS או microdissection לייזר.

נהג repo-GAL4 (מספר המניות בלומינגטון 7415) בא לידי ביטוי במיוחד בתאי גליה במערכת העצבים דרוזופילה בשלבים שונים של פיתוח 18. זבובים שנוצרו ביציבות להביע כטב&quot;מ-EGFP :: MSP-300 KASH תחת שליטה של נהג repo-GAL4 תוך שימוש בטכניקות גנטיות סטנדרטיות. כדי לאפיין...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis at JoVE.com

בידוד מבוסס זיקה של גרעינים מתויגים מרקמות תסיסנית לניתוח ביטוי גנים | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

affinity-based-isolation-tagged-nuclei-from-drosophila-tissues-for

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Genetics

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

14.6K Views.  Purdue University.  רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומ...

Video: Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.