החוקרים מעריכים את העצה ותמיכה טכנית מסופק על ידי ד&quot;ר ריצ&#39;רד Konz והצוות במתקן cytometry זרימה Core באוניברסיטת הספר לרפואה של מסצ&#39;וסטס. משאבים Core נתמך על ידי לאנדוקרינולוגיה וסוכרת במרכז המחקר גרנט DK032520 שימשו גם. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש (NIMH), המכון הלאומי לשימוש בסמים (NIDA) לבין המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם.

הפקת גרעינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימי 250 מ&quot;ג שלאחר המוות של רקמת המוח הקפוא הצפת 5 מ&quot;ל תמוגה 1 ב douncer ולמקם אותו על הקרח. כדי לקבל כ -5 מיליון גרעינים לאחר FACS מיון, אנחנו בדרך כלל להשתמש 1000 מ&quot;ג של רקמת לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רקמה יש להפשיר, dounce הרקמה למשך דקה 1 בעוד על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את רקמת הומוגני ומקום אותו לתוך צינור 15 ultracentrifuge ברור מ&quot;ל. שים את הצינור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 9 מ&quot;ל של פתרון סוכרוז 2 עם טפטפת, לשים את פיפטה בתחתית הצינור ultracentrifuge ברורה, לשחרר את הפתרון סוכרוז 2 כדי ליצור שיפוע הריכוז עם פתרון הומוגני רקמה על גבי הפתרון סוכרוז 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הצינורות ultracentrifuge כדי לוודא שהם יהיו כולם מאוזנת תוך סיבוב בתוך ultracentrifuge. בצע את כל השינויים המשקל על ידי הוספת מאגר תמוגה 1 עד השכבה העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צינורות נשקלנו, למקם אותם לסלים של הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את כל הדליים לתוך הרוטור SW28 בזהירות במקום הרוטור לתוך ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge דגימות RCF 107163.6 במשך 2.5 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה תושלם, להסיר את supernatant, יחד עם שכבה של פסולת למצוא שיפוע הריכוז, עם השימוש בחלל ריק, תוך הקפדה לא להפריע גלולה המכילה את הגרעינים בתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של 1X PBS לכל גלולה ולתת לשבת על קרח במשך 20 דקות. זה מאפשר גלולה כדי לפזר קצת על עצמו, מה שמקל מאוחר יותר מכנית לפזר אותו על ידי pipetting למעלה ולמטה, אשר מפחית את כמות הלחץ ניסיון גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גרעינים יש מודגרות על קרח במשך 20 דקות, מכנית פיפטה מעלה ומטה כדי לפזר את הגרעינים לחלוטין בתוך 1XPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון הגרעינים המכילים מן הצינורות ultracentrifuge לשלב את התוכן של שני צינורות לתוך צינור microcentrifuge יחיד 2 מ&quot;ל. שוב, במקום על דגימות קרח. </li></ol> Immunostaining עבור FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, לעשות immunostaining תערובת מורכבת של הנוגדן הראשוני והמשני, ועל חסימת מערבבים. עבור כל דגימה, לשלב 300 μL של 1XPBS המכיל 1.2 μL של נוגדן NeuN, 100 μL של חסימת מערבבים, אשר מכיל BSA 0.5% ו -10% סרום עיזים רגילה 1XPBS, ו 1 μL של אלקסה פלואוריד 488. עבור דגימות שליטה, להוציא את NeuN נוגדן ראשוני, ובמקום זאת, רק להוסיף 1XPBS יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס את התערובת immunostaining ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הוא מכתים את התערובת דוגרים, להפוך את הפקדים עבור הדגימות. עבור FACS מיון, מדגם, המכיל גרעינים בלבד, שנקרא &quot;שליטה בלא כתם&quot; נדרשת; מדגם השני, שליטה שלילית, המכיל את הגרעינים עם נוגדן המשני אלקסה פלואוריד 488 ללא NeuN נוגדן ראשוני יש צורך גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 Aliquot μL של גרעינים המכיל פתרון לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל המכיל 1XPBS לשליטה בלא כתם, ועוד 20 μL לתוך צינור 2 נוסף המכיל 980 מ&quot;ל של UL 1XPBS לבקרה שלילית. להעלות את עוצמת הקול של הגרעינים המכילים מדגם לגבות מ&quot;ל 1 עם 1XPBS. כל הדגימות מוצבות שוב על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו את התערובת immunostaining סיימה דוגרים, להוסיף את תוכנו של μL 401 לתוך דגימות המתאים. המדגם גרעינים יקבל את תערובת המכילה שני NeuN ו אלקסה פלואוריד 488, בעוד מדגם שלילי יקבל את תערובת המכילה רק את הנוגדן משני אלקסה פלואוריד 488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את דגימות לחדר קר לסובב בחושך במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות יש מודגרות בחושך במשך 45 דקות, לשים אותם על הקרח ולהביא אותם למתקן FACS. במהלך התחבורה למתקן FACS, הדגימות יש לשמור על קרח בחושך. </li></ol> FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במתקן FACS, לסנן את הדגימות באמצעות מסנן 40 אממ. לאחר מכן, ולהפעיל אותם דרך המכשיר לכמה דקות, תוך שמר קר, כדי לקבל כמה נתונים ראשוניים לפני המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, יש צורך להגדיר את השערים המתאימים הנדרשים למיון. שערים שונים משמשים מעין דגימות. השער הראשון נותן מושג על גודל הגרעינים השונים נמצא בתוך המדגם, ומאפשר separatation של פסולת גרעינים בפועל. השער השני מאפשר לנו למיין גרעינים בנפרד. בטל אגרגטים כל מבוטלים בשלב זה. לבסוף, השער השלישי מוגדר הקרינה באורך גל מסוים, תואם לזה של fluorochrome נמצאו נוגדנים משני שלנו. הצבת שער זה מאפשר לנו למיין + NeuN נפרד, ומכאן גרעינים העצבית מ NeuN - גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל השערים הם בחרו, הגרעינים ניתן למיין לתוך 1XPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחרמדגם שלם עבר, לבדוק את טוהר הסוג על ידי הפעלת aliquot המדגם מיון דרך המכשיר. ודא כי הקרינה של מדגם לא פרוש, אלא נכלל בתוך רביע אחד. עדיף לבחור דגימות אשר מעל 90% טהור. </li></ol> לאחר FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם כבר מיון, עיבוד של הגרעינים יכולה להתחיל. קח 10 מ&quot;ל של המדגם מיון ולהוסיף לו 2 מ&quot;ל של פתרון סוכרוז 2, 50 UL של 1M CaCl 2 ו - ul של 1m 30 מ&quot;ג (אייס) 2. כתזכורת, תמיד הקפד לשמור את הדגימה על הקרח מאז הגרעינים הם מבולבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש פחות מ 10 מ&quot;ל של המדגם מיון, להעלות את נפח של עד 10 מ&quot;ל ידי הוספת 1XPBS, או להתאים את חומרים נוספים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא מרחב המדגם מספר פעמים ומניחים על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות יש מודגרות על קרח במשך 15 דקות, צנטריפוגה אותם הרוטור דלי הנדנדה ב RCF 1786 למשך 15 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant עם השימוש בחלל ריק, מבלי להפריע לבן גלולה נמצא בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את גלולה ב 200 μl של מה הפתרון שאתה צריך עבור הניסויים בהליך, ועל פיפטה למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון לתוך צינור קטנים ומניחים אותו בתוך המקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

הפרוטוקול המובא כאן צריך להיות שימושי במיוחד עבור מחקרים התמקדו בשינויים epigenetic של הכרומטין העצבית, ובאופן כללי יותר, על הפנוטיפ המולקולרי של גרעין עצבי, במהלך מחלה נוירולוגית או פסיכיאטרית נורמלי בפיתוח הזדקנות, או. השיטה היא יתרון מסוים כאשר ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח, כו?...

ריאגנטים: <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th colspan="3" align="left"> 1. תמוגה הצפת </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> סוכרוז </td><td> 5.47 גר &#39; </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 μl </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ </td><td> Mg (Acetate) 2 </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td> 0.1 מ&quot;מ </td><td> EDTA </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 10mm </td><td> טריס-HCl, pH8 </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 μl </td></tr><tr><td> 0.1% </td><td> טריטון X-100 </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> התאם את נפח 50 מ&quot;ל מים Autoclaved </td></tr></table><table style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th colspan="3" align="left"> 2. סוכרוז פתרון </th></tr><tr><td> 1.8 מ &#39; </td><td> סוכרוז </td><td> 30.78 גרם </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ </td><td> Mg (Acetate) 2 </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 μl </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> טריס-HCl, pH8 </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> התאם את נפח 50 מ&quot;ל מים Autoclaved </td></tr></table><table style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce חיץ </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> טריס </td><td> 0.242 גרם </td></tr><tr><td> 4 מ&quot;מ </td><td> MgCl 2 </td><td> 0.163 גרם </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0.03 גר &#39; </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> התאם ל-pH 7.5 ו נפח 200 מ&quot;ל מים Autoclaved </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

נוירונים במוח האנושי להיות postmitotic בעיקר במהלך התפתחות טרום לידתי, ובכך לשמור על גרעינים תוחלת החיים שלהם לאורך מלא. עם זאת, מעט מאוד ידוע על שינויים עצביים הכרומטין והארגון גרעיני במהלך התפתחות והזדקנות, או מחלה כרונית נוירופסיכיאטריות. עם זאת, עד כה מבחני מבוסס הכרומטין ביותר ו-DNA (למעט דגים) ברזולוציה יחיד חוסר התא. לשם כך, את ההטרוגניות הסלולר ניכר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית, שכן בדרך כלל subpopulations שונים של נוירונים הם התערבבו עם סוגים שונים של גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אחד הפתרונות האפשריים יהיה לגדל תאים מסוג בתרבויות מסוימות, אבל רוב התאים במערכת העצבים המרכזית, כולל נוירונים, הם vivo לשעבר קיימא, במקרה הטוב, רק כמה שבועות ובכך יספק מודל שלם של מנגנוני epigenetic פוטנציאל ההפעלה ברחבי תוחלת החיים המלא . כאן, אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולטהר גרעינים מהמוח (לא קבוע) קפוא המוות האנושי. השיטה כוללת מיצוי של גרעיני במאגר תמוגה hypotonic, ואחריו ultracentrifugation ו immunotagging עם נוגדן אנטי NeuN. גרעינים העצבית תווית נאספים אז בנפרד באמצעות הקרינה המופעל מיון. שיטה זו צריכה לחול על כל האזור במוח במגוון רחב של מינים מתאימים ללימודי הכרומטין immunoprecipitation עם אתר ושינוי ספציפי אנטי היסטון נוגדנים, ועל מתילציה בדנ&quot;א מבחני אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית לחקר סימונים epigenetic ב הכרומטין כי רוב מבחני חוסר ברזולוציה תא בודד. נוירונים הם בדרך כלל התערבבו עם גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולאסוף גרעינים העצבית מהמוח האנושי.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Views.  University of Massachusetts Medical School. ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית לחקר סימונים epigenetic ב הכרומטין כי רוב מבחני חוסר ברזולוציה תא בודד. נוירונים הם בדרך כלל התערבבו עם גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולאסוף גרעינים העצבית מהמוח האנושי.

Video: Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video