אנו אסירי תודה על התמיכה ואסאר מכללה לתואר ראשון מחקר מכון הקיץ (ursi), קרן המחקר לסלמון לוסי מיינארד, הפרס נאס&quot;א מס NX09AU90A, המרכז הלאומי למדע קרן למצוינות מחקר במדע והטכנולוגיה (NSF-CREST) ​​מס &#39;הפרס 0630388 ומס &#39;הפרס NSF 1,058,385.

1. ג elegans הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות פטרי של ג בוגרים הצעיר elegans כמתואר בניסויים קודמים מעורבים השעיה של ג elegans בקובט מלא נוזל 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של ניתוח וידאו, לבחור נמטודות מבוגרים צעירה חי ישירות לתוך קובט מלא במים deionized, מזוקקים באמצעות איסוף פלטינה כפי שמתואר בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מת ג elegans עם חשיפת כלורופורם. המשך על ידי ביצוע ההליך המתואר לקטיף נמטודות החי מתוארת בשלב 2. </li></ol> 2. התקנה אופטית לניתוח הווידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את ההתקנה הניסיונית ליצירת תמונות צל כפי שמוצג באיור 1. המצלמה יכולה להיות ממוקמת בכל מרחק מהמסך, כל עוד הוא מסוגל ללכוד תצוגה קדמית של המסך. מקום טוב ליד קובט מול המסך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלפחות שתי מראות כדילנווט את פלט לייזר הליום הניאון מתכונן להרחבת קרן גלילית, כך שהקרן מורחבת לקוטר של 12 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח נקבים אחד או שניים בנתיב הקרן, כך שהקרן עוברת דרך הנקבים בלי להיות מוסתר. השתמש בנקבים כדי להבטיח נשמר היישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את האלומה התרחבה על קובט קוורץ רכוב שהוא 10 מ&quot;מ רחב, 10 מ&quot;מ עמוק ו4 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיל את הקרן באמצעות עדשת Plano-קמור עם אורך מוקד חיובי של 75 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מסך הקרנה כ 120 סנטימטר מהעדשה. מרחקים גדולים מזו יניבו ההגדלה גדולה יותר של תמונת הצל. עם זאת, האיכות של התמונה תקטן עם עוצמת אור נמוכה וnoticeability מוגבר של הפרעות עקיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב מצלמה במהירות גבוהה, אשר מסוגלים לפחות 60 fps, ממש ליד קובט מול המסך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מיקרוסקופ לנתח ליד הסט האופטיעד להעברה מהירה של נמטודות לקובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן זמני לאבטח שליט שקוף עם חטיבות מ&quot;מ למרכזו של בעל קובט בניצב לקרן הורחבה כך שהפרויקטים קורה תמונה מוגדלת של השליט על גבי המסך. הגדר את קנה המידה האורך לניתוח וידאו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במסך ההקרנה, לסמן את המרחק בקנה מידה באמצעות סרגל שקוף מחוץ למרכז מהתמונה המוקרנת, כדי למנוע הפרעה להקרנה. <a href="Video_1_633nm.MOV" target="_blank">לחץ כאן לוידאו.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונה ולמדוד את ההגדלה. הסר את השליט מההתקנה. חזור על שלב זה עבור אורכי גל אחרים כמו זווית השבירה של אור לכל אורך גל דרך העדשה ישתנה בשל סטיות כרומטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את קובט ולמלא אותו עד למרחק של 1 מ&quot;מ של השפה עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל את ההקלטה בזמן שהאור בחדר הוא בכך שהמרחק בקנה מידה כלול באותומדה כתמונה המוקרנת. כבה את האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות איסוף דק, שטוח חוט פלטינה, להעביר מבוגרים צעירים בודדים ג elegans אחד בכל פעם מהצלחת אגר לקובט ידי נגיעה בבחירה אל פני השטח של המים. נמטודות תהיה גלויה בעמודת המים כאשר הוא נכנס לקרן בשל אור מפוזר. <a href="Video_2_CB678_633nm.mov" target="_blank">לחץ כאן לוידאו.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את התמונות המוקרנות של התולעים כשהם עוברים דרך קרן הלייזר המורחבת. חשוב לציין כי התמונה המוקרנת היא הפוכה והתולעים יופיעו לנוע בכיוון ההפוך של התנועה שלהם בפועל. תולעים שהם יורדים עם כוח הכבידה יופיעו לנוע כלפי מעלה על המסך (איור 2). </li></ol> 3. וידאו נתונים הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את הווידאו לתכנית ניתוח וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה באמצעות גורם הגדלה נקבע בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Track העקירה ליניארי של ראש נמטודות המוצלת עם לפחות 10 נקודות נתונים על כל הדרך שעשתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את המהירות בכיוון האנכי על ידי לקיחה נגזרת (&quot;Y&quot;, &quot;זמן&quot;) ולחלק את הערך זה על ידי גורם הגדלה קבע בשלב 2.2. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הירידה ליניארית של ג elegans: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כדי לוודא שנקודתי נתונים במצב האנכי לעומת גרף זמן, בדרך כלל בצורת קו ישר. ניתן להתעלם ממנו סטיות מסוימות בשל תנועת הראש של נמטודות. אם נקודות נתונים בדרך כלל בצורת קו ישר, המשיכו לשלב 4.1.2, אחרת הירידה אינה ליניארית והניתוח צריך להיות המשך באמצעות צעד 5.1 בפרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור קו רגרסיה ליניארית על ידי התאמת קו ישר 12 לנתונים מתפריט ניתוח. השיפוע של קו זה הוא אז את המהירות האנכית של ה-C.elegans. המדרון הוא השינוי בעמדה מחולק בשינוי בזמן על מרווח מסוים. לקבוע את המהירות יורד מתולעי חיים ומתים באופן זה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע מהירויות השחייה האנכית מנמטודות. גודל מדגם של כ 50 תולעים מספיק. השוואה מהירויות השחייה בתולעים חיים עם מהירויות סחיפה בתולעים מתים. </li></ol></li></ol> 5. לנתח קוי Motion של ג elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסעיף 3, בחר קובץ וידאו ניתח, אשר מראה ירידה קוי בתוך עמודת המים (איור 4). ירידה קוי יכולה להיות מזוהה באמצעות צעד 4.1.1 בפרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Curve Fit&quot; מהתפריט &quot;ניתוח&quot; בתוכנת ניתוח וידאו. בחר סדר שני פולינום (מהמעלה השנייה). להתאים את העקומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזור של עניין, להתאים את הכושר על הגרף על ידי הזזה בסוגריים בכל צד of הכושר על הגרף עד העקומה הוא קרוב מאוד לנקודות נתונים בכושר ו / או גם בתוך סורגי השגיאה. התכנית הראויה נותנת ביטוי מתמטי לעקומה המצויד, שהוא מצב אנכי לעומת זמן. קחו למשל את השגיאות העקומה מצוידים ניתנו על ידי התכנית משויכת לתכונות פיזיות. שגיאה היחסית של 15% או מתחת היא בדרך כלל מתקבל על הדעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד עקומה מתאימה לכיסוי קטעים נוספים של הנתונים. שגם 13 הפונקציות לכיסוי אופטימלי: לוודא כי העקומה המתאימה חפיפה ולנסות ליישר עקומות סמוכות, כך שמשחק מדרונות באזורים החופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את המהירות לאזור של עניין על ידי לקיחה הנגזרת של העקומה המצויד באמצעות הביטוי המתמטי שהושג בשלב 5.1.3. מהירויות עשויות להשתנות בזמן. שים לב כי הנגזר הוא השיפוע של פונקציה. ניתן להשיג נגזר מבחינה מתמטית או באופן גרפי. במקרה זה זה מעשי להשתמש expr המתמטי נתוןession. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הנגזרת השנייה של העקומות מצוידים כדי לקבל התאוצה. ההאצה עשויה להשתנות בזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את האצה על ידי מסת התולעת כדי לחשב את הדחף, המפעילה את התולעת. מסה המשוערת סבירה היא 3 מיקרוגרם בהנחה שהתולעת מורכבת בעיקר ממים. </li></ol>

<ol>
	<li>Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+behavioral+hierarchies+during+environmental+transitions+in+Caenorhabditis+elegans.">Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans.</a> Worm. 1, 5-11 (2012).</li><li>Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+locomotion+of+the+nematode+C.+elegans+is+achieved+through+modulation+of+a+single+gait.">Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait.</a> HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>Conrad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+of+Field+in+Depth.">Depth of Field in Depth.</a> Large Format Page Retrieved. , (2011).</li><li>Demtr&#246;der, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. , (2003).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+Using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).</li><li>Mood, A., Graybill, F., Boes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to the Theory of Statistics. , (1974).</li><li>Taylor, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Classical Mechanics. , (2005).</li><li>Magnes, J., Susman, K., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction.">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li><li>Bevington, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. , (1969).</li><li>Lyche, T., Schumaker, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+spline+approximation+methods.">Local spline approximation methods.</a> Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -. J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+Force+Transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/ENaC+Channel+Modulates+DAF-16/FoxO+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

טכניקת SWSI מספקת דרך נוספת להבין את יכולות locomotory של אורגניזמים מיקרוסקופיים כמו נמטודות חופשיות חי. בעזרת טכניקה זו יש לנו להבחין בין תנועה הפעילה (שחייה) והיסחפות פסיבית בשל כוח הכבידה פועל על נמטודות המתה. בנוסף, כאשר נמטודות שחייה חופשית לשנות כיוון בזמן תנועה במים, אנו מסוגלים למדוד את כוחות הגרר וכוחות זוויתי, הפועלים בנמטודות ומופעלים על ידי נמטודות. נמטודות נתקלות תנאים סביבתיים שונים בתוך הקרקע. ישנם כיסי מים בתוך אדמה, כמו גם חלקיקים מוצקים וחומרים ביולוגיים של צורות ומרקמים שונים. בנוסף, נמטודות להתקיים בתוך סביבת הכבידה שהם מגיבים ל14. יתר על כן, נמטודות סמוך לפני השטח של האדמה חשופות לאורכי גל שונים של אור, שינויים בטמפרטורה ובלחות, כמו גם ביולוגימשתנים כמו חיידקים, פטריות טורפת ואורגניזמים אחרים באדמה. נמטודות חייבת להגיב לכל משתנים השונים אלה, שחייה וזחילה באמצעי תקשורת שונה, מפנה ושינוי אסטרטגיות ניווט. כל החישובים המורכבים הללו מבוצעים על ידי רק 302 נוירונים, קבוצת משנה של אשר מעורבים בתנועה, ו95 תאי קיר שרירים גוף. מדידות מהסוג שתואר על ידי טכניקת SWSI מספקות תובנה חשובה לתוך כיצד נמטודות להשיג מורכבות ניווט זה. לחלק הראשון, יש לנו למדוד את קצב יורד הכולל של ג wildtype elegans ב633 ננומטר אור. שימוש במדידות אלה, אנחנו יכולים להעריך את כוח גרר מפגשי תולעת. למקרה המבחן של נמטודות מואצת, הכוחות מעורבים שינוי ברציפות מאז כוח גרר השינויים במהירות. יש כמה דברים שאנו יכולים לעשות על הכוחות הפועלים על התולעת. כתולעת מאיטה ומנסה swim כלפי מעלה את הרכיב האנכי של כוח הגרר יורד עד שזה מגיע לאפס בנקודת המסלול של נמטודות הנמוכה. בשלב זה, את התולעת חייבת להיות כוח כלפי מעלה כדי לשחות למעלה. שיטה זו יכולה להיות שונה בכמה דרכים. כל מינים מיקרוסקופיים שמנווט בנוזל שקוף ניתן לעקוב באמצעות SWSI. ניתן לבצע מחקרים עם כל אורכי גל שאינם נגישים למצלמות דיגיטליות. מצלמות דיגיטליות בדרך כלל יאספו את אורכי גל הנעים מ-UV אל IR הקרוב. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים אופקיים על ידי הפניית הלייזר אנכי כלפי מעלה. אז יכולים להיות ממוקמים המינים על משטח שקוף אופקי, כמו שקופיות מיקרוסקופ. התאמת ההרחבה הקרן או בעדשת המגדלת אחרי ההרחבה הקרן יכולה לחדד תמונות מטושטשות. המשתמש צריך להיות בטוח כדי להדק את כל הרכיבים לשולחן, כדי להבטיח יישור קורה עקבי וקל. השיטה היא מוגבלת על ידי wavelengt לייזר זמיןhs ורזולוציה. בעיקרו של דבר את היתרונות של שיטה זו על פני מיקרוסקופים קיימים, שהן הגמישות בכיוונים ואורכי גל, גם חולשות מאז ההתקנה היא פשוטה. אופטיקה והכתמים לא מתוחכמים של הלייזר מגבילים את הרזולוציה. כמה מהחסרונות הללו בהחלט יכולים להיות שיפור בעתיד על ידי כולל מסנן המרחבי ומקרין את התמונה ישירות על גבי מצלמה CCD. בקלות ניתן ללמוד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול כניסוי מתבצע בפעם הראשונה. הצבת נמטודות בקובט מבלי ליצור מערבולת היא קריטית. כמו כן, תנודות עלולות להפריע להתקנה ומשנות את התנהגותם של התולעים. הקפד להגביל את הכוח, המשמש לצל תמונה. 2 mW לקרן לייזר שהיא 1 מ&quot;מ קוטר צריך להיות המקסימאלי כדי למנוע תופעות חימום. ההתקנה צריכה להיבדק לפיזור לוואי בעת שימוש בנוזלים אחרים מלבד מים מזוקקים. רוב מ &#39;נכון לעכשיוicroscopes פועל על מישור אופקי באמצעות מסנני אור או בצבע לבן, שהם עדיין רחבים מאוד בטווח אורכי הגל. מיקרוסקופים שבאמת משתמשים באורכי גל בודדים ויש לי גמישות בתרחיש הצפייה, כלומר מיקום אופקי, מוגבלים בדרך כלל לטובה אחד או אחרת. כמו כן, אלו סוגים של מיקרוסקופים הם בדרך כלל יקרים מאוד ועדיין מוגבלים למטוסי מוקד בניגוד לשיטה שלנו. ההתקנה שלנו בקלות יכולה להיות בנויה עם תקציב נמוך ביותר. שיטה זו היא מוכנה לשימוש על ידי בתי ספר, חברות סביבתיות, כמו גם גופים אחרים הפועלים במימון קטן. בעתיד, בשיטה זו ניתן להשתמש בהגדרה מאוד מתוחכמת כדי לחקור תופעות בזמן אמת על התנועה וmechanosensation של מינים מיקרוסקופיים. שיטה זו הופכת את מחקרי אורך גל יחיד במגוון רחב של זוויות ועומקי צפייה זמינים בקלות.

elegans Caenorhabditis הוא נמטודות קרקע מועילות חיים חופשיות שהיא אורגניזם מודל רב עוצמה ללימוד מנגנונים של ויסות הגנים, פיתוח ולאחרונה להבנת ביולוגיה והתנהגות חושיות. למרות שיש רק 302 נוירונים, ג elegans מסוגל תבניות מורכבות locomotory, התנהגויות רבייה, ניווט, chemotaxis והרבה התנהגויות אחרות. ג elegans להחזיק מכאני, chemoreceptors ואפילו לזהות אורכי גל כחולים של אור (וורד et al. 2008) 1. בעוד הרבה ידוע על המעגלים העצביים של תפקוד חושי ודפוסי locomotory כלליים בג elegans, פחות ידוע על התגובות לגירויים מרובים, בו זמנית, או תנאי סביבה מורכבים יותר ממה יכול להיות מודל תחת מיקרוסקופ. כמה מחקרים גילו דפוסי locomotory מורכבים יותר, כי הם 2,3,4 פלסטיק מאוד. הגישה המתודולוגית שלנו תאפשר לימודים של nematodes בפתרון בזמן אמת שבו אנחנו בקלות יכולים לספק תנאי סביבה מרובים בו זמנית. שאלה זו קשה לתת מענה תוך שימוש בטכניקות הדמיה המבוסס על מיקרוסקופ קונבנציונליות. פיתחנו טכניקת הדמיה המאפשרת לנו למקם את נמטודות בתוך עמודת מים לבחון התנהגויות locomotory, כמו גם לקבוע את היכולות של נמטודות לשנות תנועה בתגובה לתנאים סביבתיים שונים. אורך גל יחיד צל ההדמיה (SWSI) מוצגת במאמר זה בפעם הראשונה כדי לענות על החסרונות של מיקרוסקופים מסורתיים. מיקרוסקופים מסורתיים מוגבלים לתצפיות במינים במישור מוקד אופקי מיקרונים אחדים בעומק 5,6. לגבי מחקרי אורך גל יחיד, רוב מיקרוסקופים מסורתיים להשתמש במסנני צבע כדי לסנן אור לבן באופן כללי מאוד, בדרך כלל, ננומטר 50-100. שימוש בליזר לSWSI מצמצם את בחירת אורך הגל לננומטר פחות מ 1, תוך שמירה על סימןעוצמת אור ificant 7. באופן דומה, באורכי גל בודדים היה בשימוש כדי למדוד תדרי חייה של ג elegans בזמן אמת 8. להפגנה הראשונה של השיטה שלנו, אנו עוקבים אחר המצב האופקי, x, והמצב האנכי, y, של ג שוחה בחופשיות elegans בעמודת מים, על פני מרחק של כ סנטימטר. בפרט, אנו מעוניינים בתנועה האנכית מאז הכבידה פועל גם בצורה אנכית. שיפוע ליניארי מתאים למצב האנכי נותן את המהירות האנכית, y v, של נמטודות כפי שהוא יורד בעמודת המים: <img alt="נוסחה" fo:content-width="0.5in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq1.jpg" width="50" /> (1) שורש ממוצע ריבוע של השגיאה (RMSE) 9 מציין את האיכות של הכושר ומציין אם המהירות יורד בדרך כלל קבועה. אז המהירויות האנכיות בממוצע לEACמיני שעות ותולעים מתים. שימוש בתוצאות הללו, דראג, שניסיון התולעים יכול להיות מוערך. להפגנה השנייה של השיטה שלנו, בחרנו ג elegans שלא ירד בקצב קבוע שלא כמו רוב התולעים שנצפו. התולעים שנבחרו או הסתובבו ושחו כלפי מעלה או ריחפו במשך זמן מה לפני שאמשיך בירידה. מבחינה פיזית, מקרה זה מראה שהדחף של מיקרואורגניזם שחייה יכול להיות מחושב. חוקי ניוטון להכתיב כי גוף שמשנה כיוונים מאיץ, מה שמרמז על כוח שקול, <img alt="פורמולה 1" fo:content-width="0.3in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq.jpg" width="25" /> , הוא הפועל על הגוף ש10: <img alt="פורמולה 2" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq2.jpg" width="70" /> (2) איפה <img alt="עמ &#39;" fo:content-width="0.1in" src="/files/ftp_upload/51424/51424p.jpg" width="10" /> הואאת המומנטום ולא ליניארי הוא זמן. ההאצה של התולעת עומד ביחס ישר לכח הפועל על התולעת מאז המסה של התולעת נשארת קבועה. כתוצאה מכך, הכח השקול האנכי הוא: <img alt="פורמולה 3" fo:content-width=".8in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq3.jpg" width="70" /> (3) כאשר m הוא המסה של תולעת וy מייצג את התאוצה האנכית. הכח השקול בכיוון האנכי מייצג אז דחף התולעת באותו הכיוון. הדחף הכולל ניתן לחשב על ידי לקיחת הרכיב האופקי בחשבון.

<table><tbody><tr><td>Tunable Helium-Neon laser&amp;nbsp;</td><td>Research Electro-Optics</td><td>30602</td><td>Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Front Surface Aluminum Mirrors</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Exilim Camera</td><td>Casio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz Cuvette</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td></td></tr><tr><td>LoggerPro (Software)</td><td>Vernier</td><td></td><td>http://www.vernier.com/products/software/lp/</td></tr><tr><td>Mathematica 8</td><td>Wolfram</td><td></td><td>http://www.wolfram.com/</td></tr><tr><td>5x-10x variable zoom Galilean beam expander</td><td>Thorlabs</td><td>BE05-10-A</td><td></td></tr><tr><td>Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1257</td><td></td></tr></tbody></table>

single wavelength shadow imaging of caenorhabditis elegans locomotion including force estimates

מחקר זה מדגים טכניקה זולה ופשוטה המאפשרת המדידה של תכונות פיזיות כגון מיקום, מהירות, תאוצה וכוחות מעורבים בהתנהגות locomotory של נמטודות המושעית בעמודת מים בתגובה לאורכי גל בודד של אור. אנו מדגימים כיצד להעריך את התנועה של האורגניזם מיקרוסקופי באמצעות יחיד אורך גל צל הדמיה (SWSI) באמצעות שתי דוגמאות שונות. הדוגמא הראשונה היא מחקר שיטתי ובר קיימא מבחינה סטטיסטית של הירידה הממוצעת של ג elegans בעמודת מים. במחקר זה, שהשתמשנו חיים וג wildtype המת elegans. כאשר השווינו את המהירות וכיוון התנועה פעילה נמטודות עם מוצא הפסיבי של תולעים מתים בתוך השדה כבידה, מחקר זה לא הראה שום הבדל במוצא-פעמים. הירידה הממוצעת הייתה 1.5 מ&quot;מ / שנייה ± 0.1 מ&quot;מ / שנייה עבור שניהם את התולעים חיים ומתים באמצעות 633 ננומטר קוהרנטיתאור. הדוגמא השנייה היא מקרה של ג פרט בחר elegans שינוי הכיוון במהלך הירידה בעמודת מים אנכית. תאוצה וכוח הם נותחו בדוגמא זו. מקרה זה מדגים את ההיקף של תכונות פיזיות אחרות שיכול להיות מוערכת באמצעות SWSI תוך הערכת ההתנהגות באמצעות אורכי גל יחיד בסביבה שאינה נגיש לעם מיקרוסקופים מסורתיים. שימוש בניתוח זה אנו מוערכים נמטודות אדם מסוגלת לדחוף בכוח עודף של 28 NN. הממצאים שלנו מצביעים על כך שנמטודות חיים להפעיל 28 ננ בעת ההפעלה, או ההעברה נגד השדה הכבידה. הממצאים מראים עוד כי נמטודות יורדת באופן פסיבי בעמודת מים, אך באופן פעיל יכולים להתנגד לכח הכבידה בעיקר על ידי הפיכת כיוון.

Descent היציב החקירה הראשונה מראה שום הבדל להבחין בשיעורי יורד מג elegans במהלך SWSI באמצעות 633 ננומטר. השיעורים יורד נמצאו קבוע ב1.5 מ&quot;מ / השני ± 0.1 מ&quot;מ / השני לחיים וג מת שניהם elegans. גודל מדגם של 50 תולעים שנוצר שונות סבירות של 7% לשניהם חיים ותולעים מתים. אין תאוצה הפועלת על התולעים שכן המהירות יורד הוא קבועה, כך שהכח הגרר שווה לכוח הכבידה מינוס כוח העילוי. משמעות הדבר הוא כי הצפיפות של התולעת היא מעט גדולה יותר מזה של מים; עם זאת, להערכות שמתחתיו הוא עדיין מעשי להניח שהצפיפות של נמטודות היא בערך זה של מים. כיוון שינוי החקירה השנייה, מקרה מבחן, מוכיחה כי נמטודות מסוגלות לשנות כיוון ויכולות לשחות כלפי מעלה נגדכוח הכבידה. שתי עקומות הותאמו לתזוזה האנכית של נמטודות, כך שנגזר השני של עקומות אלה יכולים להיות splined גרף תאוצה לעומת זמן (איור 5). &#160; רצוי לשמור על סדר הפולינום נמוך ככל האפשר, תוך שמירה על כושר טוב. סדר הפולינום נמוך מצביע פחות וריאציה בתאוצה לאורך זמן. מבחינת פולינום מהסדר גבוה יותר יהיה זניח, ולכן מיותר, אם הצו של הפולינום הוא גבוה מדי. תולעת זו מאיטה בקצב קבוע של 0.110 מ&quot;מ / שנייה 2 ± 0.002 מ&quot;מ / שנייה 2, מסתובבת ומאיץ באותו קצב 0.110 מ&quot;מ / שנייה 2 ± 0.002 מ&quot;מ / שנייה 2 לזמן קצר לאחר נקודת התפנית. ג elegans ממשיך לנוע כלפי מעלה בתאוצה הולכת ופוחתת של 1.252-.00708 לא במ&quot;מ / השני 2 עד ההאצה נופלת לאפס. שמירה על Eq נפש. 3, ומסת תולעת המשוערת של 3 &amp; #956; גרם, התולעת עוברת כוח אנכי נטו, F Ny, של 0.33 pN עד זמן קצר לאחר נקודת התפנית. Descent: ישנם שלושה סוגים של כוחות הפועלים על התולעת עד התולעת מגיעה לנקודת התפנית: כבידה, גרר, כוח העילוי ודחף (איור 6 א). הכח השקול שווה לסכום הווקטורים של כל שלושת הכוחות. כאן אנו רואים את המרכיבים האנכיים בלבד: F Ny = G F Dy + F Ty-F + F B (4) כאשר F B הוא כוח העילוי. ו ז שווה בגודל אך הפוך בכיוון לכוח העילוי בהנחה שהצפיפות של התולעת היא זה של מים. EQ. 4 אז יכולים להיות כתובים באופן הבא: F = Ny F Dy + F טאי (5) F Ny נשאר קבוע במהלך הירידה. משמעות הדבר הוא כיF Dy + F טאי נשאר קבוע עד לנמטודות מגיעה לנקודת המפנה. F Dy הוא הגדול ביותר בחלקו העליון, המהווה את תחילתו של השביל, ומפחית בהדרגה לאפס עד למהירות היא אפס בנקודת התפנית ואילו F טיי חייב להגדיל כדי לשמור קבוע F Ny. תפנית: אין כוח גרר בכיוון האנכי בנקודת התפנית מאז את המהירות האנכית שווה אפס בשלב זה. רק הכוחות הפועלים בכיוון האנכי הם כוח הכבידה, - g F, ציפה, F B ודחף התולעת האנכי, F טאי, כמתואר באיור 6 ב. בשלב זה, הדחף של ג ניתן לקבוע elegans: F = F טאי Ny (6) הדחף בחלק התחתון של המסלול הוא אז שווה פחות או יותר ל0.33 PN, שזה בערך 0.001% מהמשקל של התולעת. אם ניקח בחשבון שהמשקל המשוער, G F של ג elegans הוא 28 NN, אסנט: בדומה לכך, במהלך העלייה, עליית דראג אבל הוא הצביע כלפי מטה (איור 6 ג): F = Ny-F Dy + F טאי (7) הדחף מיושם על ידי התולעת חייב עכשיו להיות אפילו גדול יותר ושווה לסכום של כוח הגרר והמשקל. התולעת היא להאט לאחר מתחיל לשחות. לשחות עד באותו קצב כמו התולעת ירדה, התולעת הייתי צריכה להפעיל דחיפה כלפי מעלה של לפחות פעמיים במשקל שלה. רחיפה דוגמא לתולעת שמאטה את הירידה שלה לשנייה על 3 מוצגת באיור 7. &#160; פולינום תואר 3 rd הוא בכושר סביר לשביל הכולל. השגיאות בתאוצה ומהירות מכושר זה הן פחות מ 15%. התולעת מתחילה עם upwa משמעותי<html> דחף rd, מאט ומתחיל להסתובב ב68 שניות; עם זאת, ההאצה כלפי מעלה יורדת ברציפות (איור 8) &#160; עד ההאצה נטו שווה לאפס סביב 68.5 שניות. זה סופו של דבר מוביל להאצה נטו בכיוון מטה ואחריו אפס נקודה אחרת במהירות (איור 9) &#160; ונמטודות מתחילה לרדת שוב ב69 שניות. זה מעניין, כי את התאוצה האנכית שנצפתה המקסימלי במקרה זה היא 2.7 מ&quot;מ / שנייה 2. ההאצה בנקודות המפנה הן 0.455 מ&quot;מ / השני 2 ו - 0.455 מ&quot;מ / שנייה 2, בהתאמה; כארבעה פעמים גדולות יותר מאשר במקרה של נמטודות שמסתובבת ושוחה למעלה. באמצעות EQ. 6, זה ניתן להעריך כי הדחיפה כלפי מעלה היא כ 1.32 pN בנקודת המפנה הראשונה. בנקודת המפנה השנייה, האצה נטו היא שלילית, כך שהדחיפה כלפי מעלה היא 1.32 PN. <html> o: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1.jpg" /> איור 1. התקנה ניסיונית. הלייזר, ההרחבה קרן, העדשה והמסך הם חיוניים להגדרת הניסוי. מראות ההיגוי והנקבים עלולות להיות מושמטים, אבל יעשו את היישור האופטי פחות יציב. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2.jpg" /> איור 2. תמונת יחידה אורך גל צל (SWSI). באמצעות 2 mW של 543 אור לייזר ננומטר הצל של תולעת מוקרנת על מסך. התמונה היא הפוכה, כך שנמטודות מופיעה ליפול כלפי מעלה. &quot;Src =&quot; 424/51424fig3highres.jpg / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. אנכי ירידה של ג wildtype אחת elegans בעמודת מים. נמטודות זה מוצל על ידי אור קוהרנטי 633 ננומטר. שיפוע המתאים ליניארית מצביע על מהירות כלפי מטה של 1.09 מ&quot;מ / השני ± 0.01 מ&quot;מ / השני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4.jpg" /> איור 4. גרף תזוזה של ג wildtype בודד כלפי מעלה שחייה elegans. שני התקפי splined לזהות את הנתיב הכללי של נמטודות. הנגזרת השנייה של הכושר מגלה את התאוצה. ההאצה המרבית נקבעה בקלות מההתקף הראשון: 0.110 מ&quot;מ<html> / השני 2 ± 0.002 מ&quot;מ / שנייה 2. רק כמה ברים שגיאה מוצגים כך שנקודתי נתונים והכושר יישארו גלויות. נמטודות זה מוצל על ידי אור קוהרנטי 633 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5.jpg" /> גרף איור 5. ההאצה של ג wildtype אחת elegans. נמטודות זו שומרת על תאוצה כלפי מעלה קבועה של 0.110 מ&quot;מ / השני 2 ± 0.002 מ&quot;מ / שנייה 2 גורמת לו להאט ולאחר מכן להעביר כלפי מעלה. זמן קצר לאחר נקודת תפנית האצה יורדת בהתמדה והאצה נטו מפחיתה לאפס.<html> g &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6.jpg" /> תרשימי איור 6. חיל לירידה, נקודת מפנה ועלייה. חוק ארכימדס וכוח הכבידה שווים בגודל והפוך בכיוון, כך שההשפעה של כוחות אלה מבטלים זה את זה. לכן הם לא מוצגים בתרשימים אלה. () התולעת היא יורדת עם גרור ודחף כלפי מעלה. (ב) התולעת היא בנקודה של המסלול ללא גרר הנמוכה. הדחף הוא מצביע למעלה. (ג) התולעת עולה עם גרור כלפי מטה ואילו הדחף הוא כלפי מעלה. &quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg &quot;/&gt; איור 7. גרף תזוזה של נמטודות המרחפת אחת. התולעת מאטה ומתחילה להסתובב בכ 68 שניות אבל מתחילה יורדת סביב 69 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8.jpg" /> .. איור 8 גרף ההאצה של נמטודות המרחפת אחת תולעת זו מתחילה עם האצה כלפי מעלה של 2.7 מ&quot;מ / שנייה 2, יורדת לאפס וסופו של דבר יש לו תאוצה כלפי מטה של -. 2.6 מ&quot;מ / שנייה 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בvers גדול יותר</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9.jpg" /> איור 9. גרף מהירות של נמטודות המרחפת אחת. תולעת זו מגיעה לעצירה ב68 שניות ומתחילה לעמוד בראש כלפי מעלה, מאטה ומגיעה למהירות אפס בכיוון האנכי ב69 שניות ואחריו ירידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="טבלת 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424table1.jpg" width="400" /> טבלת 1. מהירויות ירידה ממוצעת של N2 ג elegans. 50 חיים ו50 נמטודות מתות tracked במהלך ירידתם. המהירות הממוצעת לירידות היא אותה לחיים ותולעים המתים: 1.5 מ&quot;מ / השני ± 0.1 מ&quot;מ / השני.

Watch this Scientific Journal Video about Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates at JoVE.com

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

הטכניקה המוצגת כאן מודדת את דרכו של שחייה באופן חופשי מינים מיקרוסקופיים באמצעות חשיפת אורך גל יחידה. ג elegans משמשים כדי להדגים הדמיה צל כחלופה זולה למיקרוסקופים יקרים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי להתאים את אוריינטציות, סביבות ומינים שונות כדי למדוד את הכיוון, מהירות, תאוצה וכוחות.

אחת אורך גל צל הדמיה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; נידות כולל כוח אומדנים

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

single-wavelength-shadow-imaging-caenorhabditis-elegans-locomotion

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Unit 1

Newton's Laws of Motion

SCIENTISTS IN ACTION

9.1K Views.  Vassar College.  הטכניקה המוצגת כאן מודדת את דרכו של שחייה באופן חופשי מינים מיקרוסקופיים באמצעות חשיפת אורך גל יחידה. ג elegans משמשים כדי להדגים הדמיה צל כחלופה זולה למיקרוסקופים יקרים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי להתאים את אוריינטציות, סביבות ומי...

Video: Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Bioengineering

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Neuroscience

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Behavior

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually leave their food source and prefer to remain outside the bacterial lawn. The assay is an easy way to test the worms' ability to sense external or internal cues to properly respond to harmful conditions. Though a simple assay, counting is time consuming, particularly with multiple samples, and assay durations that span overnight are inconvenient for researchers. An imaging system that can image many plates over a long period is useful but costly. Here, we describe a smartphone-based imaging method to record lawn avoidance in C. elegans. The method requires only a smartphone and a light emitting diode (LED) light box, to serve as a transmitted light source. Using free time-lapse camera applications, each phone can image up to six plates, with sufficient sharpness and contrast to manually count worms outside the lawn. The resulting movies are processed into 10 s audio video interleave (AVI) files for every hourly time point, then cropped to show each single plate to make them more amenable for counting. This method is a cost-effective way for those looking to examine avoidance defects and can potentially be extended to other C. elegans assays.

Author Spotlight: שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay  

This article describes a simple, low-cost method of recording the lawn avoidance behavior of Caenorhabditis elegans, using readily available items such as a smartphone and a light emitting diode (LED) light box. We also provide a Python script to process the video file into a format more amenable for counting.

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

אחת אורך גל צל הדמיה של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של

מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני