אנו אסירי תודה על התמיכה ואסאר מכללה לתואר ראשון מחקר מכון הקיץ (ursi), קרן המחקר לסלמון לוסי מיינארד, הפרס נאס&quot;א מס NX09AU90A, המרכז הלאומי למדע קרן למצוינות מחקר במדע והטכנולוגיה (NSF-CREST) ​​מס &#39;הפרס 0630388 ומס &#39;הפרס NSF 1,058,385.

1. ג elegans הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות פטרי של ג בוגרים הצעיר elegans כמתואר בניסויים קודמים מעורבים השעיה של ג elegans בקובט מלא נוזל 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של ניתוח וידאו, לבחור נמטודות מבוגרים צעירה חי ישירות לתוך קובט מלא במים deionized, מזוקקים באמצעות איסוף פלטינה כפי שמתואר בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מת ג elegans עם חשיפת כלורופורם. המשך על ידי ביצוע ההליך המתואר לקטיף נמטודות החי מתוארת בשלב 2. </li></ol> 2. התקנה אופטית לניתוח הווידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את ההתקנה הניסיונית ליצירת תמונות צל כפי שמוצג באיור 1. המצלמה יכולה להיות ממוקמת בכל מרחק מהמסך, כל עוד הוא מסוגל ללכוד תצוגה קדמית של המסך. מקום טוב ליד קובט מול המסך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלפחות שתי מראות כדילנווט את פלט לייזר הליום הניאון מתכונן להרחבת קרן גלילית, כך שהקרן מורחבת לקוטר של 12 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח נקבים אחד או שניים בנתיב הקרן, כך שהקרן עוברת דרך הנקבים בלי להיות מוסתר. השתמש בנקבים כדי להבטיח נשמר היישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את האלומה התרחבה על קובט קוורץ רכוב שהוא 10 מ&quot;מ רחב, 10 מ&quot;מ עמוק ו4 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיל את הקרן באמצעות עדשת Plano-קמור עם אורך מוקד חיובי של 75 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מסך הקרנה כ 120 סנטימטר מהעדשה. מרחקים גדולים מזו יניבו ההגדלה גדולה יותר של תמונת הצל. עם זאת, האיכות של התמונה תקטן עם עוצמת אור נמוכה וnoticeability מוגבר של הפרעות עקיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב מצלמה במהירות גבוהה, אשר מסוגלים לפחות 60 fps, ממש ליד קובט מול המסך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מיקרוסקופ לנתח ליד הסט האופטיעד להעברה מהירה של נמטודות לקובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן זמני לאבטח שליט שקוף עם חטיבות מ&quot;מ למרכזו של בעל קובט בניצב לקרן הורחבה כך שהפרויקטים קורה תמונה מוגדלת של השליט על גבי המסך. הגדר את קנה המידה האורך לניתוח וידאו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במסך ההקרנה, לסמן את המרחק בקנה מידה באמצעות סרגל שקוף מחוץ למרכז מהתמונה המוקרנת, כדי למנוע הפרעה להקרנה. <a href="Video_1_633nm.MOV" target="_blank">לחץ כאן לוידאו.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונה ולמדוד את ההגדלה. הסר את השליט מההתקנה. חזור על שלב זה עבור אורכי גל אחרים כמו זווית השבירה של אור לכל אורך גל דרך העדשה ישתנה בשל סטיות כרומטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את קובט ולמלא אותו עד למרחק של 1 מ&quot;מ של השפה עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל את ההקלטה בזמן שהאור בחדר הוא בכך שהמרחק בקנה מידה כלול באותומדה כתמונה המוקרנת. כבה את האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות איסוף דק, שטוח חוט פלטינה, להעביר מבוגרים צעירים בודדים ג elegans אחד בכל פעם מהצלחת אגר לקובט ידי נגיעה בבחירה אל פני השטח של המים. נמטודות תהיה גלויה בעמודת המים כאשר הוא נכנס לקרן בשל אור מפוזר. <a href="Video_2_CB678_633nm.mov" target="_blank">לחץ כאן לוידאו.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את התמונות המוקרנות של התולעים כשהם עוברים דרך קרן הלייזר המורחבת. חשוב לציין כי התמונה המוקרנת היא הפוכה והתולעים יופיעו לנוע בכיוון ההפוך של התנועה שלהם בפועל. תולעים שהם יורדים עם כוח הכבידה יופיעו לנוע כלפי מעלה על המסך (איור 2). </li></ol> 3. וידאו נתונים הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את הווידאו לתכנית ניתוח וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה באמצעות גורם הגדלה נקבע בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Track העקירה ליניארי של ראש נמטודות המוצלת עם לפחות 10 נקודות נתונים על כל הדרך שעשתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את המהירות בכיוון האנכי על ידי לקיחה נגזרת (&quot;Y&quot;, &quot;זמן&quot;) ולחלק את הערך זה על ידי גורם הגדלה קבע בשלב 2.2. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הירידה ליניארית של ג elegans: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כדי לוודא שנקודתי נתונים במצב האנכי לעומת גרף זמן, בדרך כלל בצורת קו ישר. ניתן להתעלם ממנו סטיות מסוימות בשל תנועת הראש של נמטודות. אם נקודות נתונים בדרך כלל בצורת קו ישר, המשיכו לשלב 4.1.2, אחרת הירידה אינה ליניארית והניתוח צריך להיות המשך באמצעות צעד 5.1 בפרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור קו רגרסיה ליניארית על ידי התאמת קו ישר 12 לנתונים מתפריט ניתוח. השיפוע של קו זה הוא אז את המהירות האנכית של ה-C.elegans. המדרון הוא השינוי בעמדה מחולק בשינוי בזמן על מרווח מסוים. לקבוע את המהירות יורד מתולעי חיים ומתים באופן זה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע מהירויות השחייה האנכית מנמטודות. גודל מדגם של כ 50 תולעים מספיק. השוואה מהירויות השחייה בתולעים חיים עם מהירויות סחיפה בתולעים מתים. </li></ol></li></ol> 5. לנתח קוי Motion של ג elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסעיף 3, בחר קובץ וידאו ניתח, אשר מראה ירידה קוי בתוך עמודת המים (איור 4). ירידה קוי יכולה להיות מזוהה באמצעות צעד 4.1.1 בפרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Curve Fit&quot; מהתפריט &quot;ניתוח&quot; בתוכנת ניתוח וידאו. בחר סדר שני פולינום (מהמעלה השנייה). להתאים את העקומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזור של עניין, להתאים את הכושר על הגרף על ידי הזזה בסוגריים בכל צד of הכושר על הגרף עד העקומה הוא קרוב מאוד לנקודות נתונים בכושר ו / או גם בתוך סורגי השגיאה. התכנית הראויה נותנת ביטוי מתמטי לעקומה המצויד, שהוא מצב אנכי לעומת זמן. קחו למשל את השגיאות העקומה מצוידים ניתנו על ידי התכנית משויכת לתכונות פיזיות. שגיאה היחסית של 15% או מתחת היא בדרך כלל מתקבל על הדעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד עקומה מתאימה לכיסוי קטעים נוספים של הנתונים. שגם 13 הפונקציות לכיסוי אופטימלי: לוודא כי העקומה המתאימה חפיפה ולנסות ליישר עקומות סמוכות, כך שמשחק מדרונות באזורים החופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את המהירות לאזור של עניין על ידי לקיחה הנגזרת של העקומה המצויד באמצעות הביטוי המתמטי שהושג בשלב 5.1.3. מהירויות עשויות להשתנות בזמן. שים לב כי הנגזר הוא השיפוע של פונקציה. ניתן להשיג נגזר מבחינה מתמטית או באופן גרפי. במקרה זה זה מעשי להשתמש expr המתמטי נתוןession. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הנגזרת השנייה של העקומות מצוידים כדי לקבל התאוצה. ההאצה עשויה להשתנות בזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את האצה על ידי מסת התולעת כדי לחשב את הדחף, המפעילה את התולעת. מסה המשוערת סבירה היא 3 מיקרוגרם בהנחה שהתולעת מורכבת בעיקר ממים. </li></ol>

<ol>
	<li>Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).</li><li>Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+behavioral+hierarchies+during+environmental+transitions+in+Caenorhabditis+elegans.">Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans.</a> Worm. 1, 5-11 (2012).</li><li>Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+locomotion+of+the+nematode+C.+elegans+is+achieved+through+modulation+of+a+single+gait.">Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait.</a> HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>Conrad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+of+Field+in+Depth.">Depth of Field in Depth.</a> Large Format Page Retrieved. , (2011).</li><li>Demtr&#246;der, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. , (2003).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+Using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).</li><li>Mood, A., Graybill, F., Boes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to the Theory of Statistics. , (1974).</li><li>Taylor, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Classical Mechanics. , (2005).</li><li>Magnes, J., Susman, K., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction.">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li><li>Bevington, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. , (1969).</li><li>Lyche, T., Schumaker, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+spline+approximation+methods.">Local spline approximation methods.</a> Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -. J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+Force+Transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/ENaC+Channel+Modulates+DAF-16/FoxO+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

טכניקת SWSI מספקת דרך נוספת להבין את יכולות locomotory של אורגניזמים מיקרוסקופיים כמו נמטודות חופשיות חי. בעזרת טכניקה זו יש לנו להבחין בין תנועה הפעילה (שחייה) והיסחפות פסיבית בשל כוח הכבידה פועל על נמטודות המתה. בנוסף, כאשר נמטודות שחייה חופשית לשנות כיוון בזמן תנועה במים, אנו מסוגלים למדוד את כוחות הגרר וכוחות זוויתי, הפועלים בנמטודות ומופעלים על ידי נמטודות. נמטודות נתקלות תנאים סביבתיים שונים בתוך הקרקע. ישנם כיסי מים בתוך אדמה, כמו גם חלקיקים מוצקים וחומרים ביולוגיים של צורות ומרקמים שונים. בנוסף, נמטודות להתקיים בתוך סביבת הכבידה שהם מגיבים ל14. יתר על כן, נמטודות סמוך לפני השטח של האדמה חשופות לאורכי גל שונים של אור, שינויים בטמפרטורה ובלחות, כמו גם ביולוגימשתנים כמו חיידקים, פטריות טורפת ואורגניזמים אחרים באדמה. נמטודות חייבת להגיב לכל משתנים השונים אלה, שחייה וזחילה באמצעי תקשורת שונה, מפנה ושינוי אסטרטגיות ניווט. כל החישובים המורכבים הללו מבוצעים על ידי רק 302 נוירונים, קבוצת משנה של אשר מעורבים בתנועה, ו95 תאי קיר שרירים גוף. מדידות מהסוג שתואר על ידי טכניקת SWSI מספקות תובנה חשובה לתוך כיצד נמטודות להשיג מורכבות ניווט זה. לחלק הראשון, יש לנו למדוד את קצב יורד הכולל של ג wildtype elegans ב633 ננומטר אור. שימוש במדידות אלה, אנחנו יכולים להעריך את כוח גרר מפגשי תולעת. למקרה המבחן של נמטודות מואצת, הכוחות מעורבים שינוי ברציפות מאז כוח גרר השינויים במהירות. יש כמה דברים שאנו יכולים לעשות על הכוחות הפועלים על התולעת. כתולעת מאיטה ומנסה swim כלפי מעלה את הרכיב האנכי של כוח הגרר יורד עד שזה מגיע לאפס בנקודת המסלול של נמטודות הנמוכה. בשלב זה, את התולעת חייבת להיות כוח כלפי מעלה כדי לשחות למעלה. שיטה זו יכולה להיות שונה בכמה דרכים. כל מינים מיקרוסקופיים שמנווט בנוזל שקוף ניתן לעקוב באמצעות SWSI. ניתן לבצע מחקרים עם כל אורכי גל שאינם נגישים למצלמות דיגיטליות. מצלמות דיגיטליות בדרך כלל יאספו את אורכי גל הנעים מ-UV אל IR הקרוב. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים אופקיים על ידי הפניית הלייזר אנכי כלפי מעלה. אז יכולים להיות ממוקמים המינים על משטח שקוף אופקי, כמו שקופיות מיקרוסקופ. התאמת ההרחבה הקרן או בעדשת המגדלת אחרי ההרחבה הקרן יכולה לחדד תמונות מטושטשות. המשתמש צריך להיות בטוח כדי להדק את כל הרכיבים לשולחן, כדי להבטיח יישור קורה עקבי וקל. השיטה היא מוגבלת על ידי wavelengt לייזר זמיןhs ורזולוציה. בעיקרו של דבר את היתרונות של שיטה זו על פני מיקרוסקופים קיימים, שהן הגמישות בכיוונים ואורכי גל, גם חולשות מאז ההתקנה היא פשוטה. אופטיקה והכתמים לא מתוחכמים של הלייזר מגבילים את הרזולוציה. כמה מהחסרונות הללו בהחלט יכולים להיות שיפור בעתיד על ידי כולל מסנן המרחבי ומקרין את התמונה ישירות על גבי מצלמה CCD. בקלות ניתן ללמוד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול כניסוי מתבצע בפעם הראשונה. הצבת נמטודות בקובט מבלי ליצור מערבולת היא קריטית. כמו כן, תנודות עלולות להפריע להתקנה ומשנות את התנהגותם של התולעים. הקפד להגביל את הכוח, המשמש לצל תמונה. 2 mW לקרן לייזר שהיא 1 מ&quot;מ קוטר צריך להיות המקסימאלי כדי למנוע תופעות חימום. ההתקנה צריכה להיבדק לפיזור לוואי בעת שימוש בנוזלים אחרים מלבד מים מזוקקים. רוב מ &#39;נכון לעכשיוicroscopes פועל על מישור אופקי באמצעות מסנני אור או בצבע לבן, שהם עדיין רחבים מאוד בטווח אורכי הגל. מיקרוסקופים שבאמת משתמשים באורכי גל בודדים ויש לי גמישות בתרחיש הצפייה, כלומר מיקום אופקי, מוגבלים בדרך כלל לטובה אחד או אחרת. כמו כן, אלו סוגים של מיקרוסקופים הם בדרך כלל יקרים מאוד ועדיין מוגבלים למטוסי מוקד בניגוד לשיטה שלנו. ההתקנה שלנו בקלות יכולה להיות בנויה עם תקציב נמוך ביותר. שיטה זו היא מוכנה לשימוש על ידי בתי ספר, חברות סביבתיות, כמו גם גופים אחרים הפועלים במימון קטן. בעתיד, בשיטה זו ניתן להשתמש בהגדרה מאוד מתוחכמת כדי לחקור תופעות בזמן אמת על התנועה וmechanosensation של מינים מיקרוסקופיים. שיטה זו הופכת את מחקרי אורך גל יחיד במגוון רחב של זוויות ועומקי צפייה זמינים בקלות.

elegans Caenorhabditis הוא נמטודות קרקע מועילות חיים חופשיות שהיא אורגניזם מודל רב עוצמה ללימוד מנגנונים של ויסות הגנים, פיתוח ולאחרונה להבנת ביולוגיה והתנהגות חושיות. למרות שיש רק 302 נוירונים, ג elegans מסוגל תבניות מורכבות locomotory, התנהגויות רבייה, ניווט, chemotaxis והרבה התנהגויות אחרות. ג elegans להחזיק מכאני, chemoreceptors ואפילו לזהות אורכי גל כחולים של אור (וורד et al. 2008) 1. בעוד הרבה ידוע על המעגלים העצביים של תפקוד חושי ודפוסי locomotory כלליים בג elegans, פחות ידוע על התגובות לגירויים מרובים, בו זמנית, או תנאי סביבה מורכבים יותר ממה יכול להיות מודל תחת מיקרוסקופ. כמה מחקרים גילו דפוסי locomotory מורכבים יותר, כי הם 2,3,4 פלסטיק מאוד. הגישה המתודולוגית שלנו תאפשר לימודים של nematodes בפתרון בזמן אמת שבו אנחנו בקלות יכולים לספק תנאי סביבה מרובים בו זמנית. שאלה זו קשה לתת מענה תוך שימוש בטכניקות הדמיה המבוסס על מיקרוסקופ קונבנציונליות. פיתחנו טכניקת הדמיה המאפשרת לנו למקם את נמטודות בתוך עמודת מים לבחון התנהגויות locomotory, כמו גם לקבוע את היכולות של נמטודות לשנות תנועה בתגובה לתנאים סביבתיים שונים. אורך גל יחיד צל ההדמיה (SWSI) מוצגת במאמר זה בפעם הראשונה כדי לענות על החסרונות של מיקרוסקופים מסורתיים. מיקרוסקופים מסורתיים מוגבלים לתצפיות במינים במישור מוקד אופקי מיקרונים אחדים בעומק 5,6. לגבי מחקרי אורך גל יחיד, רוב מיקרוסקופים מסורתיים להשתמש במסנני צבע כדי לסנן אור לבן באופן כללי מאוד, בדרך כלל, ננומטר 50-100. שימוש בליזר לSWSI מצמצם את בחירת אורך הגל לננומטר פחות מ 1, תוך שמירה על סימןעוצמת אור ificant 7. באופן דומה, באורכי גל בודדים היה בשימוש כדי למדוד תדרי חייה של ג elegans בזמן אמת 8. להפגנה הראשונה של השיטה שלנו, אנו עוקבים אחר המצב האופקי, x, והמצב האנכי, y, של ג שוחה בחופשיות elegans בעמודת מים, על פני מרחק של כ סנטימטר. בפרט, אנו מעוניינים בתנועה האנכית מאז הכבידה פועל גם בצורה אנכית. שיפוע ליניארי מתאים למצב האנכי נותן את המהירות האנכית, y v, של נמטודות כפי שהוא יורד בעמודת המים: <img alt="נוסחה" fo:content-width="0.5in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq1.jpg" width="50" /> (1) שורש ממוצע ריבוע של השגיאה (RMSE) 9 מציין את האיכות של הכושר ומציין אם המהירות יורד בדרך כלל קבועה. אז המהירויות האנכיות בממוצע לEACמיני שעות ותולעים מתים. שימוש בתוצאות הללו, דראג, שניסיון התולעים יכול להיות מוערך. להפגנה השנייה של השיטה שלנו, בחרנו ג elegans שלא ירד בקצב קבוע שלא כמו רוב התולעים שנצפו. התולעים שנבחרו או הסתובבו ושחו כלפי מעלה או ריחפו במשך זמן מה לפני שאמשיך בירידה. מבחינה פיזית, מקרה זה מראה שהדחף של מיקרואורגניזם שחייה יכול להיות מחושב. חוקי ניוטון להכתיב כי גוף שמשנה כיוונים מאיץ, מה שמרמז על כוח שקול, <img alt="פורמולה 1" fo:content-width="0.3in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq.jpg" width="25" /> , הוא הפועל על הגוף ש10: <img alt="פורמולה 2" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq2.jpg" width="70" /> (2) איפה <img alt="עמ &#39;" fo:content-width="0.1in" src="/files/ftp_upload/51424/51424p.jpg" width="10" /> הואאת המומנטום ולא ליניארי הוא זמן. ההאצה של התולעת עומד ביחס ישר לכח הפועל על התולעת מאז המסה של התולעת נשארת קבועה. כתוצאה מכך, הכח השקול האנכי הוא: <img alt="פורמולה 3" fo:content-width=".8in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq3.jpg" width="70" /> (3) כאשר m הוא המסה של תולעת וy מייצג את התאוצה האנכית. הכח השקול בכיוון האנכי מייצג אז דחף התולעת באותו הכיוון. הדחף הכולל ניתן לחשב על ידי לקיחת הרכיב האופקי בחשבון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="852">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:375px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tunable Helium-Neon laser&#160;</td>
			<td>Research Electro-Optics</td>
			<td>30602</td>
			<td>Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2 Front Surface Aluminum Mirrors</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-F01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Speed Exilim Camera</td>
			<td style="width:143px;">Casio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:143px;">Starna Cells</td>
			<td style="width:119px;">21/G/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LoggerPro (Software)</td>
			<td style="width:143px;">Vernier</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.vernier.com/products/software/lp/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mathematica 8</td>
			<td style="width:143px;">Wolfram</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.wolfram.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;5x &#8211; 10x variable zoom Galilean beam expander</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td>BE05-10-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LA1257</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single wavelength shadow imaging of caenorhabditis elegans locomotion including force estimates

מחקר זה מדגים טכניקה זולה ופשוטה המאפשרת המדידה של תכונות פיזיות כגון מיקום, מהירות, תאוצה וכוחות מעורבים בהתנהגות locomotory של נמטודות המושעית בעמודת מים בתגובה לאורכי גל בודד של אור. אנו מדגימים כיצד להעריך את התנועה של האורגניזם מיקרוסקופי באמצעות יחיד אורך גל צל הדמיה (SWSI) באמצעות שתי דוגמאות שונות. הדוגמא הראשונה היא מחקר שיטתי ובר קיימא מבחינה סטטיסטית של הירידה הממוצעת של ג elegans בעמודת מים. במחקר זה, שהשתמשנו חיים וג wildtype המת elegans. כאשר השווינו את המהירות וכיוון התנועה פעילה נמטודות עם מוצא הפסיבי של תולעים מתים בתוך השדה כבידה, מחקר זה לא הראה שום הבדל במוצא-פעמים. הירידה הממוצעת הייתה 1.5 מ&quot;מ / שנייה ± 0.1 מ&quot;מ / שנייה עבור שניהם את התולעים חיים ומתים באמצעות 633 ננומטר קוהרנטיתאור. הדוגמא השנייה היא מקרה של ג פרט בחר elegans שינוי הכיוון במהלך הירידה בעמודת מים אנכית. תאוצה וכוח הם נותחו בדוגמא זו. מקרה זה מדגים את ההיקף של תכונות פיזיות אחרות שיכול להיות מוערכת באמצעות SWSI תוך הערכת ההתנהגות באמצעות אורכי גל יחיד בסביבה שאינה נגיש לעם מיקרוסקופים מסורתיים. שימוש בניתוח זה אנו מוערכים נמטודות אדם מסוגלת לדחוף בכוח עודף של 28 NN. הממצאים שלנו מצביעים על כך שנמטודות חיים להפעיל 28 ננ בעת ההפעלה, או ההעברה נגד השדה הכבידה. הממצאים מראים עוד כי נמטודות יורדת באופן פסיבי בעמודת מים, אך באופן פעיל יכולים להתנגד לכח הכבידה בעיקר על ידי הפיכת כיוון.

Descent היציב החקירה הראשונה מראה שום הבדל להבחין בשיעורי יורד מג elegans במהלך SWSI באמצעות 633 ננומטר. השיעורים יורד נמצאו קבוע ב1.5 מ&quot;מ / השני ± 0.1 מ&quot;מ / השני לחיים וג מת שניהם elegans. גודל מדגם של 50 תולעים שנוצר שונות סבירות של 7% לשניהם חיים ותולעים מתים. אין תאוצה הפועלת על התולעים שכן המהירות יורד הוא קבועה, כך שהכח הגרר שווה לכוח הכבידה מינוס כוח העילוי. משמעות הדבר הוא כי הצפיפות של התולעת היא מעט גדולה יותר מזה של מים; עם זאת, להערכות שמתחתיו הוא עדיין מעשי להניח שהצפיפות של נמטודות היא בערך זה של מים. כיוון שינוי החקירה השנייה, מקרה מבחן, מוכיחה כי נמטודות מסוגלות לשנות כיוון ויכולות לשחות כלפי מעלה נגדכוח הכבידה. שתי עקומות הותאמו לתזוזה האנכית של נמטודות, כך שנגזר השני של עקומות אלה יכולים להיות splined גרף תאוצה לעומת זמן (איור 5). &#160; רצוי לשמור על סדר הפולינום נמוך ככל האפשר, תוך שמירה על כושר טוב. סדר הפולינום נמוך מצביע פחות וריאציה בתאוצה לאורך זמן. מבחינת פולינום מהסדר גבוה יותר יהיה זניח, ולכן מיותר, אם הצו של הפולינום הוא גבוה מדי. תולעת זו מאיטה בקצב קבוע של 0.110 מ&quot;מ / שנייה 2 ± 0.002 מ&quot;מ / שנייה 2, מסתובבת ומאיץ באותו קצב 0.110 מ&quot;מ / שנייה 2 ± 0.002 מ&quot;מ / שנייה 2 לזמן קצר לאחר נקודת התפנית. ג elegans ממשיך לנוע כלפי מעלה בתאוצה הולכת ופוחתת של 1.252-.00708 לא במ&quot;מ / השני 2 עד ההאצה נופלת לאפס. שמירה על Eq נפש. 3, ומסת תולעת המשוערת של 3 &amp; #956; גרם, התולעת עוברת כוח אנכי נטו, F Ny, של 0.33 pN עד זמן קצר לאחר נקודת התפנית. Descent: ישנם שלושה סוגים של כוחות הפועלים על התולעת עד התולעת מגיעה לנקודת התפנית: כבידה, גרר, כוח העילוי ודחף (איור 6 א). הכח השקול שווה לסכום הווקטורים של כל שלושת הכוחות. כאן אנו רואים את המרכיבים האנכיים בלבד: F Ny = G F Dy + F Ty-F + F B (4) כאשר F B הוא כוח העילוי. ו ז שווה בגודל אך הפוך בכיוון לכוח העילוי בהנחה שהצפיפות של התולעת היא זה של מים. EQ. 4 אז יכולים להיות כתובים באופן הבא: F = Ny F Dy + F טאי (5) F Ny נשאר קבוע במהלך הירידה. משמעות הדבר הוא כיF Dy + F טאי נשאר קבוע עד לנמטודות מגיעה לנקודת המפנה. F Dy הוא הגדול ביותר בחלקו העליון, המהווה את תחילתו של השביל, ומפחית בהדרגה לאפס עד למהירות היא אפס בנקודת התפנית ואילו F טיי חייב להגדיל כדי לשמור קבוע F Ny. תפנית: אין כוח גרר בכיוון האנכי בנקודת התפנית מאז את המהירות האנכית שווה אפס בשלב זה. רק הכוחות הפועלים בכיוון האנכי הם כוח הכבידה, - g F, ציפה, F B ודחף התולעת האנכי, F טאי, כמתואר באיור 6 ב. בשלב זה, הדחף של ג ניתן לקבוע elegans: F = F טאי Ny (6) הדחף בחלק התחתון של המסלול הוא אז שווה פחות או יותר ל0.33 PN, שזה בערך 0.001% מהמשקל של התולעת. אם ניקח בחשבון שהמשקל המשוער, G F של ג elegans הוא 28 NN, אסנט: בדומה לכך, במהלך העלייה, עליית דראג אבל הוא הצביע כלפי מטה (איור 6 ג): F = Ny-F Dy + F טאי (7) הדחף מיושם על ידי התולעת חייב עכשיו להיות אפילו גדול יותר ושווה לסכום של כוח הגרר והמשקל. התולעת היא להאט לאחר מתחיל לשחות. לשחות עד באותו קצב כמו התולעת ירדה, התולעת הייתי צריכה להפעיל דחיפה כלפי מעלה של לפחות פעמיים במשקל שלה. רחיפה דוגמא לתולעת שמאטה את הירידה שלה לשנייה על 3 מוצגת באיור 7. &#160; פולינום תואר 3 rd הוא בכושר סביר לשביל הכולל. השגיאות בתאוצה ומהירות מכושר זה הן פחות מ 15%. התולעת מתחילה עם upwa משמעותי<html> דחף rd, מאט ומתחיל להסתובב ב68 שניות; עם זאת, ההאצה כלפי מעלה יורדת ברציפות (איור 8) &#160; עד ההאצה נטו שווה לאפס סביב 68.5 שניות. זה סופו של דבר מוביל להאצה נטו בכיוון מטה ואחריו אפס נקודה אחרת במהירות (איור 9) &#160; ונמטודות מתחילה לרדת שוב ב69 שניות. זה מעניין, כי את התאוצה האנכית שנצפתה המקסימלי במקרה זה היא 2.7 מ&quot;מ / שנייה 2. ההאצה בנקודות המפנה הן 0.455 מ&quot;מ / השני 2 ו - 0.455 מ&quot;מ / שנייה 2, בהתאמה; כארבעה פעמים גדולות יותר מאשר במקרה של נמטודות שמסתובבת ושוחה למעלה. באמצעות EQ. 6, זה ניתן להעריך כי הדחיפה כלפי מעלה היא כ 1.32 pN בנקודת המפנה הראשונה. בנקודת המפנה השנייה, האצה נטו היא שלילית, כך שהדחיפה כלפי מעלה היא 1.32 PN. <html> o: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1.jpg" /> איור 1. התקנה ניסיונית. הלייזר, ההרחבה קרן, העדשה והמסך הם חיוניים להגדרת הניסוי. מראות ההיגוי והנקבים עלולות להיות מושמטים, אבל יעשו את היישור האופטי פחות יציב. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2.jpg" /> איור 2. תמונת יחידה אורך גל צל (SWSI). באמצעות 2 mW של 543 אור לייזר ננומטר הצל של תולעת מוקרנת על מסך. התמונה היא הפוכה, כך שנמטודות מופיעה ליפול כלפי מעלה. &quot;Src =&quot; 424/51424fig3highres.jpg / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. אנכי ירידה של ג wildtype אחת elegans בעמודת מים. נמטודות זה מוצל על ידי אור קוהרנטי 633 ננומטר. שיפוע המתאים ליניארית מצביע על מהירות כלפי מטה של 1.09 מ&quot;מ / השני ± 0.01 מ&quot;מ / השני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4.jpg" /> איור 4. גרף תזוזה של ג wildtype בודד כלפי מעלה שחייה elegans. שני התקפי splined לזהות את הנתיב הכללי של נמטודות. הנגזרת השנייה של הכושר מגלה את התאוצה. ההאצה המרבית נקבעה בקלות מההתקף הראשון: 0.110 מ&quot;מ<html> / השני 2 ± 0.002 מ&quot;מ / שנייה 2. רק כמה ברים שגיאה מוצגים כך שנקודתי נתונים והכושר יישארו גלויות. נמטודות זה מוצל על ידי אור קוהרנטי 633 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5.jpg" /> גרף איור 5. ההאצה של ג wildtype אחת elegans. נמטודות זו שומרת על תאוצה כלפי מעלה קבועה של 0.110 מ&quot;מ / השני 2 ± 0.002 מ&quot;מ / שנייה 2 גורמת לו להאט ולאחר מכן להעביר כלפי מעלה. זמן קצר לאחר נקודת תפנית האצה יורדת בהתמדה והאצה נטו מפחיתה לאפס.<html> g &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6.jpg" /> תרשימי איור 6. חיל לירידה, נקודת מפנה ועלייה. חוק ארכימדס וכוח הכבידה שווים בגודל והפוך בכיוון, כך שההשפעה של כוחות אלה מבטלים זה את זה. לכן הם לא מוצגים בתרשימים אלה. () התולעת היא יורדת עם גרור ודחף כלפי מעלה. (ב) התולעת היא בנקודה של המסלול ללא גרר הנמוכה. הדחף הוא מצביע למעלה. (ג) התולעת עולה עם גרור כלפי מטה ואילו הדחף הוא כלפי מעלה. &quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg &quot;/&gt; איור 7. גרף תזוזה של נמטודות המרחפת אחת. התולעת מאטה ומתחילה להסתובב בכ 68 שניות אבל מתחילה יורדת סביב 69 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8.jpg" /> .. איור 8 גרף ההאצה של נמטודות המרחפת אחת תולעת זו מתחילה עם האצה כלפי מעלה של 2.7 מ&quot;מ / שנייה 2, יורדת לאפס וסופו של דבר יש לו תאוצה כלפי מטה של -. 2.6 מ&quot;מ / שנייה 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בvers גדול יותר</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9.jpg" /> איור 9. גרף מהירות של נמטודות המרחפת אחת. תולעת זו מגיעה לעצירה ב68 שניות ומתחילה לעמוד בראש כלפי מעלה, מאטה ומגיעה למהירות אפס בכיוון האנכי ב69 שניות ואחריו ירידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="טבלת 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424table1.jpg" width="400" /> טבלת 1. מהירויות ירידה ממוצעת של N2 ג elegans. 50 חיים ו50 נמטודות מתות tracked במהלך ירידתם. המהירות הממוצעת לירידות היא אותה לחיים ותולעים המתים: 1.5 מ&quot;מ / השני ± 0.1 מ&quot;מ / השני.

Watch this Scientific Journal Video about Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates at JoVE.com

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

הטכניקה המוצגת כאן מודדת את דרכו של שחייה באופן חופשי מינים מיקרוסקופיים באמצעות חשיפת אורך גל יחידה. ג elegans משמשים כדי להדגים הדמיה צל כחלופה זולה למיקרוסקופים יקרים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי להתאים את אוריינטציות, סביבות ומינים שונות כדי למדוד את הכיוון, מהירות, תאוצה וכוחות.

אחת אורך גל צל הדמיה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; נידות כולל כוח אומדנים

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

single-wavelength-shadow-imaging-caenorhabditis-elegans-locomotion

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Unit 1

Newton's Laws of Motion

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  Vassar College.  הטכניקה המוצגת כאן מודדת את דרכו של שחייה באופן חופשי מינים מיקרוסקופיים באמצעות חשיפת אורך גל יחידה. ג elegans משמשים כדי להדגים הדמיה צל כחלופה זולה למיקרוסקופים יקרים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי להתאים את אוריינטציות, סביבות ומי...

Video: Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

נקודות קוונטיות קומפקטיות להדמית מולקולה בודדה

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

מיקרוסקופית כוח האטומי של אורות אדומים קולטני אור שימוש במיפוי PeakForce כמותי nanomechanical נכס

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Preparation and Friction Force Microscopy Measurements of Immiscible, Opposing Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low friction at the interface. Nevertheless, these systems can be sensitive to wear due to interdigitation of the opposing brushes. In a recent publication, we have shown via molecular dynamics simulations and atomic force microscopy experiments, that using an immiscible polymer brush system terminating the substrate and the slider surfaces, respectively, can eliminate such interdigitation. As a consequence, wear in the contacts is reduced. Moreover, the friction force is two orders of magnitude lower compared to traditional miscible polymer brush systems. This newly proposed system therefore holds great potential for application in industry. Here, the methodology to construct an immiscible polymer brush system of two different brushes each solvated by their own preferred solvent is presented. The procedure how to graft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) from a flat surface and poly(methyl methacrylate) (PMMA) from an atomic force microscopy (AFM) colloidal probe is described. PNIPAM is solvated in water and PMMA in acetophenone. Via friction force AFM measurements, it is shown that the friction for this system is indeed reduced by two orders of magnitude compared to the miscible system of PMMA on PMMA solvated in acetophenone.

The methodology to perform friction force microscopy experiments for contacting brushes is presented: Two polymer brushes that are grafted from (a) substrates and (b) colloidal probes are slid to show that, by using two contacting immiscible brush systems, friction in sliding contacts is reduced compared to miscible brush systems.

מדידות הכנה וחיכוך מיקרוסקופית כוח של immiscible, המתנגדות למברשות פולימר

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus have potential applications in nonlinear optics, which requires extraordinary optical intensity. One of the most studied nonlinearities in plasmonics is nonlinear absorption, including saturation and reverse saturation behaviors. Although scattering and absorption in nanoparticles are closely correlated by the Mie theory, there has been no report of nonlinearities in plasmonic scattering until very recently. 
Last year, not only saturation, but also reverse saturation of scattering in an isolated plasmonic particle was demonstrated for the first time. The results showed that saturable scattering exhibits clear wavelength dependence, which seems to be directly linked to the localized surface plasmon resonance (LSPR). Combined with the intensity-dependent measurements, the results suggest the possibility of a common mechanism underlying the nonlinear behaviors of scattering and absorption. These nonlinearities of scattering from a single gold nanosphere (GNS) are widely applicable, including in super-resolution microscopy and optical switches. 
In this paper, it is described in detail how to measure nonlinearity of scattering in a single GNP and how to employ the super-resolution technique to enhance the optical imaging resolution based on saturable scattering. This discovery features the first super-resolution microscopy based on nonlinear scattering, which is a novel non-bleaching contrast method that can achieve a resolution as low as l/8 and will potentially be useful in biomedicine and material studies.

Saturable and reverse saturable scattering were discovered in isolated plasmonic particles and adopted as a novel non-bleaching contrast method in super-resolution microscopy. Here the experimental procedures of detecting and extracting nonlinear scattering are explained in detail, as well as how to enhance resolution with the aid of saturated excitation microscopy.

מדידת פיזור אי-לינאריות מNanoparticle Plasmonic יחיד

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due to fundamental constraints imposed by the hyperpolarized state, exotic imaging and reconstruction techniques are commonly used. A practical system for characterization of dynamic, multi-spectral imaging methods is critically needed. Such a system must reproducibly recapitulate the relevant chemical dynamics of normal and pathological tissues. The most widely utilized substrate to date is hyperpolarized [1-13C]-pyruvate for assessment of cancer metabolism. We describe an enzyme-based phantom system that mediates the conversion of pyruvate to lactate. The reaction is initiated by injection of the hyperpolarized agent into multiple chambers within the phantom, each of which contains varying concentrations of reagents that control the reaction rate. Multiple compartments are necessary to ensure that imaging sequences faithfully capture the spatial and metabolic heterogeneity of tissue. This system will aid the development and validation of advanced imaging strategies by providing chemical dynamics that are not available from conventional phantoms, as well as control and reproducibility that is not possible in vivo.

A multi-compartment dynamic phantom is used to simulate some biology of interest for metabolic studies using hyperpolarized magnet resonance agents.

שימוש פנטום אנזים יחיד דינמי רב-תא ללימודים של סוכני תהודה מגנטית Hyperpolarized

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

הדמיה ברזולוציה משנה ננומטר עם מיקרוסקופית כוח אטומי משרעת אפנון בנוזל

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Measurement of Quantum Interference in a Silicon Ring Resonator Photon Source

Silicon photonic chips have the potential to realize complex integrated quantum information processing circuits, including photon sources, qubit manipulation, and integrated single-photon detectors. Here, we present the key aspects of preparing and testing a silicon photonic quantum chip with an integrated photon source and two-photon interferometer. The most important aspect of an integrated quantum circuit is minimizing loss so that all of the generated photons are detected with the highest possible fidelity. Here, we describe how to perform low-loss edge coupling by using an ultra-high numerical aperture fiber to closely match the mode of the silicon waveguides. By using an optimized fusion splicing recipe, the UHNA fiber is seamlessly interfaced with a standard single-mode fiber. This low-loss coupling allows the measurement of high-fidelity photon production in an integrated silicon ring resonator and the subsequent two-photon interference of the produced photons in a closely integrated Mach-Zehnder interferometer. This paper describes the essential procedures for the preparation and characterization of high-performance and scalable silicon quantum photonic circuits.

Silicon photonic chips have the potential to realize complex integrated quantum systems. Presented here is a method for preparing and testing a silicon photonic chip for quantum measurements.

מדידה של Quantum הפרעות מקור פוטון מהוד טבעת הסיליקון

Silicon photonic chips have the potential to realize complex integrated quantum information processing circuits, including photon sources, qubit ...

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog proportional-integral-derivative (PID) system to apply controlled-force protocols on cylindrical protein-based hydrogel samples, which are tethered between a linear voice-coil motor and a force transducer. During operation, the PID system adjusts the extension of the hydrogel sample to follow a predefined force protocol by minimizing the difference between the measured and set-point forces. This unique approach to protein-based hydrogels&#160;enables the tethering of extremely low-volume hydrogel samples (&#60; 5 &#181;L) with different protein concentrations. Under force-ramp protocols, where the applied stress increases and decreases linearly with time, the system enables the study of the elasticity and hysteresis behaviors associated with the (un)folding of proteins and the measurement of standard elastic and viscoelastic parameters. Under constant-force, where the force pulse has a step-like shape, the elastic response, due to the change in force, is decoupled from the viscoelastic response, which comes from protein domain unfolding and refolding. Due to its low-volume sample and versatility in applying various mechanical perturbations, force-clamp rheometry is optimized to investigate the mechanical response of proteins under force using a bulk approach.

A new force-clamp rheometry technique is used to investigate the mechanical properties of low-volume protein-based hydrogel samples tethered between a voice-coil motor and a force sensor. An analog proportional-integral-derivative (PID) system allows for the &#39;clamping&#39; of the force experienced to the desired protocol.

. מלחציים צולבים כוח Rheometry על אפיון Hydrogels מבוססי חלבונים

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog ...