אנו מודים לד&quot;ר מגדלנה גץ לקלט שלה במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אנו מודים לד&quot;ר מריוס Wernig (אוניברסיטת סטנפורד) לנדיבות לתת לנו את רצף קידוד Sox2. אנחנו גם מאוד מודים לד&quot;ר אלכסנדרה Lepier לייצור וירוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) וBMBF (01GN1009A) ל-BB, והמשרד הבווארית הממלכתי למדעים, מחקר והאמנויות לח&quot;כ וBBCs קיבלו מימון מSYSTHER-דו לאומי מכון INREMOS וירטואלי (משרדי חינוך והמחקר הפדרליים גרמנים וסלובניים) וDFG (SFB 824).

1. בידוד וCulturing של תאים בוגרים מוח האנושי ניסויים מעורבים רקמה אנושית יש לבצע בהתאם לכל תקנות ממשלתיות ומוסדיות הרלוונטיות בנוגע לשימוש בחומר אנושי למטרות מחקר. הפרוטוקול הנוכחי פותח בהתאם לאישור על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במינכן LMU וכתב הסכמה מדעת מכל החולים. פרוטוקול זה של תרבויות הכנה של האדם בוגר קליפת המוח כבר נקבע באמצעות דגימה של חולים משני המינים הסובלים מאפילפסיה של אונה הרקתית או נגעים אחרים עמוקים לא טראומטיים, שאינם ממאירים. הרקמה המתקבלת מחדר הניתוח המורכב אך ורק את ערוץ הגישה לפגיעה המוחית ולכן נחשבת בריאה. טווח הגילים של המטופלים היה 19-70 שנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום גידול על ידי הוספה עוברי עגל בסרום חום מומת(FCS) לגלוקוז גבוהה DMEM עם Glutamax להשיג ריכוז סופי של FCS 20%. הוסף 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין לסך של 500 בינוני מיליליטר צמיחה. לבצע את זה וכל הצעדים הבאים דורשים תנאים סטריליים תרבות בזרימה למינרית מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על הביופסיה במוח האנושית הבוגרת שהתקבלה מחדר הניתוח בתמיסת מלח מאוזן &quot;הנקס עם CaCl 2 וMgCl 2 בינוני (HBSS) כוללים HEPES (ריכוז סופי 10 מ&quot;מ) על קרח עד לעיבוד. להתחיל בעיבוד בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל דיסוציאציה לתוך תאים בודדים, להעביר את הרקמה לתוך צלחת פטרי 65 מ&quot;מ וברר לחתיכות קטנות על ידי שימוש בשני סכינים לשימוש יחיד סטרילי. לעיכול אנזימטי להשתמש 3-6 מיליליטר TrypLE בצינור חרוטי 15 מיליליטר ו דגירה של 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח של מדיום גידול prewarmed כדי להקל על ניתוק ובעדינות triturate התמיסה המכילה חתיכות רקמה למעלה ולמטה על ידי השימוש הראשון5 מיליליטר פיפטה חד פעמית, ואחריו בעזרת פיפטה פסטר זכוכית עד הומוגניזציה של ההשעיה התא. בדרך כלל, כמה חתיכות רקמת שייר, בעיקר מורכבות מחומר לבן, יישארו בהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב157 XG במשך 5 דקות וresuspend את הכדור בכמות המתאימה של מדיום גידול (10 מיליליטר לבקבוק תרבות T75 ללא ציפוי). השתמש בבקבוק תרבות T75 אחד לביופסיה של 5-10 מ&quot;מ קוטר בגודל ובלהסיק מכך במקרה של דגימות גדולות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח תאים לתוך חממת 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף מחצית בינונית בכל 3-4 ימים עד תאים הגיעו confluency. זה בדרך כלל לוקח עד שבועיים (המכונים [P0] מעבר 0). </li></ol> 2. במבחנה התרחבות ואפיון של תאים בוגרים מוח האנושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהרחבת מבחנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום התרבות ולשטוף עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), המשיך בt החדרemperature, לפני הוספת 3 TrypLE מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות עד שרוב התאים מנותקים. לטפוח בעדינות את צלוחיות כדי להקל על הסרת התאים; בעקבות תוספת של 3 כרכים של מדיום גידול, העברת התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר וספין למטה ב157 XG במשך 5 דקות ו resuspend התאים בכמות המתאימה של מדיום גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר התאים ביחס של 1:3 לתשואה אופטימלית לתוך צלוחיות תרבית תאי T75 חדשות. הערה: יש לנו passaged תאים אלה עד P5 ללא כל סימנים של יעילות תכנות מחדש מופחתת. בעוד בP0 התרבות מכילה חלק ניכר של תאי האנדותל (כפי שהוערך על ידי ביטוי CD34), בקטעים שלאחר מכן מספרם הופך להיות זניח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיון של תרבויות מוח אנושיות בוגרות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunocytochemistry: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיון של תאים, זרעים ~ 60,000 תאים על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליקה ב500 μl mediu גידול הטרימ &#39;בצלחות תרבית רקמת 24 גם לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח immunocytochemical של תאי המוח האנושיים בתרבית להסיר את המדיום ולשטוף 3x עם 1 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 500 μl של paraformaldehyde 4% ב-PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כיסוי הזכוכית מחליק לתוך תא מכתים humidified מתאים ולחסום עם 80 μl PBS המכיל 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ו0.5% טריטון X-100 במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים עיקריים מדוללים באותו הפתרון (לגורמי דילול ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים) ודגירת הלילה בשעה 4 ° C או 1 שעות בטמפרטורת חדר. הערה: חלק ניכר אבל שונה של התאים בשלב זה של culturing הוא immunoreactive לβ רצפטור נגזר גורם גדילה של טסיות דם (PDGFRβ), מקבץ של בידול 146 (CD146), proteo כונדרואיטין סולפט NG2סוכרים, ויקטין שריר חלק (SMA), סמנים כלומר מאפיין של pericytes הקשורים דם קטן. רק מיעוט (&lt;1%) מבטא את חלבון סמני astroglial גליה fibrillary חומצי (GFAP) וS100β. יתר על כן, בשלב זה את התרבות צריכה להיות נטול כל תאים המבטאים את βIII-טובולין הסמן העצבי. השתמש בשילובי נוגדן ראשוני מרובים לשיתוף תיוג של סמנים שונים. ניתן לקבל אישור נוסף לביטוי של סמני גליה, עצביים, אנדותל וpericyte ידי שעתוק לאחור ותגובה הכמותית זמן אמת שרשרת פולימרז (לא תוארה בפרוטוקול זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עם הנוגדנים הראשוניים לשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS ולהוסיף נוגדנים המתאימים משני (בדילולים המתאימים) לפתרון מכתים ודגירת 1 שעות בטמפרטורת חדר בחושך. לשטוף את התאים 3x עם PBS. במידת צורך, לפני ההרכבה כולל צביעה עם DAPI במשך 5 דקות בחדרטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש antifading הרכבה בינונית ולנתח את התלושים לכסות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence או מיקרוסקופ confocal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometry זרימה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של ביטוי סמן פני השטח באמצעות cytometry זרימה, לגדל תאים לconfluency בT25 ללא ציפוי או צלוחיות תרבית תאי T75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים באמצעות TrypLE כפי שתואר קודם ו resuspend בפתרון מכתים בהיקף של BSA + 0.5% PBS. לכל תגובה מכתים, resuspend תאים ב100,000-200,000 של פתרון מכתים 100 μl. הכן את התגובות מכתים אחד לכל נוגדן משמשות (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, נוגדני שליטת אלוטיפ בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדני fluorochrome מצומדות לכל פתרון מכתים (לדילולים ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים) ישירות לתוך ההשעיה תא דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μl PBS וספין למטה בין כלשלב כביסה ב157 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 0.5-1 מיליליטר פתרון מכתים ותאי העברה דרך מסננת תא (70 מיקרומטר) לצינורות FACS. הגנה על המדגם מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות ורטקס לפני הצבתם במכשיר FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את תאי חיים ואינם כולל אגרגטים פסולת וסלולריים, שער לFSC-SSC ו-. duplets התא מגודרת החוצה במיוחד על ידי FSC-וFSC-W. כדי לקבוע את תנאי gating הנכונים עבור הסמנים פני התא להגדיר את השערים עם שליטת נוגדנים מתאים אלוטיפ מצומדת לfluorochrome בהתאמה. לאחר מכן לקבוע את חלקם של תאים הנכנס נוגדנים. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. העשרה לתאים שמקורם בpericyte ידי תא הקרינה מיון פעיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את אוכלוסיית תא pericyte (resuspended במדיום גידול) לפני התמרה באמצעות FACS מיון באמצעות זרבובית 70 מיקרומטר. השתמש CD34-APC בשילוב עם CD140b-PE ו-CD146 FITC כדי לבחור עבור pericytes. מיון ל, תאי CD140b, וCD146-CD34 חיוביים שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים ממוינים במדיום גידול וצלחת על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליק בצלחות תרבית רקמת 24 גם לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר המיון להחליף את המדיום עם מדיום גידול טרי ולבצע התמרה כפי שתוארו בפרוטוקול 4. </li></ol> 4. Retroviral התמרה של תאים שמקורם בpericyte ותכנות מחדש לנוירונים מושרה הערה: עיין בהנחיות בטיחות ביולוגיות מקומיות בעת טיפול בחלקיקי רטרווירלי. בגרמניה השימוש ברטרווירוסים מועסקים כאן דורשים בטיחות ביולוגית ברמה 2. לייצור של חלקיקי רטרווירלי מתייחס לפרוטוקול 6. לבונת רטרווירלי משמשת לתכנות מחדש, עיין Karow et al. (2012). רטרווירוסים היו pseudotyped עם VSV-G (-glyco וירוס stomatitis שלפוחיחלבון) 5. לייצור עיין אל Gavrilescu et 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני זרע התמרה retroviral ~ 60,000 תאים על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליקה ב500 μl מדיום גידול טרי ב24 גם צלחות תרבית רקמה ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את מצע הגידול עם 500 μl מדיום גידול טרי, prewarmed ולהוסיף 1 μl של supernatants בהתאמה מרוכזת המכיל חלקיקי רטרווירלי (pCAG-IRES-DsRed לשליטה, במיוחד בתקופת הקמת הפרוטוקול במעבדה), pCAG-ascl1 -DsRed IRES, pCAG-Sox2-IRES-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לאחר מכן, להסיר את המדיום כולל חלקיקים נגיפיים מהתאים ולהוסיף 1 מיליליטר טרי, prewarmed בינוני B27-בידול, מורכב מ49 מיליליטר גלוקוז גבוהה DMEM עם Glutamax ותוספת סרום ללא 1 מיליליטר B27. לשמור על התאים בתרבית על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ו -5% O 2 במשך 4-8 שבועות מבלי לשנות את המדיום כמדיום שינויים חוזרים ונשנים להיות מזיקים כמו INS להתבגר. </li></ol> 5. אפיון מושרה נוירונים ידי Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את הזהות הסלולרית של תאי transduced, בפרט כדי להדגים את רכישת הפנוטיפ עצבי, לבצע immunocytochemistry נגד אנטיגנים עצביים כגון bIII-טובולין, MAP2, וNeuN (לנוגדנים והדילולים שלהם, ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים ו ציוד; בצע את אותו התהליך כפי שצוין ב2.2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיפור ההבשלה של PdiNs, שיתוף תרבות תאים אלה עם תאי עצב שמקורם בקורטקס מוח עכבר E14. לשם כך, לנתח את קליפת המוח ולנתק את הרקמה באופן מכאני עם הזכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת. הוספת 10,000-50,000 נוירונים עכבריים לתרביות של תאים שמקורם בpericyte 2-3 שבועות הבאים התמרה עם Sox2 וascl1 קידוד מחדשtroviruses ולהמשיך culturing. ניתן להבחין בין תאי transduced מתא העצב עכברי על ידי ביטוים כתב (GFP וdsRed), או על ידי epifluorescence החי או הבא immunocytochemistry עבור ה-GFP וdsRed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את היווצרות של סינפסות על PdiNs ידי נוירונים עכבריים, לבצע immunocytochemistry נגד קולטני הנוירוטרנסמיטר ועי כגון טרנספורטר לפוחי גלוטמט 1 (vGluT1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה תאי transduced לתכונותיהם חשמליות (כלומר יכולת לייצר פוטנציאל פעולה) ואת הקמתה של סינפסות הפונקציונלית על ידי אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק. לפרטים בדבר ההליך לראות היינריך et al. (2011). </li></ol>

<ol>
	<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts.">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li><li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+water+deficit,+ABA,+and+provenances+in+Picea+asperata.">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells.">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li><li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level.">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li><li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts.">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li><li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo.">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li><li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts.">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons.">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts.">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li><li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+cells:+how+to+make+and+define+a+neuron.">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li><li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors.">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li><li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons.">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li><li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons.">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li><li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells.">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li><li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion.">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li><li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable,+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells.">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההתרחבות במבחנה והעשרה של תאי שמקורם pericyte הבאות בידוד מהמבוגרים האנושי קליפת המוח ואת ההמרה שלאחר מכן לאח&quot;י על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של השעתוק העצבי גורמי Sox2 וAscl1. פרוטוקול כזה מספק ניסיוני במערכת מבחנה כדי לחקור את שושלת ההמרה של תאי מוח תושב לנוירונים ובאופן פוטנציאלי גם גליה, עם המטרה בראש לתרגם סופו של דבר גישת המרה הישירה הזה להגדרת vivo במוח הבוגר. שיקולים טכניים במחקר שלנו אנחנו מנוצלים רקמת מוח אנושית מחולים בגילים שבין 19 ו70 שנים, משני המינים. אנחנו לא מבחינים בהבדל גלוי ביעילות תכנות מחדש בהתאם למין או גיל 7. מומלץ בכל זאת לתעד את המידע הזה כהבדלים דקים יותר עשויים להיות בכל זאתציין כי נמלט תשומת לבנו. מומלץ עוד יותר להתחיל בעיבוד מוקדם ככל האפשר לאחר העברת דגימת הרקמה למעבדה. לא יהיו בהכרח חלק נעלמים לכמה זמן את הרקמה נשארה בחדר הניתוח לפני העברה בניסויים. אנו מעריכים כי במחקר שלנו 7 הזמן בין ההסרה מהמוח של המטופל לתחילתו של הליך culturing נע בין 2-6 שעות, עם הדגימות ששמרו כל הזמן על קרח. אין הבדל גלוי בקלות עיבוד שלאחר מכן ולא כל תוצאת לוואי הבחין בתוך חלון הזמן הזה. הערכה ביקורתית לכל פרוטוקול נוגעת הפשטות, שחזור, והיעילות שלה. הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט שבזמן תאי שלב ראשון יורחבו במדיום זול ניתן להשיג בקלות שבו, ואחריו שלב שני של תכנות מחדש של תא רק באמצעות שני fa השעתוקctors ותרבית במדיום מוגדר. לגבי שחזור, אנו ציינו כי האיכות של תכשיר רטרווירוס היא בעל חשיבות עליונה, עם הכנות וירוס כייל נמוכות בשימוש בדילולים כדי להתאים את מספר החלקיקים זיהומיות של וירוסי כייל גבוהים ופעמים רבות תוצאה הכישלון של תכנות מחדש. למעשה אנו ציינו כי אותה תרבות pericyte שבתכנות מחדש נכשל בעבר ניתן הייתה להמיר בהצלחה לאח&quot;י בעת שימוש בוירוסי כייל גבוהים. לגבי יעילות של המרה, יש לנו להעריך את מספר-טובולין החיובי βIII התאים שמקורם ו- Sox2 תאי cotransduced ascl1 באמצעות הדמיה חיות מתמשכת. הדמיה חיה מאפשרת להעריך את מספרם של תאים העוברים חלוקת תא או מוות של תאים במהלך תהליך ההמרה, בעוד מידע מסוג זה הוא חסר כאשר מספר INS נוצר נקבע רק בנקודת הסיום של הניסוי. למעשה שימוש במייקרו וידאו הזמן לשגותעותק (להליך מתייחס לאורטגה דואר t al. 8) זה היה ציין כי תאי transduced גורם untransduced ואחת להמשיך מתרבים, ואילו וSox2-תאי cotransduced ascl1 במהירות לצאת ממחזור התא. יתר על כן, חלק משמעותי של האוכלוסייה זו האחרונה עובר מוות של תאים. בעוד רעילות רטרווירוס לא ניתן לשלול באופן רשמי מהנתונים שהתקבלו במחקר שלנו 7, העובדה שהגדילה את המוות של תאים נצפתה רק כאשר ascl1 באה לידי הביטוי (לבד או בשילוב עם Sox2), אנו מפרשים את זה כראיה לסכסוך קטסטרופלי של גורל תא . אם ניקח שני האירועים הללו בחשבון, אנו מעריכים כי 25% מכל וSox2-תאי cotransduced ascl1 להמיר INS bIII-טובולין החיובי (טבלת 1). כמו שיתוף התמרה דרושה לחלוטין לתכנות מחדש מוצלח, אפשר לשקול העסקת קידוד וקטור ויראלי שני גנים כדי לייעל את כמות התאים המבטאים את שני הגורמים באותוזמן. לאחרונה, Ladewig et al. פיתח פרוטוקול להמרה היעילה של fibroblasts לאח&quot;י קבלת תשואה של 200% באמצעות עיכוב על בסיס מולקולות קטן של קינאז-3β synthase הגליקוגן וSMAD איתות 9. זה יהיה מעניין כדי לקבוע אם תוספות הללו לפרוטוקול שלנו לשפר את התשואה של ייצור PdiN. תוצאה נוספת מעניינת של ההדמיה החיה של תהליך תכנות מחדש נוגעת לעובדה שההמרה של pericytes אדם הבוגר לאח&quot;י מתרחשת בקצב איטי למדי בהשוואה לפרוטוקולי תכנות מחדש דומים בתרביות של תאים סומטיים שונים של מוצא עכבר 4. זה עולה בקנה אחד עם ההבשלה האיטית האופיינית לתאי עצב אנושיים 10. למרות שאנו לא באופן שיטתי ניתחנו את ההשפעה של מתח החמצן בתשואה של ייצור PdiN, אנו ציינו כי דגירה בתנאים נמוכים של חמצן (5%), בדרך כללנתן תוצאות טובות יותר בהשוואה לculturing התאים בתנאי normoxic (21%). לאחרונה, Davila et al. תאר אפקט שיפור דומה על ידי מתח חמצן מופחת לאינדוקציה של אח&quot;י מfibroblasts אדם 11. הפרוטוקול שלנו מבוסס על אספקת רטרווירלי של Sox2 וascl1 תוך פרוטוקולי המרה ישירים אחרים יש מועסקי וקטורים מושרה lentiviral 1, 12, 13. לאחרונה יש לנו גם מיושמים בהצלחה מבני lentiviral דוקסיציקלין המושרה קידוד Sox2 וascl1, המציין כי דופק קצר יחסית (10 ימים) ביטוי Sox2 וAscl1 די בכך כדי לגרום להמרת pericyte לנוירון. רטרווירוסים המשמשים במחקר שלנו 7 נועדו למופחת השתקת 5. בהתאם לכך, אנו לא הבחנו במראה של תאי עצב נטולי ביטוי גן כתב. עם זאת, האפשרות שרמות הביטוי הכוללת של שני transgeneלא ניתן לשלול שינוי של והכתב לאורך זמן. גישות ללא אינטגרציה (ניצול וירוסי Sendai) היו מועסקים בזמן האחרון במקרה של הדור של אבות עצביים הנגרמים 14, אבל זה כרגע לא ידועים אם אסטרטגיות תכנות מחדש אפילו ללא וירוס זה או יכול להיות מיושמים בהצלחה להמיר pericytes האנושי. לבסוף, אם pericytes נגזר מרקמות אחרות יכול לעבור גיור לסוגי תאים עצביים הנגרמים נשאר להיבדק. שיקולים רעיוניים תוצאה קריטית של תכנות מחדש של תאים סומטיים לאח&quot;י נוגעת הפונקציונליות שלהם 15. יש לנו להעריך את המאפיינים של אלקטרו PdiNs בנקודות זמן שונים לאחר תחילתו של תהליך תכנות מחדש. בשלבים מוקדמים מאוד, כלומר 2 שבועות הבאים התמרה retroviral, תערוכת PdiNs בקושי סימנים של רגישות חשמלית, למרות ביטוי βIII-טובולין בשלב זה. לפיכך, רובניתוחי אלקטרו נערכו 4-8 שבועות הבא התמרה עם Sox2 וascl1. כפי שתואר בKarow et al., PdiNs מתאפיין בחוסר בגרה רבה כפי שמשתקף בהתנגדויות קלט גבוהות ותדירות נמוכה של ירי פוטנציאל פעולה. הבשלה נוספת יכולה להיות מקודם על ידי PdiNs שיתוף culturing עם הנוירונים נגזרים מעכבר E14 קליפת המוח. בתנאים אלה, PdiNs תערוכת תדרים גבוהים יותר פעולה פוטנציאליים וזרמי נתרן עלו 7. יתר על כן, coculturing מגלה את היכולת של PdiNs לקבל קלט סינפטי פונקציונלי מתא עצב עכבר. לסיכום, PdiNs רכישת נכסים עצביים פונקציונליים שניתן לשפר עוד יותר על coculturing עם נוירונים אחרים. עם זאת, זה עדיין לא הראה אם ​​PdiNs יכול גם להקים תאי presynaptic פונקציונליים. מחקרים נוספים השתלת PdiNs לתוך המוח יש צורך לחשוף את הפוטנציאל שלהם כדי להגיע לבגרות ופונקציונליות מלאים. Uלשיר Sox2 וascl1 כגורמי תכנות מחדש שציינו שPdiNs וכתוצאה מכך רוכש תכונות של תאי עצב GABAergic 7. מעניין לציין, כי קבוצות אחרות פיתחו פרוטוקולים להמיר fibroblasts לאח&quot;י באמצעות גורם שעתוק שונה ו / או שילוב microRNA וכתוצאה מכך INS פיתוח רכשה מפרט הנוירוטרנסמיטר שונה כגון glutamatergic, דופאמין, והפנוטיפ כולינרגית 1, 16-18. זה עדיין לא בדק האם שילובים גורם בשימוש בfibroblasts לגרום את אותה זהות משדר בPdiNs. יתר על כן, העבודה האחרונה הרחיבה את ספקטרום ההמרה מעבר הנוירוגנזה כדי ליצור תאי גזע עצביים 19, או גליה, בoligodendrocytes מסוימת 21, 22 20. אם פרוטוקולי תכנות מחדש אלה לעורר תוצאה דומה בתאי שמקורם pericyte מבוגר אנושיים במוח, זה יהיה להרחיב את הפנורמה של יישומים ליבוא זה במידה רבהסוג תא נמלת מוח תושב.

בניגוד לתכנות מחדש של תאים הסומטיים לתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs), אשר בתורו ניחן בשפע של פוטנציאל התמיינות, תכנות מחדש ישיר נועד להמרה ישרה של סוג תא ספציפי אחד למשנו. עם כל כבוד ליישום שלהם בהקשר של דוגמנות מחלה וטיפולים מבוססי תאים פוטנציאליים, יש שתי גישות תכנות מחדש יתרונות וחסרונות מסוימים. תכנות מחדש לiPSCs (i) מספק מקור כמעט אינסופי של תאים; (Ii) מאפשר להנדסה גנטית; (Iii) מעניק לך את פוטנציאל התמיינות בלתי מוגבל כמעט. עם זאת, חסרונות עיקריים של iPSCs כרוך הסיכון של tumorigenicity של תאים שלא עברו התמיינות (היווצרות תפלצת in vivo) ואת הצורך בטיפוח vivo לשעבר והשתלה שלאחר מכן, אם תאים אלה הם לשמש לטיפולים מבוססי תאים. לעומת זאת, שושלת תכנות מחדש ישיר מוגבל על ידי התשואה נמוכה יותר של התאים הרצוייםאשר עולה בקנה ישירות עם מספר התאים הממוקדים של האוכלוסייה מתחילה, אבל יש לה את היתרון שתאים לתכנות מחדש שושלת מופיעים לתערוכה לא tumorigenic סיכון על ההשתלה 1,2; יתר על כן, תכנות מחדש ישיר יכול גם להיות מושגת באתרו, כלומר בתוך האיבר שבו תאים אלה יהיו צורך, וכך למנוע את הצורך בהשתלה. עם זאת בחשבון, במעבדה שלנו רדפה את האפשרות של תאי מוח תושב תכנות מחדש שושלת לאח&quot;י כגישה חדשנית כלפי טיפולים מבוססי תאים במחלות ניווניות. תאי מוח תושב שעשוי להיות באופן פוטנציאלי נחשבים כמטרות הסלולר לשושלת תכנות מחדש מהווים סוגים שונים של macroglia (האסטרוציטים, תאי NG2 וoligodendrocytes), מיקרוגליה, ותאים הקשורים דם קטן (תאים וpericytes אנדותל). בהרחבה יש לנו למדנו את פוטנציאל תכנות מחדש במבחנה של astroglia של cor המוחיטקס של עכברים לאחר לידה המוקדם 3-5. בחיפוש אחר מקורות תא דומה המתאימים לשושלת תכנות מחדש ישיר במוח האנושי הבוגר, נתקלנו באוכלוסיית תא שניתן לתכנות מחדש בהצלחה לכל הפרטים סימני ההיכר תערוכה של pericytes. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך לקצור את התאים האלה מביופסיות מוח אנושיות בוגרות, כדי להרחיב ולהעשיר את התאים האלה במבחנה, ובסופו לתכנת מחדש בהצלחה חלק ניכר במבחנת תאים מורחבים אלה (בטווח של 25-30%) לתוך תוספות. תכנות מחדש יכול להיות מושגת על ידי שיתוף ביטוי בתיווך רטרווירוס בו זמנית של שני גורמי שעתוק, Sox2 וascl1. PdiNs אלה נמצאו לרכוש את היכולת של ירי פוטנציאל פעולה חוזר על עצמו ועל מנת לשרת מטרות הסינפטי כלנוירונים אחרים המצביעים על היכולת שלהם להשתלב ברשתות עצביות. הפרוטוקול שלנו מספק הליך פשוט להמרת הבידוד ושושלת של pericytes המוח האנושי הבוגר לתוספות. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD140b-PE</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">558821</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD146-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MCA2141FT</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD13-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MVA1270A488T</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD34-APC</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">560940</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:80px;">3169S</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-CD146</td>
			<td style="width:80px;">Abcam</td>
			<td style="width:80px;">Ab75769</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NG2</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5320</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-SMA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2547</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T8660</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">M4403</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GFAP</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">G3893</td>
			<td style="width:80px;">use 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-GFP</td>
			<td style="width:80px;">Aves Labs</td>
			<td style="width:80px;">GFP 10-20</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-RFP</td>
			<td style="width:80px;">Chromotek</td>
			<td style="width:80px;">5F8</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-S100&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">S2532</td>
			<td style="width:80px;">use 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NeuN</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">MAB377</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GABA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2052</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-Calretinin</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5054</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-vGluT1</td>
			<td style="width:80px;">SYnaptic SYstems</td>
			<td style="width:80px;">135511</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">11-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control PE</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">12-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control APC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">17-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">12605-010</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61965</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">B27 serum-free supplement</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">17504044</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">10106-169</td>
			<td style="width:80px;">perform heat inactivation by incubation at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">15140122</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">24020-091</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="198">
			<td height="198" style="height:198px;width:80px;">Dulbecco&#39;s PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1&#215;; Invitrogen, cat. no. 14190)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">14190</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">H3375</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P0899</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P1648</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A9418</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T9284</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">042M4005</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Aqua-Poly/Mount</td>
			<td style="width:80px;">Polysciences</td>
			<td style="width:80px;">18606-20</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Polypropylene round-bottom tubes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352063</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352235</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">24-well plates</td>
			<td style="width:80px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:80px;">5530305</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">658175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">25 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">690175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Disposable pipettes 10 ml</td>
			<td style="width:80px;">Sarstedt</td>
			<td align="center" style="width:80px;">#########</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass Pasteur pipettes (150 mm)</td>
			<td style="width:80px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:80px;">FB50251</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass coverslips 12 mm diameter</td>
			<td style="width:80px;">Menzel</td>
			<td style="width:80px;">CB00120RA1</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Surgical disposable scalpels&#160;</td>
			<td style="width:80px;">B. Braun</td>
			<td style="width:80px;">5518083</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">633180</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Conical tubes 15ml</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352095</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:80px;">Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes</td>
			<td style="width:80px;">Hettich Lab Technology</td>
			<td style="width:80px;">1406</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Humified cell culture incubator</td>
			<td style="width:80px;">Eppendorf Galaxy 170R</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Wather bath at 37 &#176;C</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">FACSFlow sheath fluid&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">342003</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Epifluorescence microscope BX61</td>
			<td style="width:80px;">Olympus</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Confocal microscope LSM710</td>
			<td style="width:80px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage-reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neurons

שושלת תכנות מחדש ישיר של תאים שאינם עצביים לנוירונים מושרה (INS) עשוי לספק תובנות לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס נוירוגנזה ולאפשר אסטרטגיות חדשות לדוגמנות במבחנה או תיקון המוח החולה. סוגי זיהוי מוח שאינו תושב עצבי תא ניתנים להמרה ישירה לאח&quot;י עשויים לאפשר לשיגור גישה כזו באתרו, כלומר בתוך רקמת המוח הפגועה. כאן אנו מתארים פרוטוקול שפותח בניסיון של זיהוי תאים שמקורם במוח האנושי הבוגר כי למלא את הנחת יסוד זו. פרוטוקול זה כולל: (1) culturing של תאי אדם מקליפת המוח המתקבל מביופסיות מוח אדם בוגרות; (2) ההרחבה במבחנה (כ דורשת 2-4 שבועות) ואפיון של התרבות על ידי immunocytochemistry וזרימת cytometry; (3) להעשרה על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS) באמצעות קולט-β נגד PDGF ונוגדנים נגד CD146;(4) התמרה בתיווך רטרווירוס עם השעתוק העצבי גורמי Sox2 וascl1; (5) ולבסוף האפיון של תאי העצב כתוצאה נגזרת pericyte המושרית (PdiNs) על ידי immunocytochemistry (14 ימים עד 8 שבועות הבאים התמרה retroviral). בשלב זה, תוספות יכולות להיות נחקר לתכונות חשמליות שלהם על ידי הקלטת התיקון-clamp. פרוטוקול זה מספק הליך שחזור מאוד להמרת שושלת במבחנה של pericytes מוח תושב לאח&quot;י האנושי מתפקד.

התוצאה הראשונה של פרוטוקול זה לאחר הקמת הצלחת תרבות מדגימה של אדם מבוגר קליפת מוח מורכבת בזיהוי ההרכב התאי של התרבות. Immunocytochemistry לחלבונים ספציפיים סוג התא מגלה מידה רבה של הטרוגניות בין התרבויות נובעות מדגימה של חולים שונים (איור 1 א). כלכמת ידי cytometry זרימה תמיד יש אחוז ניכר של תאים המבטאים PDGFRβ (בממוצע ~ 75%, החל 30 לעד 99%); סמנים אחרים של pericytes כגון CD146, NG2 וCD13 באים לידי ביטוי בדרך כלל בטווח תחתון (איור 1). כמו כן SMA בא לידי ביטוי בsubpopulation קטין של התאים בתרבית, כפי שנקבע על ידי (איור 1 א) immunocytochemistry. במעבר 0 (P0), יש בדרך כלל &lt;10% מתאי אנדותל CD34 חיובי, ומספרם יורד מתחת לזיהוי עם passaging נוסף. כמו כן, astrocytes מהווה רק זיהום זניח בקטעים קודמים. יתר על כן, יש בדרך כלל לא תאים שיכתימו לתא גזע עצבי, עצבי, או סמני oligodendrocyte. Immunocytochemical וcytometry זרימת הנתונים אומתו באופן מלא על ידי 7 RT-PCR. לסיכום, את החלק היחסי הגדול ביותר בתרבות מבטא חלבונים ואופייניים mRNAs של pericytes. העשרה נוספת לתאי שמקורם pericyte יכולה להיות מושגת על ידי FACS בשלב זה. זה רלוונטי במיוחד כאשר טוהר של התרבות הוא בקצה התחתון של הקשת כפי שהיא משתקפת מרמת ביטוי PDGFRβ. לפיכך, יש לנו מנוצלים נוגדנים נגד PDGFRβ (CD140b) לבד או בשילוב עם נוגדנים נגד CD146, ואילו בניכוי כל מזהמים CD34 חיובי, לFAC-סוג במיוחד pericytes (תרשים 1C). Transducing תרבויות אלה עם וירוסי שליטת קידוד גן כתב בלבד, אינו משנה עמ ביטוי הסמן שלהםrofile (העריך 3-4 שבועות הבאים התמרה), מצביע על כך שהתאים אלה יישארו בשושלת pericyte. כמו כן, בתיווך ביטוי רטרווירוס של Sox2 לבד לא יביא לכל שינוי גלוי במורפולוגיה ולא גורם ביטוי bIII-טובולין המצביע על כך Sox2 לבדו אינו מספיק כדי לגרום להמרת גורל. לעומת זאת, אחוז נמוך (כ 10%) של התאים transduced עם רטרווירוס קידוד ascl1 ביטוי βIII-טובולין תערוכה לבד, עם זאת ללא רכישת מורפולוגיה עצבית. באופן מפתיע, כמעט 50% מכל וSox2-תאי cotransduced ascl1 להראות ביטוי βIII-טובולין ואף יותר מכך, שליש מהתאים האלה-transduced הכפול (דמיינו ידי הביטוי העיתונאי הכפול שלהם) גם להציג תהליכים עצביים (איור 2). יחד עם הרכישה של תכונות עצביות, ביטוי של PDGFRβ הוא למטה מוסדר 7. עם התבגרות נוספת בתרבות, וSox2-תאי coexpressing-ascl1 גם להיות immunoreactive לMAP2 הבוגר יותר סמנים עצביים (מכתים את התהליכים דנדריטיים) וNeuN (מכתים את גופי תא בעיקר עצביים). כפי שנראה להלן שינויים אלה בביטוי סמן גם לתאם עם רכישת סימני ההיכר אלקטרו של נוירונים. לסיכום, נתונים אלה מספקים הוכחה להמרה הישירה גורלם של תאי שמקורם pericyte לאח&quot;י, המכונה PdiNs. PdiNs אלה יש היכולת להקים תאי postsynaptic פונקציונליים כפי שנחשף בניסויי coculture עם הנוירונים של העכבר העוברי קליפת המוח. יכולת זו יכולה להיות הפגינה electrophysiologically במראה של תשומות סינפטיים (ראה דיון בהמשך), כמו גם את הקישוט של תהליכים דנדריטים של PdiNs עם מסופי presynaptic נגזרים מהנוירונים שיתוף תרבותי (מאופיינים באשכולות של מובילי ועי נוירוטרנסמיטר, למשל immunoreactivity vGluT1). נתונים אלו מצביעים על יכולתו של PdiNs להשתלב ג העצבי נוספיםircuits. <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51433/51433fig1highres.jpg" width="400" /> איור 1. ביטוי הטרוגניות של סמני pericyte בתרבויות הנגזרות מהמבוגרים האנושי קליפת המוח. א) micrographs פלורסנט הממחיש את הביטוי הטרוגנית של סמני pericyte (PDGFRb, SMA, CD146) כפי שנחשף על ידי immunocytochemistry. בקנה מידה בר = 50 מיקרומטר. B) היסטוגרמה מסכמת את המספרים היחסי של תאים חיוביים לסמני pericyte PDGFRβ (CD140b), CD13, וCD146 כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה של תרבויות הנגזרים חולים שונות. CD34 הוא סמן לתאי האנדותל. חלקות C) FACS נקודה המתארות את השליטה ואלוטיפ תאים אנושיים צבעוניים CD140b CD146 / למיון של pericytes הכפול חיובי (מודגש על ידי התיבה האדומה) לתכנות מחדש לאחר מכן. שים לב לשיעור הגבוה של ביטוי וPDGFRβההטרוגניות בכל קשור לביטוי CD146 בתרבות המסוימת הזה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51433/51433fig2highres.jpg" width="500" /> . איור 2 תכנות מחדש של תאי בוגרים אדם נגזר pericyte לINS למעלה:. ניסיוני הגדרה. להלן: micrographs פלורסנט מתאר תאי transduced עם קידוד רטרווירוס Sox2-IRES-GFP וascl1-IRES-DsRed. שים לב שרק תאים כפולים transduced (ראשי חץ) להביע bIII-טובולין (פנל מימין) ולהציג מורפולוגיה עצבית. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="459" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:100px;"></td><td style="width:116px;"> חלוקת תא [%] </td><td style="width:115px;"> מוות של תאים [%] </td><td style="width:128px;"> + BIII-טובולין [%] </td></tr><tr height="20"><td height="20" style &quot;גובה: 20px;&quot; =&gt; untransduced </td><td> 36 </td><td> 3 </td><td> 0 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Sox2 </td><td> 46 </td><td> 7 </td><td> 0 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Ascl1 </td><td> 26 </td><td> 33 </td><td> 7 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Sox2-Ascl1 </td><td> 3 </td><td> 36 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. התנהגותם של התאים שמקורם בpericyte עוברים סבה לPdiNs כפי שהוערך על ידי הדמיה לחיות רציפה. שים לב שSox2 וAscl1 שיתוף להביע מחזור תא יציאת תאים. יתר על כן, שים לב לשיעור הגבוה של מוות של התאים הבאים Ascl1 או Sox2 וAscl1-coexpression. אם ניקח בחשבון אירועים הסלולר שונים אלה, כ 25% מכל תאי transduced משותף הפכו ins.

Watch this Scientific Journal Video about Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons at JoVE.com

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

מיקוד תאי מוח תושב לשושלת תכנות מחדש ישיר מציע נקודות מבט חדשות לתיקון מוח. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך להכין את התרבויות מועשרים עבור pericytes מוח תושב מהמבוגר קליפת המוח האנושית ולהמיר אותם לתאי עצב הנגרמים על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של שעתוק גורמי Sox2 וAscl1.

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Views.  Ludwig Maximilians University Munich.  מיקוד תאי מוח תושב לשושלת תכנות מחדש ישיר מציע נקודות מבט חדשות לתיקון מוח. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך להכין את התרבויות מועשרים עבור pericytes מוח תושב מהמבוגר קליפת המוח האנושית ולהמיר אותם לתאי עצב הנגרמים על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס ?...

Video: Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...