אנו מציגים פרוטוקול להכנת תותבי פרוסה צפים חופשיים מרקמה מוחית שנאספו מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מכתשי. תרבות זו נוחה לביצוע בדיקות ביוכימיות וביולוגיה של התא או אימונוהיסטוכימיה. הוא צפוי לתרום להבהרה של המנגנון שבבסיס ניוון עצבי במחלות מוח הקשורות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה חלופה פשוטה וחסכונית לפרוטוקול תרבות פרוסה קלאסי באמצעות מוסיף קרום. למרות הפרוטוקול הכולל אינו מורכב, כמה צעדים כגון הסרת קרום המוח, הדבקת הרקמה לדיסק דגימת רטט, ו resection עבור immunohistochemistry מובנים בצורה הטובה ביותר כאשר הפגינו חזותית. עוזרים להדגים את ההליך יהיו ניל מנדס וגלאוסיה אלמדיה שהם סטודנטים לתואר שני, וג'ובאנה נוגיירה, סטודנטית נוספת לתואר שני.
כדי להתחיל בהליך זה, מוסיפים מלח לדלי קרח. מעבירים את פתרון הסיום לדלי זה ולתת לו לנוח תחת תערובת קרבוגן מבעבע לפחות 20 דקות לפני השימוש. לאחר מכן, הכינו גוש של 3% על שני ס"מ בשני סנטימטרים בשני סנטימטרים.
הדבק סופר בלוק אגרוז לדיסק דגימת רטט על מנת ליצור תמיכה מכנית נוספת לדגימת הרקמה במהלך חיתוך. על הרטט, הגדר את עובי החלק ל-200 מיקרומטר, את תדר הרטט ל-100 הרץ, ובחר מהירות חיתוך בין 0.5 ל-1.0 מילימטרים לשנייה. לאחר מכן נעל את מגש חיץ הרטט לבסיס הרטט והוסף קרח כדי לשמור אותו בקירור לפני קבלת פתרון ההפחתה ואת הדגימה ולאורך כל הליך ההפחתה.
ראשית, להקים מנגנון תחבורה המורכב גליל גז נייד המכיל תערובת קרבוגן מחובר שסתום שטף לחץ השולט על תפוקת הגז מחובר צינורות סיליקון המחבר את תפוקת הגז לכלי התחבורה ואת כלי התחבורה המכיל את פתרון ההובלה וקרח לקירור מדגם במהלך ההובלה. אסוף והעבר את הדגימה וההובלה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מעבירים את הדגימה לצלחת פטרי המכילה פתרון חיתוך.
באמצעות כלים כירורגיים עדין, להסיר בזהירות כמה שיותר של קרום לב הנותרים ככל האפשר. בחר את כיוון הדגימה הטוב ביותר לייצור פרוסות עם המאפיינים הספציפיים של העיצוב הניסיוני ולהשתמש מספר 24 להב אזמל לקצץ משטח שטוח להיות הבסיס כי יהיה מודבק לדיסק הדגימה. בעזרת כף פלסטיק סילוק ומברשות צבע עדינות, אוספים את השבר מצלחת פטרי ומייבשים את התותב העודף בנייר סינון.
לאחר מכן, השתמש דבק סופר כדי לחבר את הרקמה לצלחת דגימת רטט עד שהוא דבק היטב את המנה במגע עם בלוק אגרוז. מניחים את דיסק דגימת הרטט במגש מאגר הרטט. נעל את מחזיק הסכין במקום עם סכין הגילוח קבוע היטב.
הוסף פתרון חיתוך וודא שהוא מכסה הן את הדגימה והן את הלהב. ואז להתחיל לחתוך את הדגימה לתוך 200 פרוסות מיקרומטר. מעבירים את הפרוסות ממגש החיץ לצלחת פטרי המכילה פתרון חיתוך וחותכים את כל הקצוות הרופפים ואת החומר הלבן העודף לחלק של כ-70% קליפת המוח ו-30% חומר לבן.
בארון זרימה למינארי, מוסיפים 600 מיקרוליטרים של תרבות בינוניים לכל באר של צלחת 24 בארות ודגירה ב 36 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לפחות 20 דקות לפני ציפוי הפרוסות. לאחר מכן, השתמשו במברשת צבע כדי לצבוע פרוסה אחת בכל באר. אם יש בארות שאינן שימוש בצלחת, למלא אותם עם 400 microliters של מים סטריליים.
דגירה ב 36 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. תוספת 10 מיליליטר של מדיום תרבות שהוכן בעבר עם המוח נגזר גורם נוירוטרופי בריכוז של 50 ננוגרם למיליליטר. לאחר שמונה עד 16 שעות, הסר 333 מיקרוליטרים של המדיום הממוזג מכל באר והוסף 133 מיקרוליטרים של BDNF טרי בתוספת בינונית.
החלף שליש מהמדיום המותנה במדיום BDNF טרי בתוספת BDNF כל 24 שעות. ראשית, מעבירים את הפרוסות מה בארות המכילות מדיום תרבות לצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה PBS. הסר את PBS מכל באר ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של 4%paraformaldehyde.
דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר בזהירות את paraformaldehyde מן הבארים ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של 30% פתרון סוכרוז. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
לאחר 48 שעות, הגדר את המיקרוטום המקפיא ל-40 מעלות צלזיוס שליליות. הכינו בסיס סוכרוז על שלב המיקרוטום שבו יש להציב את הפרוסות. לאחר שהוא קפוא לחלוטין, לחתוך חלק סוכרוז קפוא לייצר משטח שטוח שעליו הפרוסה תונח.
לאחר מכן, מניחים כל פרוסה על סרט פלסטיק מתוח ולהשתמש מכחול כדי לשטח את הרקמה. במהלך אחד, מעבירים את הפרוסה המתוחה לבסיס סוכרוז הקפוא. לאחר שהפרוסה נחה במשך חמש עד עשר דקות כדי להקפיא כראוי, חותכים את הפרוסה ל-30 מקטעי מיקרומטר.
מעבירים את 30 חלקי המיקרומטר לצלחת פטרי המכילה PBS וממשיכות לפרוטוקול היסטולוגיה ההולם את התכנון הניסיוני. בעת קביעת האיכות והבריאות של פרוסות מתורבתות, היבט קריטי שיש להעריך הוא נוכחות ומורפולוגיה טיפוסית של סוגי התאים העצביים הצפויים, נוירונים ותאי גליה. הארכיטקטורה האופיינית של למינציה קליפת המוח האנושית נצפתה בפרוסה ביום במבחנה ארבע מתגלה על ידי immunolabeling עצבי.
בנוסף, נוכחות צפויה של microglia ואסטרוגליה הוא ציין גם. תוצאות אלה מראות כי ארכיטקטורת רקמות אינה מושפעת באופן משמעותי גם על ידי ההליך הכירורגי, עיבוד המדגם, או על ידי תקופה לטווח קצר במבחנה. התגובה העצבית לדפולריזציה הנגרמת על ידי אשלגן כלורי כומתה גם בפרוסות מתורבתות על ידי מעקב אחר זרחון ERK.
מעניין, עלייה ברורה זרחון ERK נראה פרוסות אשלגן כלורי מטופלים ביום במבחנה ארבע. לבסוף, התגובה של פרוסות ביום במבחנה ארבע לאתגר רעיל מוערך עם סטרס חמצוני ידוע inducer מי חמצן. חשיפת הפרוסות למי חמצן של 300 מילימולאר למשך 24 שעות הובילה לירידה חזקה בהפחתת MTT.
יחד, המוות התאי המסיבי שנצפה ביום במבחנה חמש פרוסות לאחר אתגר מי חמצן ואת תוצאות depolarization הנגרמת אשלגן כלורי להצביע על הבריאות הכללית השתמר של פרוסות ביום במבחנה ארבע אשר מגיבים לגירוי רעיל כגון מתח חמצוני. פרוטוקול זה מוקדש בעיקר למחקרים המבוססים על בדיקות הנמשך יותר משבוע כגון חקירת מנגנונים מולקולריים של נוירוטוקסיות והגנה עצבית על ידי תרופות מועמדות. למרות פרוטוקול זה מוקדש לשימוש ברקמה קליפת המוח שנאספו מחולים שהוגשו לטיפול כירורגי עבור אפילפסיה האונה הרקתית עמיד מיקרו, סביר להניח כי רקמות שנאספו מאזורים אחרים במוח או תנאים יכול להיות גם מקורות לייצר תרבות פרוסה צף חופשי.
תרבויות פרוסה מהמוח האנושי הבוגר עשויות להיות המפתח לקידום ההבנה שלנו של נוירופתולוגיות אנושיות בשל המעגלים התאיים הייחודיים שלהם ומכונות מולקולריות חסרות פרוסות המופקות ממוח מכרסמים.
