פרוטוקול זה מתאר שלוש אשויות במבחנה המעריכות באופן קולקטיבי את הפונקציות של תאי אנדותל פריונטריקולריים אנושיים ואת האינטראקציה שלהם עם interneurons GABAergic אנושי. תוצאות מ- assays אלה יספקו תובנה קריטית על הקשר בין תאי אנדותל periventricular והפרעות מוחיות. תנאים אלה הם פשוטים, בעלות נמוכה ומאפשרים מדידה של הגירת תאים בטווח של סנטימטרים, אשר אינו מושגת על ידי משגים קיימים אחרים.
פגמים בהגירה ובהפצה של מתמחים GABAergic קשורים להפרעות פסיכיאטריות, כגון אוטיזם, אפילפסיה, סכיזופרניה ודיכאון. לכן, זה קריטי כדי ללמוד את האינטראקציה של תאים אנדותל periventricular עם interneurons GABAergic בהקשר האנושי כדי לטפל בפתוגנזה של הפרעות אלה. התחל בהכנת תאים אנושיים להתרגם.
אפשר לתאי אנדותל פריונטריקולריים אנושיים להגיע ל-70 עד 80% קונפלונציה ואז נתק אותם בהתאם להוראות כתב היד וספיר אותם בשיטת ההדרה הכחולה trypan. כדי להכין INTERNEURons GABAergic אנושי, פתרון דיסוציאציה תאים חמים aliquot של מדיום עצבי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן שאפו את המדיום מכל תא המכיל היטב ושטפו אותם עם מילימטר אחד של PBS לגם.
נתק את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של פתרון דיסוציאציה לפני המלחמה לבא ודגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום עצבי ל הבאר ומעבירים את תווי התא לצינור חרוטי 15 מיליליטר, בעדינות triturating כדי לנטרל גושים התא. צנטריפוגה התאים ב 380 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, שאף את supernatant ו resuspend גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום עצבי.
לאחר מכן ספור את התאים החיים באמצעות אי-הכללה כחולה של trypan. הכן שליטה בתאי אנדותל אנושיים על ידי חימום פתרון הדיסוציאציה של התא ועלות של מדיום אנדותל ב 37 מעלות צלזיוס, 10 דקות לפני השימוש. שאפו מדיום מכל באר ושטפו אותם עם מיליליטר אחד של PBS לגם.
נתק את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של פתרון הדיסוציאציה לפני המלחמה לכל באר ודגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של תא אנדותל בינוני ל הבאר כדי לנטרל את פתרון הדיסוציאציה, ולהעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך חמש דקות, שאפו את העל-טבעי והתינו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום תא אנדותל.
לאחר מכן השתמש בשיטת אי-הכללת trypan כדי לספור את התאים. הכינו הכנס תרבות אחת היטב על ידי חיתוך שלושה צדדים של באר אחת של שתי תרבות סיליקון היטב להוסיף עם להב סטרילי. מוציאים את התוסף עם פינצטה סטרילית ומכניסים אותו למרכז של צלחת פולי-L-ornithine ו laminin מצופה, ולאחר מכן לחץ לאורך קצה של הכנס כדי לתקן את זה על פני השטח.
בזהירות להפוך את המנה במהופך כדי לוודא כי הכנס הוא דבק בחוזקה, ולסמן את הגבול של תא הכנס באמצעות שוק שחור קבוע עם קצה דק במיוחד. להשעות interneurons GABAergic האנושי בתאי אנדותל בינוניים ואנושיים עצביים ובינוני תא אנדותל בריכוז של 30, 000 לכל 70 microliters, ואז זרע 70 microliters של פתרון התא בתוך כל אחד גם תרבות להוסיף. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום עצבי לצלחת הנוירון כדי למלא את האזור סביב הכנס ולמנוע את הציפוי מלהיות ייבוש.
באופן דומה, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תא אנדותל לצלחת התא ה אנדותל periventricular. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם לא דולפים מהתא הכנס, ולאחר מכן דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. לאחר הדגירה, בדוק שוב את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהם מחוברים כראוי.
48 שעות לאחר הזריעה, להסיר בעדינות את הכנס עם פינצטה סטרילית ולבדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי שכבת התא נשאר באין מפריע. מוציאים את המדיום הן מהנוירון והן ממנות התאים האנדותל הצפיים, ומוסיפים מיליליטר אחד של מדיום טרי לכל מנה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך חמישה ימים.
לאחר מכן, להסיר את המדיום, לתקן את התאים עם 4%PFA במשך 10 דקות ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. כדי לבצע את ההתמדה התרבותית-שותף, להשעות 30, 000 INTERNEURons GABAergic ו 30, 000 תאים אנדותל periventricular אנושי ב 70 microliters של מדיום שיתוף תרבות, ואז לזרוע פתרון תא זה בתוך תא אחד גם להוסיף. לאחר 48 שעות, הסר את ההוספה.
הדגירה את התרבות השיתוף ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך חמישה ימים. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום, לתקן את התאים עם 4%PFA ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. כדי לבצע את ההקפאה של הכימותרפיה, מניחים במרכז תבשיל 35 מילימטר מצופה פולי-L-ornithine ו- laminin, הופכים את המנה ומנמינים את הגבול סביב התא האמצעי של התוסף באמצעות סמן קבוע עם קצה דק במיוחד.
זרעים 30, 000 INTERNEURons GABAergic ב 70 microliters של מדיום עצבי בתא האמצעי, ואז זרע 10, 000 תאים אנדותל periventricular ו 10, 000 תאי אנדותל שליטה ו 70 microliters של המדיום שלהם בהתאמה בשני התאים החיצוניים. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום שיתוף תרבות לאורך הצד של המנה כדי למנוע את הציפוי על המנה מלהיות ייבוש. לאחר 48 שעות, להסיר את הכנס ותגרור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 36 שעות.
לאחר הדגירה, להסיר את המדיום, לתקן את התאים ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. תריסי הגירה למרחקים ארוכים ותרבותית שותף שימשו לחקירת האינטראקציות בין תאי אנדותל פריאונטריים לבין נוירונים GABAergic. בהקדמה להגירה למרחקים ארוכים, התאים התחילו כתיקון מלבני ביום אפס, אבל ב-48 שעות, הם היגרו החוצה לחלל נטול התאים.
כתמים אימונוציטוכימיים בנוגדן קפסה-3 אנטי-אקטיבי, סמן של אפופטוזיס, לא הראו אות אפופטוטי בנוירונים הזורעים. בתרבות השיתוף של ההגירה, כאשר interneurons היו זרעו במשותף עם תאים אנדותל periventricular אנושי, נוירונים נסעו מרחקים רחוקים יותר בהשוואה כאשר interneurons נזרעו לבד או כאשר זרעו במשותף עם תאי אנדותל שליטה. בהבטחה הכימותרפית-אטרקציה, מספר גבוה משמעותית של interneurons היגרו לכיוון תאי אנדותל periventricular בהשוואה לתאי אנדותל שליטה, המאשר כי interneurons GABAergic להגיב באופן סלקטיבי רמזים כימותרפיים אטרקטיביים המופרשים על ידי תאים אנדותל periventricular.
ניתן לשנות את התשדורות הללו באמצעות ליגנדים, מעכבים או אסימונים כדי לקבל תובנות מכניסטיות על אינטראקציות של תאי אנדותל פריונטריקולריים אנושיים עם מתמחים אנושיים. הם יכולים לשמש גם כדי ללמוד את האינטראקציה של תאים אנדותל periventricular אנושי עם תאים עצביים אחרים כפי שדווח על ידי הקבוצה שלנו ואחרים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לתקן את הכנס בחוזקה על המנה ולשמור אותו באין מפריע לאורך כל הבדיקה, אחרת זה עלול להוביל דליפת תאים, ניתוק תאים או חוסר התאמה של הכנס עם הגבול שצויר.
העבודה שלנו הצביעה על תפקיד אוטונומי בתאים אנדותל אנושיים בפתוגנזה של הפרעות פסיכיאטריות כמו סכיזופרניה, אפילפסיה ואוטיזם. לכן, הערכה זו תאפשר הערכה של תאי אנדותל פריונטריקולריים חולים הנגזרים מחולים עם הפרעות אלה באמצעות טכנולוגיית IPSC.
