המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא לבודד תאי microglia ראשוניים מרקמות מוח אנושיות בוגרות חיות. במקרה שלנו, זה נאסף כחלון כירורגי במהלך הניתוח. זה מושגת על ידי בתחילה איסוף רקמות המוח בקרח קר PBS, הרקמה לאחר מכן חתוך לקוביה 1 מ"מ חתיכות קטנות, ואני פשוט עשיתי בעזרת טריפסין EDTA.
לאחר מכן, התאים נקצרים על ידי צנטריפוגה מצופה בקבוקון מתאים לתרבות תאי אנדרוגן במשך 48 שעות. תאים נקצרים שוב מן הבקבוק ותרבתו עד לשימוש נוסף. תאי מיקרוגליה אנושיים ראשוניים יכולים כעת להיות מאופיינים באמצעות אימונוציטוכימיה ולהשתמש בהם לניסוי נוסף.
היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו לבודד תאי microglia מרקמות המוח האנושיות הבוגרות הוא שהוא מספק ביעילות תאי microglia אנושיים בוגרים ראשוניים בצורה חסכונית מאוד. הפרוטוקול חזק ומפחית את אובדן התאים על-ידי הפחתת מספר השלבים המשמשים בפרוטוקולים קיימים. לאסוף את הרקמה בצינור פלקון 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של קרח קר aCSF.
נגבו את צינור האיסוף בזהירות עם 70% אלכוהול והעברו לתא זרימת אוויר למינארי אספטי. השלך את aCSF בזהירות ולשקול רקמה בצינור פלקון. לחשב את המשקל המשוער של רקמה על ידי הסיק את המשקל של צינור פלקון ריק.
ACSF טרי וחם עד 37 מעלות צל"ש. שמור את הרקמה ב- aCSF חם במשך חמש דקות. צעד זה הוא קריטי כדי למנוע מוות תאי.
השלך ACSF בזהירות. ולשטוף רקמה פעם אחת עם PBS 1X מחומם ל 37 מעלות צל"ש. ודא שכל הדם נשטף עם שטיפות PBS חוזרות ונשנות לפי הצורך.
הדגירה את הרקמה PBS חם במשך 5 דקות. השלך חצי מה-PBS בזהירות. מעבירים רקמה יחד עם PBS שנותר לצלחת פטרי מעקרת.
הסר את ה- PBS הנותר בזהירות עם פיפטה של 1 מ"ל. זה ימנע אובדן של רקמה. קוביות המנפיקות לקוביה לפחות 1 מ"מ חתיכות קטנות באמצעות אזמל סטרילי.
הוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין EDTA לצלחת פטרי ושטפו את הצלחת ביסודיות בעזרת פיפטה. העבר את הרקמה חצויה לצינור פלקון 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל לגרם רקמה של 0.25% טריפסין EDTA. מערבבים על ידי צינור דרך פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.
הדגירה את הצינור על שייקר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלסיגרד ואת המהירות של 250 סל"ד. מוסיפים 10 מ"ל של נטרול בינוני כדי לנטרל טריפסין. מערבבים היטב עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
צנטריפוגה הצינור ב 2000G ב 4 מעלות צלחים במשך 10 דקות. להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה ב 1 מ"ל של מדיום תרבות. מניחים את התאים בבקבוק T25 המתאים לתאי אנדרוגן ומוסיפים 4 מ"ל של מדיום תרבותי נוסף.
מדיום תרבות יכיל 20%L929 על-טבעי ו-1%סטרפטומיצין. מומלץ להוסיף L929 על טבעי בנפרד בבקבוקונים במקום להוסיף למדיום תרבות המניות. סיימנו עם הבקבוק כדי להיפטר הומוגנית את הרקמה.
הימנע להביא את התקשורת לצוואר של הבקבוק תוך רועד כמו זה עשוי להגדיל את הסיכויים לזיהום. הדגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלסיאדה עם 5% CO2 במשך 48 שעות. לאסוף את התקשורת מבקבוק תרבות T25 מוכן ביום 0 בצינורות צנטריפוגה.
צנטריפוגה התקשורת שנאספה ב 1, 466G ב 4 מעלות צל"ש במשך 4 דקות. בעוד התקשורת שנאספה הוא להיות צנטריפוגה, לשטוף את היום 0 בקבוק פעם אחת עם 1X PBS. לנער את הבקבוק בעדינות כדי להסיר את כל שברי רקמת שאריות שנותרו.
הימנע טלטולים קשים של הבקבוק כמו כל שברי קרן לא ישפיע לרעה על התרבות. הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבותית טרייה לבקבוקון. השלך את העל-טבעי מצינורות צנטריפוגליים.
מוסיפים 1 מ"ל של תרבות בינוני לאחד הצינורות ומערבבים ביסודיות עם פיפטה. מוסיפים באופן סדרתי את המדיה המעורבת עם תאים לצינורות אחרים ומערבבים היטב. הניחו את התאים בבקבוק T25 נפרד המתאים לתאי אנדרוגן.
הוסף 4 מ"ל של מדיה תרבותית טרייה לבקבוקון. הדגירה שני flasks ב 37 מעלות צל"ש עם 5% CO2 במשך 48 שעות. השלך את המדיה משני הבקבוקים והוסף מדיה טרייה של תרבות 5 מ"ל.
דגירה flasks ב 37 מעלות צל"ש ב 5%CO2 במשך 48 שעות. ביום השישי, התאים יהיו מוכנים לניסויים נוספים. בתמונות המיוצגות כאן.
החלונית הראשונה של הקטע אסטרוציטים מוכתמים ב- GFAP, בצבע ירוק. בלוח השני, של קטע כתם microglia עם RCA, ירוק בצבע. בחלק B microglia מוכתם RCA, שהוא ירוק בצבע, ואסטרוציטים מוכתמים GFAP, אדום בצבע.
שכבת-על של התמונות מציגה מיקרוגליה ואסטרוציטים יחד. ברור מן התמונות כי רוב התאים בתרבות מוכנים הם microglia. התמונות כומתו על ידי שליטה עיוורת והתוצאה מיוצגת בסעיף C.התוצאות הראו כי כ -80% מהתאים בתרבות שהוכנו הם תאי מיקרוגליה.
טכניקה זו יכולה להתבצע בערך שעה וחצי. בעקבות הליך זה צריכה להיות הבנה טובה של איך אני בוחר microglia priming מרקמות המוח האנושיות הבוגרות, אשר ניתן להשתמש בהם עוד יותר עבור ניסויים במורד הזרם.
