מימון ניתן על ידי &quot;Progetto Fondazione IRCCS Ospedale מאג&#39;ורה Policlinico concorso 2009-2010&quot; לMD, וAssociazione מבין Nefropatico ABN Onlus, מילאנו

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם ללאומי ותקנות הנוכחיות באירופה בנוגע להגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות ונבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מילאנו. 1. בידוד של Osteoblasts הראשי השיטה, עם שינוי קל, כדלקמן ההליך שתואר על ידי Dodig et 14 אל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לעכל בינוני, על ידי הוספת 0.1% Collagenase P ו0.05% טריפסין (החל מ2.5% טריפסין 10X, לא פנול אדום) עד בינוני HBSS (תמיסת מלח מאוזנת הנקס, לא סידן, מגנזיום, או פנול אדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ישנים עכברי 3-4 יום (ההליך יכול להיות מיושם על כמה כמו עכבר 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב על ידי עריפת ראש. לרסס את הראש עם 70% אתנול ולשמור על קרח. הסרת שכבות עור ושריר על ידי פינצטה ומספריים כירורגיות לנתח /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את העצמות הקודקודית ולהפריד ביניהם על ידי ביצוע תפר sagittal בשני חצאים. הפוך עצמות בטוחים הן ללא תפרים וכל רקמה חסיד ומניח את חתיכות עצם בודדות בגם צלחות המכילות בינוני HBSS עד ההליך הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל HBSS ולהוסיף לכל אחד גם בינוני לעכל במשך 15 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שוב בינוני לעכל במשך 15 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעם להציל את supernatant ולמקם אותו באלפא-ממ (בינוני Essential Minimum) בתוספת 10% FBS (בסרום שור עוברי) ו -1% סטרפטומיצין / פניצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.7 ו1.8 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שלושה שברים שנאספו, תאי ספין על ידי צנטריפוגה ב425 גרם במשך 5 דקות, לבטל את supernatant, להוסיף 3 מיליליטר של אלפא-ממ בתוספת לresuspend התא גלולה, ולהעביר לבקבוק 2 25 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הבינוני לאחר 24 שעות כדי להסיר שאריות ותאים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 חומצת מיקרוגרם / מיליליטר אסקורבית (AA) ו3 מ&quot;מ גלאימימה cerol 2 פוספט מלח disodium (GP) למדיום אלפא-ממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לשנות את המדיום (אלפא-ממ AA פלוס / GP) בכל יום אחר. </li></ol> 2. ATRA פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את כל הניסויים עם ATRA (All-Trans חומצה הרטינואית) בחדר חשוך כדי למנוע איון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טריפסין 1X במדיום HBSS ולשמור על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המדיה מתאי subconfluent ובזהירות לשטוף אותם עם HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת טריפסין 1 מיליליטר, בעדינות לסובב את הבקבוק כדי לאפשר לכל התאים להיות מכוסים על ידי טריפסין, ודגירה במשך 3 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה לניתוק בפועל של תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של מדיום אלפא-ממ כדי להשבית טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את התאים ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב425 גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה בחדר ספירת hemocytometer, לאפשר להתיישב לכמה דקות ולספור את הספירהמספר ll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מקום ב25 סנטימטר 2 צלוחיות בצפיפות של 10,000 תאים / 2 סנטימטר עם אלפא-ממ AA פלוס / GP. להיות מודע לכך צפיפות תאים היא רלוונטית להתפתחות האופטימלית של תהליכים בתא ואנשי קשר אינטר. צפיפות התחלה גבוהה יותר מאשר 10,000 תאים / 2 סנטימטר פוגע בהתפתחות תקינה של תהליכים בתא, אבל מספרים סלולריים נמוכים יותר לגרום למוות של תאים מוקדמים, בשל העדרו של קשר אינטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיקרומטר ATRA למדיום כל שעה 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התאים מדי יום כדי להעריך את המורפולוגיה: שינויים מורפולוגיים הם נצפו בדרך כלל לאחר 48 שעות. אם לאחר שעה 24-48 הראשונה, תאים עדיין מתרבים, replate בצפיפות לעיל. אוכלוסייה הומוגנית של osteocytes הבוגר נמצאת אחרי 4-5 ימים. בהתאם לצרכים, להשתמש בתאים בכל נקודת זמן, עד 12-15 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים מצופה על תומך אחר (כגון coverslips או גם צלחות), כדי להיות בטוח כי הצפיפות מעל מתוחזק וממשיך להוסיף ATRA כל שעה 24 עד לשימוש. לצאת מתאים לדבוק בתמיכה החדשה עבור לפחות 24 שעות לפני הניסוי. </li></ol> 3. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור immunostaining, צלחת התאים על coverslips ובצע מתודולוגיות הוקמו (ראה למשל 15 בארי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, עבור immunofluorescence העקיף, לתקן paraformaldehyde 4% או אצטון הקר, דגירה ברצף עם הנוגדן הראשוני ב RT עבור שעה 1 בתא humidified, ולאחר מכן עם הנוגדנים שכותרתו המשניים ניאון בחושך, על RT במשך 30 דקות, בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש DAPI או אנלוגים לcounterstaining גרעיני, ולעגן באנטי הדהיה בינונית. </li></ol> 4. אליזרין אדום מכתים והפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים על coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי טבילת coverslip ב70% אתנול ל10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את התאים עם כמה טיפות של פתרון מכתים אדום אליזרין (1 מ&quot;ג / מיליליטר, pH 5.5)ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips עם מי ברז. הר עם ירידה של גליצרול על שקופיות זכוכית ולקחת את התמונות באמצעות מיקרוסקופ זקוף ב10X והגדלה 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההליך הנ&quot;ל, לשחזר את coverslips ידי טבילת השקופיות במים ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את כל coverslip בצלחת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 60% חומצת perchloric (הכמות צריכה להיות מספיק כדי לכסות את התאים לחלוטין) ולעזוב O / N ב 4 ° C עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצפיפות האופטית של supernatant ידי spectrophotometry ב450 אורך גל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הערכים עבור מספר תאים, להוסיף יאנוס גרין (פתרון 0.2% ב-PBS) כדי לכסות את הכנת התא ל10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בזהירות עם מים ultrapure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 N HCl (הכמות צריכה להיות מספיק כדי לכסות את כל התאים) ולנער בעדינות ביד במשך כמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הספיגה ב 615 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+3D+imaging+of+the+osteocyte+lacuno-canalicular+network.">Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network.</a> Bone. 47 (5), 848-858 (2010).</li><li>Cheng, F., Hulley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteocyte--a+novel+endocrine+regulator+of+body+phosphate+homeostasis.">The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis.</a> Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte.">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+isolation+and+culture.">Osteocyte isolation and culture.</a> Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).</li><li>Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., J&#228;hn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+osteocytes+from+the+long+bones+of+skeletally+mature+and+aged+mice.">Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice.</a> Biotechniques. 52 (6), 361-373 .</li><li>Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte.</a> Bone. 54 (2), 296-206 .</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+an+osteocyte-like+cell+line,+MLO-Y4.">Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4.</a> J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).</li><li>Mattinzoli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+in+vitro+osteocytogenesis+induced+by+retinoic+acid+treatment.">A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment.</a> Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).</li><li>Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+in+embryonal+development.">Retinoids in embryonal development.</a> Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).</li><li>Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+all-trans+retinoic+acid+in+neurite+outgrowth+and+axonal+elongation.">Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation.</a> J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).</li><li>Vaughan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRA+induces+podocyte+differentiation+and+alters+nephrin+and+podocin+expression+in+vitro+and+in+vivo.">ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo.</a> Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).</li><li>Dodig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+TAAT-containing+motif+required+for+high+level+expression+of+the+COL1A1+promoter+in+differentiated+osteoblasts+of+transgenic+mice.">Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice.</a> J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry.">Immunocytochemistry.</a> A practical guide for biomedical research. , (2010).</li><li>Woo, S. M., Rosse, r. J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentune, n. T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Boukhechba, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+osteocyte+differentiation+in+a+3D+culture+system.">Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system.</a> J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).</li><li>Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+vitro:+from+pre-osteoblasts+to+osteocytes:+a+contribution+from+the+Osteobiology+Research+Group,+The+Pennsylvania+State+University.">Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 .</li><li>Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+mineralization+as+a+trigger+for+osteocyte+maturation.">Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 .</li><li>Hirao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+is+an+important+mediator+of+the+transformation+of+osteoblasts+to+osteocytes.">Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes.</a> J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).</li><li>Brounais, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+oncostatin+M+treatment+induces+an+osteocyte-like+differentiation+on+osteosarcoma+and+calvaria.">Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria.</a> Bone. 44 (5), 830-839 (2009).</li><li>Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+osteocyte-like+phenotype+by+fibroblast+growth+factor-2.">Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2.</a> Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).</li><li>Poole, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sclerostin+is+a+delayed+secreted+product+of+osteocytes+that+inhibits+bone+formation.">Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation.</a> FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell and More.</a> Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

בשנים האחרונות osteocyte התפתחה כתא המרכזי ביותר בעצמות. התקדמות במחקר בהדרגה מגלה מספר מאפייני osteocyte בלתי צפויים או בלתי מוכחים בעבר, שהם בעלי ערך עצום לעיצוב חדשני וטיפול טוב יותר עבור מגוון רחב של מחלות עצם. עם זאת, חקירה של הביולוגיה osteocyte כבר סובלת מהזמינות המוגבלת של...

Osteocytes, סוג תא עצם הנפוץ ביותר, הוא הבדיל סופני, תאים מסועפים מאוד עמוק הנמצאים בתוך השלד. גוף התא של osteocytes הבוגר כלולים בחסר עצם ויש צורות מגוונות; osteocytes עם גופי תא מוארכים נמצא בקליפת מוח העצם, ואילו osteocytes המעוגל הם תכופים יותר בעצמות הטרבקולות 1. דנדריטים מסועפים להאריך מגוף התא ומתגוררים בערוצים זעירים המכונים נקבות, ויוצרים רשת סבוכה שגורמת לאנשי קשר מרובים לא רק עם osteocytes אחר, אלא גם עם סוגים אחרים של תאי עצם, מח עצם, כלי דם וpericytes הכרוך בכך. באמצעות נוזל ביניים הכלולים בקונות ונקבות, osteocytes גם סופו של דבר מחובר למערכת במחזור, ולכן הם יכולים להשפיע לא רק מקומיים, אלא גם אירועים מערכתיים, ולהיפך ההתנהגות שלהם יכולה להיות מוסדרת על ידי שני שינויים מערכתיים והמקומיים 2. מחקר של osteocytes לאחרונה צבר תאוצה, הודות לכמה חידושים טכנולוגיים, כגון הדור של רקמות ובעלי חיים מהונדסים תא ספציפי, השימוש בשיטות מיקרוסקופיה רבות עוצמה ושל הקרנה מולקולרית תפוקה גבוהה 3,4. עם זאת, ידע של תאים אלה עדיין לא הושלם, בעיקר בשל מיעוט היחסי של דגמים מתאימים במבחנה. למעשה, osteocytes היה תמיד קשה להשיג ולשמור על בתרבות בגלל המיקום העמוק, והרמה הנמוכה של ריבוי המאפיין את סוג תא מובחן כזה. לאורך השנים, במספר השיטות פותחו כדי לבודד osteocytes העיקרי 5-7, למרות שהם בדרך כלל לייצר תשואות תא נמוכות ולשאת את הסיכון שאפילו כמה fibroblasts זיהום יהיה במהירות לגדול osteocytes 8. מסיבה זו, רוב ניסיוני בעבודה חוץ גופית כבר נערך עד כה על ליטר תא osteocyte המבוסס היטבine MLO-Y4 9. במבחנה מתודולוגיות נוספות יכולה לשפר את האפשרות ללמוד את התאים האלה ויכולות לשפר את הניתוח של הביולוגיה osteocyte והפתופיזיולוגיה. להיות במידה רבה אימצו, שיטות כאלה צריכה להיות קלים לשחזר, ולא דורשות מכשור מיוחד או פעמים רבות מאוד כדי להגיע להבשלת תא. חשוב לציין, אם רלוונטי לתאים ראשוניים, הם היו מאפשרים לנצל בעלי חיים מהונדסים. לאחרונה תוארו כי טיפול של הקו הסלולרי osteoblast MC3T3-E1 ושל osteoblasts העיקרי עם חומצה הרטינואית גורם לשינוי פנוטיפ מהיר שמוביל להתפתחות של אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes 10. כל טרנס החומצה רטינואית (ATRA) היא מוצר מטבולים פעיל של ויטמין A המסדיר שעתוק הגנים על ידי קשירה לקולטנים החומצה הרטינואית הגרעיניים (Rars). Rarsנקשרים ל-DNA כheterodimers עם קולטנים X retinoid (RXRs), סופו של דבר מוביל לאפנון של חומצה רטינואית (RA) מגיב לגני המטרה 11. ATRA הוכח לווסת את התמיינות והתבגרות של כמה סוגי תאים, ובהם תאים מסועפים אחרים, כגון תאים עצביים 12 וpodocytes 13. השיטה שתוארה כאן מתבססת על תוספת של ATRA לosteoblasts העיקרי. כדי להיות יעיל, ATRA יש להוסיף בשלב הבשלה מדויק על תאים מצופים בצפיפות מוגדרת; בניסיון שלנו בתנאים אלה הם קריטיים כדי להשיג את מתג פנוטיפ מosteoblasts לosteocytes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:923px;" width="923">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:283px;">Name</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:219px;">Cat #</td>
			<td style="width:183px;">comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11213857001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14175129</td>
			<td>Pre-warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-MEM</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td>22571038</td>
			<td>Pre-warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin/Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATRA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Protect ATRA from light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32670</td>
			<td>Can be added to the secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Janus Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176745</td>
			<td>Use with caution (skin and eye protection are recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Use with caution (skin and eye protection are recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fluorsave</td>
			<td>Calbiochem - Merck</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting Scissors, straight,10cm curved</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Well-plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermanox coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>12-565-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Zeiss Apotome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">spectrometer</td>
			<td>Safas Xenius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of retinoic acid to obtain osteocytes cultures from primary mouse osteoblasts

<html> הצורך בתרבויות osteocyte ידוע לקהילת חוקרי עצם; בידוד של osteocytes העיקרי הוא קשה ומייצר מספרי תא נמוכים. לכן, המערכת הסלולרית הנפוצה ביותר היא שורת התאים כמו osteocyte-MLO-Y4. השיטה שתוארה כאן מתייחסת לשימוש של חומצה רטינואית ליצירת אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים עם תכונות osteocyte מורפולוגיים ומולקולריים. לאחר הבידוד של osteoblasts ממכסה גולגולת עכבר, חומצה רטינואית כל טרנס (ATRA) הוא הוסיף למדיום סלולרי, ותא ניטור מתבצע מדי יום תחת מיקרוסקופ הפוכה. שינויים מורפולוגיים הראשונים הם לגילוי לאחר 2 ימי טיפול והבידול הוא בדרך כלל מלא ב5 ימים, עם התפתחות הדרגתית של דנדריטים, אובדן היכולת לייצר מטריצה ​​תאית, למטה רגולציה של סמני תא עצם ועד הוויסות של מולקולות osteocyte ספציפי. תוכן &quot;&gt; יש צורך בניטור תא היומי בגלל ההשתנות הפנימית של תאים ראשוניים, והפרוטוקול יכול להיות מותאם עם וריאציה מינימאלית לתאים המתקבלים מזנים שונים עכבר וליישם מודלים מהונדסים. השיטה היא קלה לביצוע ואינו דורשת מכשור מיוחד, היא לשעתקו מאוד, ומהירות יוצרת אוכלוסיית osteocyte בוגרת בהיעדר המטריצה ​​תאית מלא, המאפשרת שימוש בתאים אלה ליישומים ביולוגיים בלתי מוגבלים.

תוצאות התקבלו 5-10 ניסויים בלתי תלויים. מורפולוגיה של תאים AA / GP טופל יש תאים ראשוניים תכונות בעיקר כמו מרוצפות, אופייני לosteoblasts הבוגר. ניתן למצוא תאים מסועפים ביניהם (כפי שצוין על ידי חצים אדומים <st...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts at JoVE.com

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

טיפול בosteoblasts עכבר העיקרי עם חומצה רטינואית מייצר אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes. השיטה מתגברת על הקושי בהשגה ושמירה על osteocytes העיקרי בתרבות, ויכולה להיות יתרון ללמוד תאים הנגזרים ממודלים מהונדסים.

יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

application-retinoic-acid-to-obtain-osteocytes-cultures-from-primary

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico.  טיפול בosteoblasts עכבר העיקרי עם חומצה רטינואית מייצר אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes. השיטה מתגברת על הקושי בהשגה ושמירה על osteocytes העיקרי בתרבות, ויכולה להיות יתרון ללמוד תאים הנגזרים ממודלי?...

Video: Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.