שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום הביו-חומרים. במיוחד להתחדשות עצם. הם משמשים כדי להעריך את האפקטיביות של ביו-חומרים ותגובות חיסוניות פוטנציאליות.
היתרון העיקרי של פלטפורמה רב תחומית זו הוא שהיא מספקת מגוון פרמטרים לחיזוי תאימות ביולוגית של ביו-חומרים המשמשים לתיקון עצם. ההשלכות של אלה במבחנה וטכניקות עצם in vivo להרחיב לכיוון הפרעות עצם אחרות. בשל הצורך בהקרנה פרה-קלינית של ביו-חומרים אורתופדיים חדשניים.
המתודולוגיה הדרמטולוגית יכולה לספק תובנות על ביו-חומרים לריפוי עצם, ניתן ליישם אותה גם על הערכות ביו-חומריות עבור כל אינדיקציה קלינית אחרת. תרבות שאפתן בינוני מן osteoblasts העיקרי 14 ימים לאחר תוספת של מדיום מינרליזציה osteogenic. יש לשטוף פעמיים עם 0.5 מיליליטר של 1X PBS.
לאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 10% תפתור פורמלין במאגר ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, שאפו את הפורמלין המאגור 10% עם צינור חד-פעמיים ושטפו פעמיים עם 0.5 מיליליטר של מים אולטרה-חמים. לאחר מכן להוסיף 250 microliters של 40 מילימולארי Alizarin אדום S כתם פתרון כתמים osteoblasts קבוע.
ולהדקר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות על שייקר ב 100 שייקים לדקה. בעקבות הדגירה עם פתרון הכתמים, שאפו את תותב הכתמים בעזרת צינור חד-שימוש ושטוף במיליליטר אחד של מים אולטרה-חמים. חזור על שלב זה חמש עד 10 פעמים עד פתרון שטיפה יוצא ברור להסיר כתמים לא ספציפיים.
לאחר שאיפה לשטוף הסופי, להוסיף מיליליטר אחד של PBS קר. ולהדרור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות על שייקר כמו קודם. לאחר מכן, להעביר את הדיסקים מוכתמים בטא tricalcium פוספט ל הבאר חדשה לסרוק את הצלחות עם סורק שטוח כדי להקליט מינרליזציה.
לאחר לכידת התמונה, להוסיף 250 microliters של 10%cetylpyridinium כלוריד פתרון לנער במשך 15 דקות כדי לחלץ את צבע S אדום Alizarin. לאחר מכן, להעביר את הפתרון מן הבארים בודדים 1.5 צינורות מיליליטר צנטריפוגה ב 17, 000 x גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לדלל את התמצית עם 10% cetylpyridinium כלוריד פתרון בהקצבת דילול של 1:10 כדי 1:20 בצינור 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן להעביר 300 microliters של כל מדגם מדולל לתוך בארות של צלחת 96 באר. כלול שתי בארות ריקות המכילות רק 10%cetylpyridinium כלוריד. לאחר מכן, הכינו שבעה תקני ייחוס של Alizarin Red S החל מ-4 400 מיקרומולרים על ידי דילול תספורת הכתמים Alizarin Red S 40 מיליומרים עם 10% פתרון כלוריד צטילפרידין ליצירת עקומה סטנדרטית.
לטעון 300 microliters של כל תקן לתוך הצלחת. לבסוף, קרא את סופגי הדגימות, החסר ותקני הייחוס ב- 520 ננומטר. לבודד מבשרי מח עצם osteoplast מן הירך ואת השוקיים של עכבר המתת לחץ באמצעות מספריים סטריליים כדי להסיר את הרגליים מהגוף במפרק הירך.
חותכים את הגפיים במפרקי הברך והקרסוליים ומסירים את הרקמה הרכה עם אזמל סטרילי ומדפים. חותך את האפיפיזיות. הכנס מחט 27 מד מחובר מזרק מלא מיליליטר אחד של מדיום צמיחת העצם לתוך לומן לשטוף את מח העצם לתוך צלחת פטרי סטרילי שישה סנטימטרים.
לאחר החזרה על זה עבור כל עצם הירך tibiae, להעביר את ההשעיה התא צינור חרוט 50 מיליליטר. לשטוף את צלחת פטרי שישה סנטימטר עם חמישה מיליליטר של צמיחת עצם בינוני ולהעביר אותו לאותו צינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 350 x גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
בעקבות צנטריפוגה מחדש להשעות את התאים במיליליטר אחד לכל באר של מדיום בידול osteoclast. עכבר BALB/c אחד מספק מספר מספיק של מבשרי אוסטאוקלסט עבור צלחת תרבות אחת של 24 בארות. הוסף osteoblasts ראשי מושעה בגודל צמיחת העצם על הביו-חומר ואת הפקדים ב 8.8 * 10 ^ 4 תאים לסמטר מרובע.
דיסקי בטא טריקלציום פוספט, עצם חזיר מבוקרת, ופלסטיק תרבות רקמות משמשים כאן. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הוסיפו מבשרי מח עצם מבודדים טריים ומדיום בידול אוסטיאוקלסטי לאוסטובלסטים הראשוניים התרבותיים וחזרו לחממה במשך חמישה ימי תרבות ב-37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוזי פחמן דו חמצני.
החלף את המדיום עם מדיום בידול osteoclast טרי מוכן כל יומיים. ואז כתם osteoclasts עבור חומצה עמידה טרטראט פוספטאז כדי להעריך את ההידול. לגלח את הקרקפת של עכבר BALB / c בן שמונה שבועות הרדמה ולנקות את פני השטח עם 7.5% פתרון יוד povidone ו 70% אתנול.
מכסים את העיניים עם משחה עיניים כדי למנוע ייבוש במהלך ההליך. להבטיח רמה מתאימה של הרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטת בוהן וזנב. ואז לאחר ביצוע חתך קשתית קו האמצע להסיר את רקמות חיבור paracranium מעל העצםקודית הימנית על ידי גירוד אותו עם אזמל.
לאחר מכן השתמש טרפין שיניים סטרילי עם קוטר של ארבעה מילימטרים ב 2000 סיבובים לדקה כדי ליצור פגם בגודל קריטי בעצםקודית הימנית. כל הזמן להשקות את האזור עם תמיסת מלח סטרילית תוך חרוץ עצם הקודקוד הימנית חיתוך דרך ectocortext וכמה אנדוקורטקס. כדי למנוע נזק לדרה מאטר, השתמש במעלית פריוסטילית קטנה כדי לפרוץ את האנדוקורטקס הנותר.
לאחר מכן השתמש במדפים כדי להרים בזהירות את עצם הגולגולת ולהסיר אותו. הפגם המתקבל צריך להיות מעגלי בקוטר של כ-3.5 מילימטרים. לאחר מכן, למלא את הפגםגולגולתי עם קצף קולגן בטא טריקלסיום פוספט, presoaked PBS סטרילי.
כדי לשמור על הביו-חומר במקום, יש למרוח 0.5 מיקרוליטרים של דבק רקמות בסוף הפגם בשתי נקודות מנוגדות. לאחר מכן סגור את העור עם תפר שאינו ניתן לעצירה. מניחים עכבר הרדמה על גבו, מגלחים את פרוות הבטן ומנקים את המשטח המגולח עם תווי יוד 7.5% ו-70% אתנול.
לאחר ביצוע חתך קו אמצע באורך שמונה מילימטר דרך העור לאורך אלבה linea של הבטן, השתל PBS ספוג ביומטרי מתחת לעור. ואז לתפור את העור עם תפר שאינו ניתן לתפור. שמונה שבועות לאחר ההשתלה, excise אתר ההשתלה עם הרקמה שמסביב מהעכבר המתת דם.
תמונה זו מדגימה כי הצמיחה על דיסקים בטא tricalcium פוספט המוצגים ברים פתוחים אינו משפיע על הכדאיות osteoblast לעומת הצמיחה על פלסטיק תרבות הרקמה בשבעה ו 14 ימים של תרבות. אוסטיובלסטים מתורבתים היו מוכתמים ב-אליזארין רד S לאחר 14 ימים. מינרליזציה הייתה גבוהה יותר עבור בקרות בינוניות מינרליזציה בהשוואה osteoblasts מתורבתים בינוני לבד.
ועל דיסקי בטא טריקלציום פוספט בארות תרבות השעיה. כאשר פגם גולגולתי בגודל קריטי כתוצאה בניתוח נותר ריק, שכבה דקה המכסה את הפגם כולו נצפתה, אך לא הייתה היווצרות עצם משמעותית ב 12 שבועות לאחר הניתוח. לעומת זאת, כאשר הפגם הכיל קצף קולגן בטא טריקלסיום פוספט, תרסיסי קצף מוקפים ברקמה סיבית צפופה כולל כמה כלי דם ותאים דלקתיים גישור על אזור הפגמים ללא ראיות להיווצרות העצם.
בעקבות השתלת קצף קולגן בטא טריקלציום פוספט תת עורי, תגובה דלקתית עם תאים ענקיים בגוף זר נצפתה על מקטעי המטוקסילין ואאוסין מוכתמים עדות לפיברוזיס על החלקים המוכתמים בטריכרום של מאסון בשמונה שבועות. לעומת זאת, באתר ההשתלה של הבקרות המזויף הייתה דלקת מינימלית ולא פיברוזיס. בעת ניסיון הליך זה חשוב לעשות תיוק מדויק ובלתי ניתן לשחזור של הגולגולתא מבלי לפגוע בבעל החיים.
בעקבות שיטות אחרות של הליך זה כמו בדיקות ביאור אוסטאוקלסט ותפוקה גבוהה למודלים חיסוניים צפדית ניתן לבצע מראש על מנת לענות על שאלות נוספות כמו התגובה של osteoclast לביו-חומרים וסוג התגובה החיסונית.
