מימון: מחקר רפואי של צבא ארצות הברית וציוד פיקוד (USAMRMC) ומנוהל על ידי טלרפואה וטכנולוגיה מתקדם מרכז מחקר. Shunxi ג&#39;י תרם השינוי של המזרקים כפי שמתואר כאן.

1. מערכת Set-up המערכת מורכבת מאחזקה וריכוז טנק (HCT) מצויד במיקסר בשלב אחד, homogenizer גזירה גבוהה ב-line, משאבת הרים כדי להעביר נוזל בין HCT וhomogenizer, ומחליף חום (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מעוקר, מצוידים עם 2 יציאות בסיס ו -3 יציאות בצד מתחת למיקסר שלב אחד כלי איסוף זכוכית 4 L פעור פה. מנמיכים את ראש המיקסר לפה של כלי השיט ולהבטיח הולם גז חזק באמצעות חותמות גומי או קלטת (על מנת למנוע את זיהום אוויר בסביבת מרחב הראש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתאים אחד נמלי הבסיס (איור 1, # נמל 1) לHCT עם סטרילי &quot;3/8 צינורות (ID) ברורים, כ 10&quot; ארוך, מצויד בברזלי 3 כיוונים בקצה לאוסף של התחליב המרוכז . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את יציאת הבסיס השנייה צינורות, approximatel (איור 1, # יציאה 2) עם 3/8 סטרילי &quot;(תעודת זהות)y 36 &quot;באורך. להאכיל את הצינור הזה באמצעות משאבת הרים. התאם את המפרצון של homogenizer הגזירה הגבוה עם T-חתיכה כולל שתי יציאות ולחבר באופן הבא: חיבור צינורות מנמל # 2, באמצעות משאבת ההרים ולהתחבר ליציאת הצד של T-החתיכה. צרף את הנמל האחר למכל חמצן באמצעות flowmeter גז חמצן זרימה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את יציאת השקע של homogenizer הגזירה הגבוה ליציאת הכניסה של מחליף חום באונליין נשמר ב 4 ° C. חבר את יציאת השקע של מחליף החום לנמל השיבה של HCT (איור 1, # נמל 3), יצירת מערכת לולאה סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מיכל חמצן (דרך flowmeter) לHCT (איור 1, נמל # 4). צרף צג הרכב גז, כי הוא פתוח לאווירה ליציאה העליונה של HCT (איור 1, # יציאה 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עקרות היא רצויים, לעקר את רכיבי זכוכית ומתכת לפני כל שימוש בחיטוי. לעקר את רכיבי צנרת ושיתוף פלסטיקnnectors ידי אתילן אוקסיד לפני כל שימוש. זה חשוב במיוחד אם המוצר הוא להיבדק in vivo. </li></ol> 2. ייצור LOM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 20 גרם של GMP 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DSPC) ו10 גרם של כולסטרול בבסיס של HCT. להוסיף 1 ליטר של פלזמה-Lyte לHCT ויד ומערבבים דקות 1, שילוב כמה שיותר שומנים ככל האפשר לשלב מימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את מיקסר שלב אחד אל השלב המימית, להבטיח כי כל ראש המיקסר מכוסה בשלב המימית. ודא שהחלק העליון של HCT הוא גז חזק (ראה שלב 1.1 לעיל), וכי אין תופעות יציאות פתוחות. הפעל את מקור הגז המחובר ליציאת מס &#39;4 ולחכות עד שבר החמצן של אמיץ HCT מגיע&gt; 95%. ב10 ליטר / דקה (LPM), זה צריך לקחת ~ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקסר שלב אחד, לערבב התחליב מבשר על 5 דקות בסל&quot;ד 5,000. התערובת המתקבלת צריכה להופיע לבנה חיוור ואינם מכילה שום LIPI גלויגושי ד. מעורב פעם, תערובת שומנים מים שאינם בשימוש ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 30 ימים לפני שימוש יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מערכת הלולאה סגורה כולו עם תחליב המבשר ידי הפעלת משאבת ההרים ב1.3 LPM. ברגע שהמערכת דרוכה, לשמור על המשאבה ב1.3 LPM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל ייצור של LOMs, הדלק את homogenizer הגזירה גבוהה באונליין ל -7,500 סל&quot;ד. מייד לאחר מכן, הפעל את זרימת חמצן לחלק המפרצון של homogenizer ב0.5 LPM. שמור את המיקסר בשלב אחד (בHCT) ב3,500 סל&quot;ד. LOMs נוצרים בממשק של להבי הרוטור ומסכי emulsor בתוך homogenizer ב-line (איור 2). בתוך דקות, נוזל צריך להיות גלוי יותר צמיג. גישה מחמירה יותר היא לקבוע צמיגות כפונקציה של זמן, שבו ניתן לעשות זאת על ידי הסרת aliquots מיום 1 בנמל במהלך ייצור וניתוח עם viscometer. הערה: אם בועות אוויר נראות לעין נמצאות בצינור יציאה מהמיקסר, חמצןתזרום לhomogenizer באונליין הוא גבוה מדי. לכיל את זרימת גז עד הנוזל הוא אטום ולא מכיל בועות גז גלויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את המערכת במשך 15 דקות, ולאחר מכן לכבות את homogenizer הגזירה הגבוה וכניסת החמצן אליו. תמשיך להפעיל את מיקסר שלב אחד בHCT עד תחליב מוסר; זה מפחית את הסיכון הפרדת פאזות ושומר על המוצר יחסית אחיד בתוך HCT. הערה: הנפח של תחליב הגז מלא צריך להגדיל בכ 2-3x בשלב ריכוז סדרתי. אם זה לא, בדוק כדי להבטיח חמצן שזורם לתוך homogenizer הגזירה הגבוה וכי ריכוזי שומנים בתחליב המבשר נכונים. יעילות של ייצור יורדת ככל שריכוז שומנים בדם יורד. </li></ol> 3. איסוף, ריכוז, הערכה, וחפצים של LOMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף סטריליים, שונה 140 מיליליטר מזרק luer נעילה לברזלים צמודים לנמל בסיס המס &#39;1 בכלי האיסוף. צייר את 100 מיליליטר של נוזל. חוזקה כובע מזרק וחזור על פעולה עד שכל הנוזל הוסר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מזרקים על ידי נסיגה של אוויר 100 מיליליטר לתוך המזרק ולאחר מכן מנסר את בוכנת מזרק וחומר עודפים מעל סימן מיליליטר 140. מלא ומזרקים ריקים באמצעות מלקחיים שיניים לצייר את הבוכנה. שינוי זה מאפשר לצנטריפוגה קלה יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים צנטריפוגה עם הסוף הכתיר אוריינטציה כלפי מטה בצנטריפוגה דלי (4 מעלות) בקירור ב 225 XG 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש שכבות של חומר יופיעו לאחר צנטריפוגה. לגרש את השכבה התחתונה של שלב מימיים מעונן עודף וזורק. השכבה השנייה היא לבנה בוהקת ומכילה LOMs המרוכז. העבר את הקצף מרוכז למזרק גז חדיר באמצעות ברזלים שלוש דרך על מנת למנוע זיהום גז סביבה. מחק את השכבה הסופית, המכילה גז חמצן חופשי מLOMs מקרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להעריך איכות קצף על ידי להגיע ≥ גז 90% מקצף מרוכז. Calculאכלתי ריכוז גז באופן הבא: % בנפח גז = [(משקל קצף / קצף נפח) - 1] x 100 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבקרת איכות שנייה, microbubbles הגודל ידי התקדרות אור כדי לקבוע אם גודל חלקיקים נמצא בטווח הצפוי. יצוין, כי שינוי בזמן הומוגניזציה או ניסוח עשוי לשנות גודל בועה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוזקה מכסה את מזרק הזכוכית עם הולם luer נעילה. יכול להיות מדולל LOMs המרוכז עם פלזמה-Lyte בעת השימוש. ניתן לאחסן את מזרקים ב22, 4, או -20 º C; טמפרטורות קרות יכולות לספק יציבות חיי המדף משופרת 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+loaded+microbubble+design+for+ultrasound+triggered+delivery.">Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery.</a> Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).</li><li>Ren, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasound+Microbubble+Carrying+Gene+and+Tat+Peptide:+Preparation+and+Characterization.">A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization.</a> Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).</li><li>Tinkov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubbles+as+Ultrasound+Triggered+Drug+Carriers.">Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).</li><li>Hernot, S., Klibanov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubbles+in+ultrasound-triggered+drug+and+gene+delivery.">Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).</li><li>Lanza, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+site-targeted+ultrasonic+contrast+agent+with+broad+biomedical+application.">A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application.</a> Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).</li><li>Cavalli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+characterization+of+dextran+nanobubbles+for+oxygen+delivery.">Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery.</a> International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).</li><li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+Provide+Intravenous+Oxygen+Delivery.">Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery.</a> Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).</li><li>Lindner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+rheology+of+definity+microbubbles+after+intra-arterial+and+intravenous+administration.">Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).</li><li>Zhao, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization+and+in+vivo+observation+of+phospholipid-based+gas-filled+microbubbles+containing+hirudin.">Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).</li><li>Seo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Assembly+of+Monodisperse,+Nanoparticle-Incorporated+Perfluorocarbon+Microbubbles+for+Medical+Imaging+and+Therapy.">Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy.</a> Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).</li><li>Wan, J. D., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coated+Gas+Bubbles+for+the+Continuous+Synthesis+of+Hollow+Inorganic+Particles.">Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles.</a> Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).</li><li>Duncanson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+Gas-Filled+Microparticles+from+Reactions+in+Double+Emulsions.">Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions.</a> Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).</li><li>Kendall, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaled-Up+Production+of+Monodisperse,+Dual+Layer+Microbubbles+Using+Multi-Array+Microfluidic+Module+for+Medical+Imaging+and+Drug+Delivery.">Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).</li><li>Szijjarto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Perfluorocarbon+Gases+on+the+Size+and+Stability+Characteristics+of+Phospholipid-Coated+Microbubbles:+Osmotic+Effect+versus+Interfacial+Film+Stabilization.">Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization.</a> Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).</li><li>Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid-Coated+Gas+Bubble+Engineering:+Key+Parameters+for+Size+and+Stability+Control,+as+Determined+by+an+Acoustical+Method.">Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method.</a> Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).</li><li>Swanson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid-Stabilized+Microbubble+Foam+for+Injectable+Oxygen+Delivery.">Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery.</a> Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).</li><li>Kv&#229;le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+fractionation+of+gas-filled+microspheres+by+flotation.">Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation.</a> Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).</li><li>Dressaire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+polygonal+nanopatterning+of+stable+microbubbles.">Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles.</a> Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).</li><li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Manufacture+of+Concentrated+Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+for+Intravenous+Oxygen+Delivery.">Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. , (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הצעדים החשובים ביותר ליצירת LOMs המרוכז, מחומצן מאוד כוללים: 1) להבטיח כי האמיץ בתוך HCT נשאר מחומצן באופן מלא; 2) להבטיח כי הטוהר של חומרים בלתי פעילים שומנים הוא אופטימלי (כולל תנאי אחסון ושימוש במוצרי GMP); 3) להבטיח כי שומני האבקה לערבב לחלוטין עם השלב המימית לפני תחול המע?...

Microbubbles המורכב מחלבון, פולימר, ופגזי שומנים פותחו כוקטורים למשלוח סמים, ריפוי גנטי, וסוכנים בניגוד אולטרסאונד 1-5. בגלל שימושים טיפוליים אלה דורשים התמדת microbubble intravascular, microbubbles כזה מלא בדרך כלל עם גזים אצילים, גבוהים מולקולרי משקל כגון perfluorocarbons 6, שבו יש מסיסות נמוכה בדם ולייצב את 3,4 הבועה. לאחרונה, microbubbles חמצן שומנים מבוסס (LOMs) תוכנן כדי לספק מינונים טיפוליים של חמצן, אשר עשוי לשמר את אספקת חמצן באיברי מטרה ולמנוע חוסר יציבות המודינמית בתקופות של חסימה בדרכי הנשימה או היפוקסמיה 7. תחליב המיועד לאספקת גז לוריד דורש תכונות עיצוב שונות מאלה המשמשים סוכנים בניגוד אולטרסאונד או משלוח תרופות ממוקד. ראשית, משום שהגוף צורך כמויות גדולות של גז חמצן (~ 200 מיליליטר / דקה), LOMs חייב להיות מיוצר והזריק בקנה מידה גדול. זה דורש שתהליך הייצור יהיה יעיל. שנית, תהליך הייצור צריך להיות בלולאה סגורה על מנת למנוע זיהום חנקן באמצעות החשיפה של LOMs (שאמור להיות מלאות ב100% חמצן) לסביבת אוויר. שלישית, משום שהמטרה של LOMs היא אספקת גז לוריד, את החלק היחסי של גז LOMs צריך להיות מוגדל, תוך הכרה במגבלות שהוטלו על ידי צמיגות תחליב 7. לבסוף, כמו בכל הזרקה תוך ורידית, שליטה מדויקת התפלגות גודל חלקיקים היא חיונית למניעת חסימת כלי הדם 8. ישנן מספר שיטות שהוקמו לייצור microbubble. Sonication מנצל בעוצמה גבוהה, אולטרסאונד בתדירות נמוכה להחיל את ממשק אוויר הנוזל של תחליב הכולל פעילי שטח, כגון פוספוליפידים amphipathic, בנוכחותו של אמיץ גז לייצר microbubbles 7,9. תהליך זה הוא לשליטה על ידי שינוי אולטרהתדירות צליל, עוצמה ומשך דופק, והתפלגות גודל וכתוצאה מכך יכולים להיות מותאם כדי לייצר microbubbles של התפלגות גודל מסוימת, אם כי sonication משמשת רק לעתים נדירות בייצור של microbubbles קליני בשימוש. מיזוג הוא התסיסה מכאנית האינטנסיבית של פעילי שטח וגז במערכת סגורה, שהוא גם קשה בהיקף של עד כדי להכיל כמויות גדולות 2. מיקרופלואידיקה מבוסס אגל מאפשר שליטה מדויקת של התפלגות גודל microbubble 10-13. אמנם קשה באופן מסורתי בהיקף של עד, רב ערוצים, מיקרופלואידיקה מהירות גבוהה תוארו בו להגביר את יעילות ייצור microbubble 13. Microbubbles מיוצר באמצעות כל אחת מהשיטות הללו עשויים לדרוש תהליכי גודל הפחתה לאחר ייצור, כגון חלוקה צנטריפוגלי 14,15 ו הנפקת microbubble 16,17. שיטה נוספת שהוקמה לייצור microbubbles מאוד יציב היא homogeniz גזירהation 6, אשר יכול לגרום לדפוס פוספוליפידים משושה ייצוב על משטח microbubble 18. בונה על המושג הזה, אנו מתארים את השילוב של homogenizer גזירה גבוהה בקו כדי ליצור LOMs הרכבה עצמית 19. בתהליך זה, homogenizer מנצל במהירות סיבוב להבים בסמוך למסכי emulsor הרשת בסדר כפולים, יצירת גזירה מכאנית והידראולית גבוהה ליצירת microbubbles. ריכוז סידורי של תחליב השומנים באמצעות מערכת זו מניב שבריר גז מרוכז יותר ויותר, אשר יכול להיות אפילו עוד יותר מרוכז על ידי צנטריפוגה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:405px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td>
			<td style="width:141px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770365</td>
			<td>Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:141px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C75209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plasma-Lyte A</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">80089-818</td>
			<td>Alternatively can use NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Glass collection vessel</td>
			<td style="width:141px;">Specialty Glass, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gas composition (oxygen) monitor</td>
			<td style="width:141px;">Precision Medical</td>
			<td style="width:119px;">PM5900L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sarns 8000 roller pump</td>
			<td style="width:141px;">Calicut Medical</td>
			<td style="width:119px;">16407</td>
			<td>Part of a modular perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">BIOtherm Heat Exchanger</td>
			<td style="width:141px;">Medtronic</td>
			<td style="width:119px;">ECMOtherm-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Verso laboratory in-line mixer</td>
			<td style="width:141px;">Silverson Machines, Inc</td>
			<td style="width:119px;">TH-IL-102-VERSO</td>
			<td>Use multistage workheads and front-end extension with T piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">T-piece for Silverson Verso inlet port</td>
			<td style="width:141px;">Process Innovations</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">L5M-A laboratory mixer</td>
			<td style="width:141px;">Silverson Machines, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NC0136483</td>
			<td>Use mesh emulsor screen (fine)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Rochester-Ochsner toothed forceps</td>
			<td style="width:141px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-812-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">140 mL syringe</td>
			<td style="width:141px;">Kendall Healthcare Monoject&#160;</td>
			<td style="width:119px;">8881114030</td>
			<td>Ensure there is a luer lock.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IX71 Inverted light microscope</td>
			<td style="width:141px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Retiga-2000R microscope camera</td>
			<td style="width:141px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;">RET-2000R-F-M-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Accusizer 780A Autodilution</td>
			<td style="width:141px;">PSS-NICOMP Particle Sizing Systems</td>
			<td style="width:119px;">Out of production</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacture of concentrated, lipid-based oxygen microbubble emulsions by high shear homogenization and serial concentration

microbubbles גז מלא פותחו כניגוד אולטרסאונד וסוכני משלוח סמים. יכול להיות מיוצר על ידי עיבוד microbubbles פעילי שטח באמצעות sonication, תסיסה מכאנית, מכשירי microfluidic, או הומוגניזציה. לאחרונה, microbubbles חמצן שומנים מבוסס (LOMs) תוכנן כדי לספק חמצן לווריד במצבי חירום רפואי, היפוך היפוקסמיה מסכנת חיים, ומניעת פגיעה באיבר שלאחר מכן, דום לב ומוות. אנו מציגים שיטות לייצור מוגדל של microbubbles מחומצן מאוד באמצעות homogenizer גבוה גזירה לולאה סגורה. התהליך יכול לייצר 2 ליטר של LOMs המרוכז (90% לפי נפח) ב90 דקות. יש בועות וכתוצאה מקוטר ממוצע של ~ 2 מיקרומטר, ופרופיל rheologic בקנה אחד עם זה של דם כאשר מדולל ל60% בנפח. טכניקה זו מייצרת LOMs בקיבולת גבוהה ועם טוהר חמצן גבוה, טוען כי טכניקה זו עשויה להיות שימושית עבור מעבדות מחקר translational.

המגון גזירה גבוה מאפשר ייצור יעיל (כלומר בתוך יום אחד) של LOMs מספיק למחקר בבעלי חיים ואינו דורש מומחיות טכנית. ברגע שבקיא, עד 2 ליטר של LOMs המרוכז יכול להיות מיוצר ב90 דקות. גודל microbubble ומורפולוגיה הוערכו על ידי מיקרוסקופ אור ועל י...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration at JoVE.com

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

אנו מתארים שיטות לייצור כמויות גדולות של חמצן microbubbles שומנים מבוסס (LOMs) המיועד לאספקת חמצן לוריד באמצעות הומוגניזציה גבוהה גזירה וריכוז סדרתי.

ייצור מרוכז, חמצן שומנים מבוסס microbubble אמולסיות ידי הגזירה גבוהה Homogenization וריכוז סידורי

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

manufacture-concentrated-lipid-based-oxygen-microbubble-emulsions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Views.  Harvard Medical School.  אנו מתארים שיטות לייצור כמויות גדולות של חמצן microbubbles שומנים מבוסס (LOMs) המיועד לאספקת חמצן לוריד באמצעות הומוגניזציה גבוהה גזירה וריכוז סדרתי. 

Video: Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

מבוא טכניקת ממוקד אולטראסאונד הרס microbubble

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

יישומי ייצור משלוח סמים של חלקיקי משי

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for electrical conduction between cardiomyocytes. The current method for quantifying this space by manual segmentation is slow and has low spatial resolution.We developed an algorithm that uses serial image dilations of a binary outline to count the number of pixels between two opposing 2 dimensional edges.This algorithm requires fewer man hours and has a higher spatial resolution than the manual method while preserving the reproducibility of the manual process.In fact, experienced and novice investigators were able to recapitulate the results of a previous study with this new algorithm.The algorithm is limited by the human input needed to manually outline the perinexus and computational power mainly encumbered by a pre-existing pathfinding algorithm.However, the algorithm&#39;s high-throughput capabilities, high spatial resolution and reproducibility make it a versatile and robust measurement tool for use across a variety of applications requiring the measurement of the distance between any 2-dimensional (2D) edges.

The purpose of this algorithm is to continuously measure the distance between two 2-dimensional edges using serial image dilations and pathfinding. This algorithm can be applied to a variety of fields such as cardiac structural biology, vascular biology, and civil engineering.

לכימות מרחקים Intermembrane עם תמונות טורי Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

ניקוי קטליטי של הצמח חמצן תגובתי מינים In Vivo על ידי חלקיקי תחמוצת צריום Anionic

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to nanomolar ranges, several orders of magnitude less than many physiological ligand concentrations. Optical nanostructures called zero mode waveguides (ZMWs), which are 100&#8722;200 nm in diameter apertures fabricated in a thin conducting metal such as aluminum or gold, allow imaging of individual molecules at micromolar concentrations of fluorophores by confining visible light excitation to zeptoliter effective volumes. However, the need for expensive and specialized nanofabrication equipment has precluded the widespread use of ZMWs. Typically, nanostructures such as ZMWs are obtained by direct writing using electron beam lithography, which is sequential and slow. Here, colloidal, or nanosphere, lithography is used as an alternative strategy to create nanometer-scale masks for waveguide fabrication. This report describes the approach in detail, with practical considerations for each phase. The method allows thousands of aluminum or gold ZMWs to be made in parallel, with final waveguide diameters and depths of 100&#8722;200 nm. Only common lab equipment and a thermal evaporator for metal deposition are required. By making ZMWs more accessible to the biochemical community, this method can facilitate the study of molecular processes at cellular concentrations and rates.

Described here is a nanosphere lithography method for parallel fabrication of zero mode waveguides, which are arrays of nanoapertures in a metal-clad glass microscopy coverslip for single molecule imaging at nano- to micromolar concentrations of fluorophores. The method takes advantage of colloidal crystal self-assembly to create a waveguide template.

ייצור של מגלי גל במצב אפס למיקרוסקופיה של מולקולה בודדת בריכוז גבוה

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...