This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).

1. المياه / النفط / المياه مستحلب مزدوجة المكروية الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا إعداد 2٪ و 0.5٪ ث / حلول v من الكحول البولي فينيل (PVA) في الماء منزوع الأيونات. تحريك الحلول عند 50 درجة مئوية حتى واضح، وهذا قد يستغرق عدة ساعات. تحضير محلول 2٪ V / V الآيزوبروبيل الكحول في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول مائي من البروتين المطلوب ماء. ويقدم الجدول أدناه سبيل المثال تركيبات. </li></ol><img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> الجدول 1: مثال حلول البروتين تم تغليف البروتين الحلول التالية بنجاح وelectrospun يستخدم هذا البروتوكول. حلول البروتين ماء أخرى يمكن استخدامها حسب الحاجة. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 40 مل من محلول PVA 0.5٪ في أنبوب 50 مل الطرد المركزي وتوضع جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب الطرد المركزي 15 مل حل 300 ملغ من 65:35بولي (حمض اللبنيك-CO-الجليكوليك) (PLGA) في 3 مل من ثاني كلورو ميثان. وخلاط دوامة يمكن أن تستخدم لتسريع PLGA الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 200 ميكرولتر من محلول البروتين و 4 ميكرولتر من 2٪ من محلول PVA. صب خليط من البروتين في حل PLGA (الخطوة 1.4). ستبقى الحلول في الغالب منفصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب في كوب من الماء المثلج. باستخدام sonicator عصا في ~ 10 واط (RMS)، تستنهض الهمم الحل لبضع ثوان (5-10) حتى يتم إنشاء مستحلب أبيض دسم موحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب مستحلب في أنبوب 50 مل تحتوي على 0.5٪ PVA (الخطوة 1.3). مزيج الحل بسرعة عالية على خلاط دوامة لمدة 20 ثانية ~. فإن الحل تطوير مظهر غائم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مستحلب لكوب 200 مل ومكان على طبق من ضجة في 350 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. إضافة 50 مل من 2٪ ايزوبروبيل إلى الدورق على لوحة ضجة. السماح للخليط أن يستمر التحريك لمدة لا تقل عن 1 ساعة للسماح للDCM لتتبخر وPLGA لتتصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل رانه المكروية الحل في أنابيب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 425 x ج لمدة 3 دقائق. سوف المجهرية جمع في أسفل الأنبوب وتظهر بيضاء. إزالة بعناية طاف من الأنبوب، فوق المجهرية، وتخزينها في زجاجة 500 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع الماء منزوع الأيونات المجهرية عن طريق ملء الأنبوب ثلاثة أرباع بالكامل والهز إعادة توزيع المجهرية في السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 1.10 و 1.11 أربع مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد شطف النهائي، وإزالة طاف مرة أخرى ووضعه في زجاجة 500 مل مع عينات أخرى. تجميد المجهرية التي تم جمعها في أنبوب الطرد المركزي، ثم يجفد لمدة 24 ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور المجهرية تحت المجهر ضوء أو مع الكترون المجهر الضوئي. المجهرية أي أكبر من 60 ميكرون هي لelectrospinning فعالة. إذا المجهرية كبيرة جدا، قد تكون هناك حاجة sonicating أو vortexing لمرات أطول في الخطوة 1.6 أو 1.7. </li> &lt;لى&gt; المتجر المجهرية المجففة في الثلاجة -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: استخدام فحص البروتين، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، لاختبار كمية البروتين في زجاجة 500 مل من الخطوة 1.10 30. ويستخدم هذا لحساب النسبة المئوية للبروتين مغلفة في المجهرية، وذلك بطرح المبلغ في حل من ما تم استخدامه في عملية الإنتاج. </li></ol> ملاحظة: لتصور المكان البروتين في المكروية إضافة رودامين 2 ميكروغرام / مل في حل PLGA 31 و تغليف البروتين مترافق FITC الشكل 1 يبين مثال. 2. Electrospinning مع المجهرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إعداد حل electrospinning، إنشاء 0.5٪ ث / ت حل photoinitiator، في الماء منزوع الأيونات عن طريق إذابة عند 37 درجة مئوية. قد تستغرق هذه العملية عدة ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء 2٪ ث / ت methacrylated حمض الهيالورونيك (MEHA) (انظر Burdick وآخرون لتخليق) 29، 3٪ث / ت 900 دينار بولي (أكسيد الاثيلين) (PEO) و 0.05٪ ث / ت حل صورة البادئ في الماء منزوع الأيونات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المبلغ الصحيح للMEHA وPEO للحجم المطلوب. على سبيل المثال، 10 مل من حل electrospinning تتطلب 200 ملغ من MEHA و 300 ملغ من PEO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل PEO في الماء منزوع الأيونات في 90٪ من الحجم النهائي المطلوب (9 مل لهذا المثال). قد يستغرق هذا عدة ساعات، لوحة اثارة ساخنة أو حمام الماء عند 37 درجة مئوية يمكن استخدامها لتسريع العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التالي إضافة MEHA واستخدام خلاط دوامة لتحريك الحل حتى اضحة. وهذا سوف يستغرق سوى بضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا إضافة 0.5٪ الحل صورة المبادر لملء حجم 10٪ المتبقية (1 مل لهذا المثال). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المجهرية في التركيز المطلوب يصل إلى 400 ملغ / مل. مزيج الحل على خلاط دوامة حتى يتم توزيعها بالتساوي المجهرية في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل إلى حقنة وإرفاق قياس 18 بوصة 6 BLالاتحاد الوطني للعمال إبرة معلومات سرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحقنة في ضخ حقنة وضعه على الاستغناء عند 1.2 مل / ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريط طبقة من رقائق الألومنيوم على لوحة أو جمع مغزل. وهذا يسمح لسهولة تنظيف وتخزين السقالة النهائية. ويستخدم مغزل بالتناوب لخلق ألياف الانحياز. وهناك لوحة مسطحة أو مغزل ثابتة يؤدي إلى الألياف رتبت عشوائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بتوصيل سلك الأرض من مصدر الطاقة العالية الجهد لجهاز التحصيل. ربط قيادة إيجابية للإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط ضخ حقنة وجمع السطح حتى لا يكون هناك 15 سم بين رأس الإبرة وسطح المجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء ضخ البوليمر، عندما حل مرئيا في نهاية الحقنة، بدوره على مصدر الجهد وضبط الجهد إلى 24 كيلو فولت تنبيه: بمجرد تشغيل التيار الكهربائي عن لا تلمس أي جزء معدني للنظام. قد تهمة أيضا القفز مسافات قصيرة من أجزاء المكهربة على الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل حل حتى دويتحقق سمك سقالة esired. عند اكتماله إيقاف مصدر الجهد وضخ حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة احباط مع سقالة المرفقة. يتم تخزين السقالات الانتهاء تحتوي على البروتين في الثلاجة -20 درجة مئوية. </li></ol> 3. البروتين اختبار النشاط الحيوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلية ثقافة وسائل الإعلام. إضافة 10٪ V / V مصل بقري جنيني، 1٪ V / V L-الجلوتامين، و 1٪ V / V البنسلين، الستربتوميسين إلى Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر coverslips الزجاج التي تناسب تماما في لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 3- (Trimethoxysilyl) ميتاكريليت بروبيل لعلاج لل coverslips كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. Methacrylation يعزز سقالة التمسك لل coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق coverslips methacrylated إلى المنطقة مجموعة من electrospinner مع القابلة للإزالة الشريط مزدوجة من جانب قبل electrospinning. الغزل على لل coverslips يخفف المناولة والمشاهدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrospin للسمك المطلوب كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأي fter electrospinning إزالة بعناية coverslips من مغزل. وضع السقالة coverslips المغلفة في غرفة النيتروجين واضحة والتأكد من أن جميع الأكسجين يتم إزالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الغرفة والسقالة تحت 10 ميغاواط / سم 2 365 نانومتر ضوء لمدة 15 دقيقة. بعد يشابك المكان إلى لوحة جيدا بحجم مناسب. تأكد من أن الجانب سقالة يكون مواجها لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السقالات مكان تحت مصباح مبيد للجراثيم لمدة 30 دقيقة لتعقيم. إذا تم استخدام فبرونيكتين المطلوب أو غيرها من البروتين وطلاء لتعزيز التصاق الخلية. اتبع تعليمات الشركة الصانعة إلى معطف السقالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد الجذر الظهرية العقد (DRG) كما هو موضح سابقا بواسطة نقل بيان عسكري 32. وستكون هناك حاجة واحدة DRG لكل سقالة مغطاة ساترة اختبارها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 100-200 ميكرولتر من وسائل الإعلام على كل سقالة في لوحة جيدا. وضع بعناية DRG واحدة على كل سقالة في قطرة سائل الإعلام. للسقالة سميكة قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من وسائل الإعلام. DRG ينبغي غمرها بالكامل وليس floaتينغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان السقالة وDRG عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة للسماح للخلايا التمسك السقالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء وسائل الإعلام إلى المستوى المناسب لوضع البئر والعودة إلى الحاضنة. مواصلة احتضان لمدة 4-6 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة إزالة بعناية وسائل الإعلام من كل بئر وغسل بلطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام 4٪ ث / ت امتصاص العرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا صمة عار وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة للخيط عصبي. وهذا سوف يسمح تصور من ثمرة neurite للالكمي. ويمكن أيضا أن تستخدم دابي لعرض نوى الخلايا. وصفت بروتوكول سبيل المثال تلطيخ بواسطة Sundararaghavan وزملاؤه 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة جيدا على مسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كتلة الخلايا باستخدام إعدادات التصفية والإثارة للدابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الخلية هو تبديل فلتر لFITC لتصور neurites التي ممتدة. Uالغناء وظيفة غرزة على المجهر جمع والجمع بين العديد من الصور حسب الحاجة لرؤية هيكل كامل. أكرر للدابي، FITC والميدان مشرق. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+in+neural+tissue+engineering.">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li><li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering:+strategies+for+repair+and+regeneration.">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li><li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats.">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li><li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves.">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li><li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds.">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li><li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair.">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li><li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair.">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li><li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , (2006).</li><li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+nerve+guides:+materials,+fabrication,+growth+factors,+and+cell+delivery.">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li><li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li><li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczy&#324;ska, I., J&#281;drzejowska-Szypu&#322;ka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review.">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li><li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications:+perspectives+and+challenges.">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth.">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity.">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li><li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches.">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro.">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li><li>Casta&#241;o, O., Eltohamy, M., Kim, H. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration.">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li><li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers.">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li><li>Han, D., Gouma, P. -. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix.">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li><li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering.">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li><li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering.">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li><li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits.">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li><li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning:+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li><li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture.">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior.">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li><li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery:+current+technologies+and+selected+biomedical+applications.">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications.">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks.">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li><li>P&#233;an, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles.">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li><li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells.">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li><li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , (2003).</li><li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres.">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li><li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen.">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li><li>Madduri, S., di Summa, P., Papalo&#239;zos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats.">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor.">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li><li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration.">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li><li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications.">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+proteins+in+poly(L-lactide-co-caprolactone)+fibers+by+emulsion+electrospinning.">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li><li>Wang, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration.">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li><li>Liu, J. -. J., Wang, C. -. Y., Wang, J. -. G., Ruan, H. -. J., Fan, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly(lactic+acid-caprolactone)/nerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning.">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا العصبية يمكن إخراج العظة الطبوغرافية (محاذاة الألياف) والاشارات الكيميائية (عوامل النمو) 1،2،10،11،35. Electrospinning هو أسلوب سطحي لخلق ألياف الانحياز. عوامل النمو تشجع نمو الأعصاب ولكن من أجل إدراجها في قنوات العصب (NC)، مطلوب طري?...

أحد التحديات المستمرة في هندسة الأنسجة العصبية هو خلق قناة العصبية (NC) الذي يحاكي مصفوفة الخلوية الإضافية، حيث تنمو الأعصاب بشكل طبيعي. وقد أظهرت الأبحاث أن الخلايا تستجيب إلى عدة عوامل في بيئتها بما في ذلك الميكانيكية، والطبوغرافية، لاصق وإشارات كيميائية 1-3. أحد التحديات الرئيسية في هذا المجال وتحديد توليفة مناسبة من الإشارات وافتعال النظام الذي يمكن الحفاظ العظة لفترة طويلة لدعم نمو الخلايا 4. ومن المعروف أن الخلايا العصبية الطرفية يفضلون ركيزة لينة، يتم إخراج الألياف الانحياز، واستجابة لعامل نمو الأعصاب (NGF) 5-7. وقد ثبت أن البلاغات التي يمكن أن توفر الاشارات الكيميائية لأسابيع لتوفير وتحسين الانتعاش وظيفية أقرب إلى أن من المغايرة، المعيار الذهبي الحالي للإصلاح العصبية 8،9. المواد وطرق الإنتاج المختلفة يمكن استخدامها لإنتاج الميكانيكية والطبوغرافيةآل العظة 10-13. العظة الميكانيكية هي الملازمة لاختيار المواد، مما يجعل اختيار المواد المناسبة لتطبيق الحرج 1،13. أساليب الإنتاج للسيطرة وتشمل العظة الطبوغرافية مرحلة الانفصال، التجميع الذاتي وelectrospinning 1،13. لتطبيقات الميكروسكيل، على microfluidics، photopatterning، الحفر، الترشيح الملح، أو الرغاوي الغاز يمكن أن تستخدم أيضا 14-17. وقد برز Electrospinning باعتبارها السبيل الأكثر شعبية لهندسة ركائز لزراعة الأنسجة الليفية بسبب مرونته وسهولة إنتاج 13،18-23. هي ملفقة ألياف النانو Electrospun عن طريق تطبيق الجهد العالي إلى حل البوليمر الامر الذي ادى الى صد نفسها وتمتد عبر فجوة قصيرة لأداء 24. يمكن إنشاء سقالة الانحياز عن طريق جمع الألياف على مغزل بالتناوب على الارض ويتم جمع السقالات عدم الانحياز على لوحة ثابتة 25. ويمكن تحقيق التصاق الإشارات بواسطة طلاء سقالة الطرافة ليفيةح فبرونيكتين أو التصريف على التصاق الببتيد، مثل RGD، إلى HA قبل electrospinning 26. الإشارات الكيميائية، مثل عوامل النمو، هي الأكثر صعوبة في الحفاظ على مدى فترات طويلة لأنهم بحاجة إلى مصدر للافراج رقابة. وقد حاول العديد من أنظمة لإضافة الافراج تسيطر على شبكات ليفية electrospun مع مستويات متفاوتة من النجاح. وتشمل هذه الأساليب electrospinning مزيج، مستحلب electrospinning، قذيفة الأساسية electrospinning والبروتين اقتران 27. بالإضافة إلى ذلك، يتم electrospinning تقليديا في مذيب متطاير، والتي يمكن أن تؤثر على صلاحية البروتين 28، لذلك يجب النظر في الحفاظ على النشاط الحيوي للبروتين. ويتناول هذا النهج تحديدا الجمع، الطبوغرافية، وإشارات لاصقة الكيميائية والميكانيكية لإنشاء سقالة الانضباطي للنمو الأعصاب الطرفية. يتم التحكم الميكانيكا سقالة بدقة عن طريق تجميعحمض هيالورونيك methacrylated (HA). وتستخدم المواقع methacrylation إرفاق صورة crosslinkers رد الفعل. المواد crosslinked لم يعد للذوبان في الماء، ويتم تقسيم حصرا بنسبة 29 الانزيمات. كمية يشابك يتغير معدل التحلل، والميكانيكا وغيرها من الخصائص الفيزيائية للمادة. باستخدام HA مع 30٪ methacrylation، التي لديها معامل الشد من ~ 500 باسكال، ويخلق ركيزة الناعمة التي هي قريبة من الميكانيكا الأم من الأنسجة العصبية ويفضل عادة من قبل الخلايا العصبية 26،29. Electrospinning على مغزل بالتناوب يتم استخدامها لإنشاء ألياف الانحياز لجديلة الطبوغرافية. باستخدام electrospinning مع المجهرية يوفر إشارات الكيميائية داخل السقالة على مدى فترات طويلة. لدعم النمو محوار المجهرية تحتوي على NGF يتم استخدامها لإنشاء إشارة كيميائية. وخلافا لمعظم المواد electrospun HA قابل للذوبان في الماء لذلك NGF لا تواجه المذيبات قاسية أثناء الإنتاج. لإضافة إشارة لاصقة، وهيئة السلع التموينيةوهي مغلفة مع فبرونيكتين ffold. يحتوي على نظام الانتهاء من جميع الأنواع الأربعة من الإشارات المذكورة أعلاه: لينة (الميكانيكية) محاذاة (الطبوغرافية) الألياف مع NGF الإفراج المجهرية (الكيميائية) المغلفة مع فبرونيكتين (لاصق). يوصف إنتاج واختبار هذا النظام في هذا البروتوكول. العملية تبدأ إنتاج المجهرية مع مزدوجة مستحلب المياه في والنفط في المياه. واستقرت مستحلب مع السطحي، كحول البولي فينيل (PVA). المرحلة المياه الداخلية تحتوي على البروتين. كما يتم إضافته إلى مرحلة النفط، التي تحتوي على المواد قذيفة PLGA حله في ثاني كلورو ميثان (DCM)، والسطحي يخلق حاجزا بين المراحل حماية البروتين من DCM. هذا هو مستحلب من المياه فرقت في مرحلة أخرى تحتوي على PVA لإنشاء السطح الخارجي للالمجهرية. يحرك مستحلب مستقر للسماح للDCM لتتبخر. بعد الشطف وlyophilizing كنت مع ترك المجهرية تابع الجافaining البروتين. بعد الانتهاء من المجهرية التي تكون جاهزة للelectrospun في السقالات. أولا أنت تعد الحل electrospinning. اللزوجة من حل أمر حاسم لتشكيل الألياف المناسب. حلول النقي HA لا تلبي هذا المطلب. يضاف PEO كما البوليمر الناقل للسماح electrospinning. تضاف المجهرية في حل وelectrospun مما أدى إلى سقالة ليفية مع المجهرية وزعت في جميع أنحاء. مرة واحدة إنتاج كاملة، ينبغي اختبار البروتين للتحقق من قدرتها على البقاء. للقيام بذلك، والخلية الأولية التي تستجيب لNGF يمكن استخدامها. يستخدم هذا البروتوكول الجذر الظهرية العقد (DRG) من أجنة الدجاج يوم 8-10 القديمة. هي المصنفة حزم الخلايا على السقالات التي تحتوي على المجهرية مليئة NGF أو تلك التي هي فارغة. إذا كان NGF لا يزال قابلا للتطبيق سترى تعزيز النمو محوار على السقالات التي تحتوي على NGF. إذا كان NGF لم يعد قابلا للتطبيق وسوفلا تعزيز neurites التي لتوسيع ويجب أن تظهر مشابهة لعنصر التحكم. ويتركز الإجراء المحدد الموصوفة هنا على دعم العصبي، ومع ذلك، مع تعديلات بسيطة على المواد، طريقة electrospinning، وبروتينات نظام يمكن أن يكون الأمثل لمختلف أنواع الخلايا والأنسجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DAPI</td>
			<td style="width:208px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:139px;">D1306</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Irgacure 2959</td>
			<td style="width:208px;">BASF</td>
			<td style="width:139px;">24650-42-8</td>
			<td style="width:291px;">Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">PEO 900 kDa</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:139px;">189456</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td>
			<td style="width:208px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:139px;">23591-100</td>
			<td style="width:291px;">Prepare stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:208px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:139px;">KDS100</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Power Source</td>
			<td style="width:208px;">Gamma High Voltage</td>
			<td style="width:139px;">ES30P-5W</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Motor</td>
			<td style="width:208px;">Triem Electric Motors, Inc</td>
			<td style="width:139px;">0132022-15</td>
			<td style="width:291px;">Must attach to a custom built mandrel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tachometer</td>
			<td style="width:208px;">Network Tool Warehouse</td>
			<td style="width:139px;">ESI-330</td>
			<td style="width:291px;">Use to monitor mandrel speed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter</td>
			<td style="width:208px;">EXFO</td>
			<td style="width:139px;">S1000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Needles</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-825-16H</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Coverslips</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-545-81</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Polyvinyl Alcohol</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Isoporopyl Alcohol</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">I9030-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">BSA-FITC</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">080M7400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">&#946;-Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td style="width:208px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:139px;">1156-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:139px;">1001554270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">34856-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Coomassie (Bradford) Protein Assay</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">1856209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:139px;">1001558456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:139px;">12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FBS</td>
			<td style="width:208px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:139px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">PBS</td>
			<td style="width:208px;">Hyclone</td>
			<td style="width:139px;">SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glutamine</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pen-Strep</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:208px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:139px;">A11313&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrospinning growth factor releasing microspheres into fibrous scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

المجهرية 50 ± 14 ميكرون في القطر مع أكثر من 85٪ بروتين التغليف وقد تم إنتاج باستمرار وelectrospun في السقالات. تم تحديد حجم بواسطة التصوير العينات المجهرية من إنتاج ثلاث دفعات منفصلة. الصور التي تم التقاطها بواسطة المجهر الضوئي حيث أطوال وقياسها باستخدام برنامج المختبر التج?...

Watch this Scientific Journal Video about Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds at JoVE.com

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

عامل نمو Electrospinning الافراج الجزئي في الليفية السقالات

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Views.  Wayne State University. This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Video: Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Electrospinning أساسيات : الحل الأمثل ومعلمات جهاز

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS السقالات المرنة في هندسة الأنسجة الشرياني

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

محوار النمو الإمتداد : إن Mechanotransduction من نمو الخلايا العصبية

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

تسليم الجينات والخلايا البشرية في ترنسفكأيشن سرطان البنكرياس باستخدام مستقبلات عامل نمو البشرة استهداف الجيلاتين المستندة Nanovectors المهندسة

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun الليفية سقالات بولي (الجلسرين-dodecanedioate) للهندسة الأنسجة العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

دراسة رياضيات الكيمياء من البشرة عامل نمو مستقبلات في الخلايا السليمة باستخدام الميكروسكوب المتلازم

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة الجسيمات النانوية لتغليف عامل النمو العصبي

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

تذوب الكتابة اليكتروسبينينج من السقالات Poly(ε-caprolactone) ثلاثي الأبعاد مع مورفولوجيس يمكن السيطرة عليها لتطبيقات هندسة الأنسجة

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

تصنيع السقالات مصفوفة ديسيلولاريزيد المستمدة من الغضروف

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...