This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).

.1 מים / שמן / מים זוגי אמולסיה Microsphere ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להכין 2% ו0.5% w / v פתרונות של אלכוהול פוליוויניל (PVA) במים ללא יונים. מערבבים את הפתרונות על 50 מעלות צלזיוס עד ברור, זה עלול לקחת כמה שעות. הכן פתרון של 2% v / v איזופרופיל אלכוהול במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה מימית של חלבון הידרופילי רצוי. הטבלה שלהלן מספקת ניסוחים ירושלים. </li></ol><img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> טבלת 1:. פתרונות חלבון דוגמא פתרונות החלבון הבאים כבר במארז בהצלחה וelectrospun שימוש בפרוטוקול זה. ניתן להשתמש בפתרוני חלבון הידרופילי אחרים לפי צורך. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 40 מ&quot;ל של פתרון PVA 0.5% לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל ומניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל לפזר 300 מ&quot;ג של 65:35פולי (חומצה לקטית גליקולית שיתוף) (PLGA) ב 3 מ&quot;ל של dichloromethane. מיקסר מערבולת ניתן להשתמש כדי להאיץ את פירוק PLGA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 200 μl של פתרון חלבון ו4 μl של 2% פתרון PVA. יוצקים את תערובת החלבונים לתוך תמיסת PLGA (צעד 1.4). הפתרונות יישארו בעיקר נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור לתוך כוס של מי קרח. באמצעות sonicator שרביט ב ~ 10 ווטס (RMS), להתסיס את הפתרון לכמה שניות (5-10) ועד תחליב לבן וקרם אחיד נוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התחליב לתוך צינור 50 מ&quot;ל מכיל 0.5% PVA (שלב 1.3). מערבבים את הפתרון במהירות גבוהה במיקסר מערבולת ~ 20 שניות. הפתרון יהיה לפתח עכירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התחליב לכוס 200 מ&quot;ל ומניחים על צלחת ומערבבים ב350 סל&quot;ד למשך 2 דקות. הוסף 50 מ&quot;ל של 2% באלכוהול רפואי לכוס בצלחת ומערבבים. אפשר התערובת להמשיך ערבוב מינימאלי של שעה 1 כדי לאפשר DCM להתאדות וPLGA להקשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה tהוא microsphere פתרון לתוך צינורות צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב425 XG במשך 3 דקות. Microspheres יאסוף בחלק התחתון של הצינור ומופיע לבן. מוציא בזהירות את supernatant מהצינור, מעל microspheres, ולאחסן בבקבוק 500 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את microspheres עם מים ללא יונים על ידי מילוי הצינור שלושה רבעים מלאים וטלטלת אותה כדי להפיץ את microspheres בנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.10 &amp; 1.11 ארבעה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות השטיפה הסופית, להסיר את supernatant שוב ומניחים בבקבוק 500 מ&quot;ל עם דוגמאות האחרות. להקפיא את microspheres שנאסף בצינור צנטריפוגות, אז Lyophilize לפחות 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את microspheres תחת מיקרוסקופ אור או עם מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. Microspheres לא גדול יותר 60 מיקרומטר הוא לelectrospinning היעיל. אם microspheres הם גדול מדי, פעמים sonicating או vortexing יותר עשויות להידרש בשלב 1.6 או 1.7. </li> &lt;li&gt; חנות microspheres המיובש במקפיא -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: השתמש assay חלבון, לפי הוראות יצרן, כדי לבדוק את כמות החלבון בבקבוק 500 מ&quot;ל מצעד 1.10 30. זה משמש לחישוב אחוזים של חלבון במארז בmicrospheres, על ידי הפחתת הכמות בפתרון ממה שהיה בשימוש בתהליך הייצור. </li></ol> הערה: כדי להמחיש את מיקום החלבון בmicrosphere להוסיף Rhodamine 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל לפתרון PLGA 31 ובלתמצת חלבון מצומדות FITC איור 1 מציג דוגמא.. .2 Electrospinning עם מיקרוסכמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת פתרון electrospinning, ליצור פתרון 0.5% w / v של photoinitiator, במים ללא יונים על ידי ההמסה על 37 מעלות צלזיוס. תהליך זה יכול להימשך מספר שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור 2% w / v methacrylated חומצה היאלורונית (מהא) (ראה Burdick et al. לסינתזה) 29, 3%w / v 900 פולי KD (אתילן אוקסיד) (PEO) ו0.05% w / פתרון יוזם התמונה v במים ללא יונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמות הנכונה של מהא וPEO לעצמה הרצויה. לדוגמא, 10 מ&quot;ל של electrospinning פתרון דורש 200 מ&quot;ג של מהא ו300 מ&quot;ג של PEO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את PEO במים ללא יונים ב90% מהנפח הסופי הרצוי (9 מ&quot;ל לדוגמא זו). זה עלול לקחת כמה שעות, צלחת מחוממת ומערבבים או אמבט מים ב 37 C ° ניתן להשתמש כדי להאיץ את התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להוסיף מהא ולהשתמש במיקסר מערבולת לעורר הפתרון עד בהיר. זה ייקח רק כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף להוסיף את פתרון יוזם תמונה 0.5% למלא את שאר 10% הנפח (מ&quot;ל 1 לדוגמא זו). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת microspheres בריכוז הרצוי עד 400 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מערבבים את הפתרון על מיקסר מערבולת עד microspheres מפוזר באופן שווה בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון למזרק ולצרף bl 18 מד 6 אינץמחט קצה UNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק במשאבת מזרק ולהגדיר אותו לוותר ב1.2 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת שכבה של נייר אלומיניום על צלחת האוסף או mandrel. זה מאפשר לעד קל נקי ואחסון של הפיגום המוגמר. Mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים. צלחת שטוחה או mandrel הנייח תגרום לסיבים מסודרים באופן אקראי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את חוט הקרקע מכוח מקור מתח גבוה למנגנון הגבייה. חבר את התקע החיובי למחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את פני השטח משאבת מזרק וגבייה, כך שיש 15 סנטימטר בין קצה המחט ומשטח אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל שאיבת הפולימר, כאשר הפתרון נראה לעין בסוף המזרק, להפעיל את מקור המתח ולהגדיר את המתח ל24 ק זהירות:. ברגע שהמתח מופעל לא לגעת בשום חלק מתכתי של המערכת. תשלום יכול גם לקפוץ למרחקים קצרים מחלקים חשמליים לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הפתרון עד דעובי פיגום esired מושגת. כשיושלם לכבות מקור מתח ומשאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר רדיד עם פיגום מצורף. פיגומים שהושלמו מכילים חלבון מאוחסנים ב-20 ° C מקפיא. </li></ol> .3 חלבון את הפעילות הביולוגית של הבדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תרבית תאים. הוסף 10% v / v בסרום שור עוברי, 1% L-גלוטמין / v v, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין V / V לבינוני של הנשר השתנה Dulbecco. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית בחר שמתאים לחלוטין לצלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 methacrylate propyl (Trimethoxysilyl) לטיפול בcoverslips כפי שתואר על ידי היצרן. Methacrylation משפר דבקות פיגום לcoverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף coverslips methacrylated לאזור האוסף של electrospinner עם קלטת דו צדדית נשלפת לפני electrospinning. ספינינג על coverslips מקל טיפול וצפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrospin לעובי רצוי כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חרה electrospinning להסיר בזהירות coverslips מmandrel. מניחים את הפיגום coverslips המצופה לתוך תא חנקן ברור ולהבטיח כי כל החמצן מטוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר והפיגום תחת 2 ננומטר 365 אור 10 mW / cm במשך 15 דקות. לאחר crosslinking מקום לצלחת גם בגודל המתאים. ודא שצד הפיגום פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומי מקום מתחת לפנס קוטל חיידקים ל30 דקות לעקר. אם פיברונקטין הרצוי או חלבון אחר משמש כציפוי כדי לשפר את הידבקות תא. עקוב אחר ההוראות של היצרן לפיגומי מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר הגבי שורש הגרעינים (DRG) כפי שתוארו בעבר על ידי הולנבק 32. DRG אחד יהיה צורך לכל coverslip פיגום מכוסה נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 100-200 μl של תקשורת על כל פיגום בצלחת גם. בזהירות להניח DRG אחד על כל פיגום בטיפת התקשורת. לפיגום עבה ייתכן שתהיה צורך יותר בתקשורת; DRG צריך להיות שקוע באופן מלא ולא floaטינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפיגום וDRG על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר לתא לדבוק בפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את התקשורת לרמה המתאימה להיטב ומניח בחזרה לתוך החממה. המשך דוגרים במשך 4-6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה להסיר בזהירות את התקשורת מכל טוב ולשטוף בעדינות פעם עם PBS. תקן תאים ל30 דקות באמצעות 4% w / paraformaldehyde v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם באמצעות כתם נוגדן לneurofilament. זה יאפשר הדמיה של התוצאה neurite לכימות. גם DAPI יכול לשמש לצפייה בגרעינים של התאים. פרוטוקול דוגמא מכתים תואר על ידי Sundararaghavan ועמיתים 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת גם על הבמה של מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את מסת התאים באמצעות הגדרות מסננת ועירור לDAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתא הוא לעבור את המסנן לFITC לדמיין neurites המורחבת. Uלשיר פונקצית התפר במיקרוסקופ לאסוף ולשלב תמונות רבות ככל נחוץ כדי לראות את המבנה כולו. חזור על פעולה עבור DAPI, FITC ושדה בהיר. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+in+neural+tissue+engineering.">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li><li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering:+strategies+for+repair+and+regeneration.">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li><li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats.">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li><li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves.">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li><li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds.">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li><li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair.">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li><li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair.">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li><li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , (2006).</li><li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+nerve+guides:+materials,+fabrication,+growth+factors,+and+cell+delivery.">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li><li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li><li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczy&#324;ska, I., J&#281;drzejowska-Szypu&#322;ka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review.">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li><li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications:+perspectives+and+challenges.">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth.">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity.">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li><li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches.">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro.">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li><li>Casta&#241;o, O., Eltohamy, M., Kim, H. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration.">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li><li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers.">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li><li>Han, D., Gouma, P. -. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix.">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li><li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering.">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li><li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering.">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li><li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits.">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li><li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning:+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li><li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture.">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior.">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li><li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery:+current+technologies+and+selected+biomedical+applications.">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications.">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks.">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li><li>P&#233;an, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles.">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li><li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells.">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li><li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , (2003).</li><li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres.">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li><li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen.">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li><li>Madduri, S., di Summa, P., Papalo&#239;zos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats.">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor.">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li><li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration.">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li><li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications.">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+proteins+in+poly(L-lactide-co-caprolactone)+fibers+by+emulsion+electrospinning.">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li><li>Wang, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration.">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li><li>Liu, J. -. J., Wang, C. -. Y., Wang, J. -. G., Ruan, H. -. J., Fan, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly(lactic+acid-caprolactone)/nerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning.">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מחקרים רבים הראו שיכולים להיות מופנה תאי עצב על ידי רמזים טופוגרפיים (יישור סיבים) ואותות כימיים (גורמי גדילה) 1,2,10,11,35. Electrospinning הוא שיטה קלילה כדי ליצור סיבים מיושרים. גורמי גדילה לעודד צמיחת עצב אלא כדי לכלול אותם לתוך תעלות עצבים (NC), נדרשת שיטה לשחרור מושהה. כד?...

אחד האתגרים המתמשכים בהנדסת רקמות עצבית הוא יצירת צינור עצבי (NC) המחקה את המטריצה ​​סלולרית נוספת, שבו עצבים לגדול באופן טבעי. מחקרים הראו כי תאים מגיבים למספר גורמים בסביבה שלהם, כולל מכאני, טופוגרפי, דבק ואותות כימיים 1-3. אחד האתגרים העיקריים בתחום זה הוא קביעת השילוב המתאים של אותות ובודת מערכת שיכול לשמור על רמזים לתקופה ממושכת כדי לתמוך בצמיחת תא 4. נוירונים היקפיים ידועים מעדיפים מצע רך, יופנה על ידי סיבים מיושרים, ומגיב לגורם גדילה העצבית (NGF) 5-7. NCS שיכול לספק רמזים כימיים לשבועות הוכח לספק התאוששות תפקודית משופרת קרוב יותר לזה של allografts, תקן הזהב הנוכחי לתיקון עצב 8,9. שונות חומרים ושיטות ייצור יכול לשמש לייצור מכאני וטופוגרפיאל מקלות 10-13. רמזים מכאניים הם גלום בחומר שנבחר, מה שהופך את הבחירה של החומר המתאים ליישום הקריטי 1,13. שיטות ייצור כדי לשלוט רמזים טופוגרפיים כוללים הפרדה פאזות, הרכבה עצמית וelectrospinning 1,13. גם עבור יישומי microscale, מיקרופלואידיקה, photopatterning, תחריט, מדיח מלח, או קצף גז יכול לשמש 14-17. Electrospinning התפתח כדרך הפופולרית ביותר למהנדס מצעים סיביים לתרבית רקמה בשל גמישות וקלות הייצור 13,18-23. nanofibers electrospun מיוצר על ידי יישום מתח גבוה לפתרון פולימר גורם לו להדוף את עצמו ולמתוח על פני פער קצר לפרוק 24. פיגום מיושר ניתן ליצור על ידי איסוף הסיבים על mandrel מסתובבת מקורקע ופיגומים הבלתי מזדהים נאספים על צלחת נייחת 25. איתות הידבקות יכולה להיות מושגת על ידי ציפוי שנינות פיגום הסיבייםפיברונקטין h או להטות פפטיד הידבקות, כגון RGD, לHA לפני electrospinning 26. אותות כימיים, כגון גורמי גדילה, הם הכי קשים לשמור לאורך תקופות ממושכות, כי הם זקוקים למקור לשחרור מבוקר. מערכות רבות כבר ניסינו להוסיף שחרור מבוקר לרשתות סיבי electrospun עם רמות שונות של הצלחה. שיטות אלה כוללות electrospinning תערובת, electrospinning תחליב, electrospinning פגז הליבה והצמיד חלבון 27. בנוסף, electrospinning נעשה באופן מסורתי בממס נדיף, אשר יכול לפגוע בכדאיות של החלבון 28, לכן שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבון יש לקחת בחשבון. גישה זו מציינת במפורש בשילוב אותות מכאניים, טופוגרפיים, כימי ודבק כדי ליצור פיגום מתכונן לצמיחת עצבים היקפית. מכניקת פיגום נשלטת דווקא על ידי סינתזהmethacrylated חומצה היאלורונית (HA). אתרי methacrylation משמשים לצרף crosslinkers תגובתי תמונה. חומר crosslinked הוא כבר לא מסיסים במים ומתפרק באופן בלעדי על ידי אנזימים 29. הסכום של crosslinking משנה את קצב הפירוק, מכניקה ומאפיינים פיזיים אחרים של החומר. באמצעות HA עם 30 methacrylation%, שבו יש מודול מתיחה של ~ 500 אבא, יוצר מצע רך שקרוב למכניקת הילידים של רקמה עצבית, והוא העדיף בדרך כלל על ידי נוירונים 26,29. Electrospinning על mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים לאות טופוגרפית. באמצעות electrospinning יחד עם microspheres מספק אותות כימיים בתוך הפיגום לאורך תקופות ממושכות. כדי לתמוך בmicrospheres צמיחת neurite מכיל NGF המשמשים ליצירת האות הכימית. שלא כמו רוב חומרי electrospun HA הוא מסיס במים ולכן NGF אינו נתקל ממסים קשים במהלך ייצור. כדי להוסיף אות דבק, SCAffold מצופה פיברונקטין. המערכת הושלמה מכילה את כל ארבעת סוגים של אותות שתוארו לעיל: סיבים רכים (מכאניים) מיושרים (טופוגרפיים) עם NGF שחרור microspheres (כימי) מצופה בפיברונקטין (דבק). ייצור ובדיקה של מערכת זו מתוארת בפרוטוקול זה. התהליך מתחיל בייצור של microspheres עם זוגי אמולסיה מים-ב- שמן מים. התחליב הוא התייצב עם חומרים פעילי שטח, פוליוויניל אלכוהול (PVA). שלב המים הפנימי מכיל את החלבון. כפי שהוא הוסיף לשלב שמן, המכילים את חומר מעטפת PLGA מומס בdichloromethane (DCM), פעילי השטח יוצר מחסום בין שלבי הגנה על החלבון מDCM. אמולסיה זו היא יותר מאשר מפוזרת בשלב מים אחר המכיל PVA כדי ליצור את המשטח החיצוני של microspheres. התחליב היציב הוא עורר לאפשר DCM להתאדות. לאחר השטיפה וlyophilizing אתה נשאר עם המשך microspheres היבשaining החלבון. לאחר microspheres הושלם הם מוכנים להיות electrospun לפיגומים. ראשית, עליך להכין את פתרון electrospinning. הצמיגות של הפתרון היא קריטית להיווצרות סיבים נכונה. פתרונות של HA הטהור אינם עומדים בדרישה זו; PEO נוסף כפולימר מנשא כדי לאפשר electrospinning. Microspheres מתווספים לפתרון וelectrospun וכתוצאה מפיגום סיבי עם microspheres מופץ ברחבי. ברגע שהייצור הוא מלא, החלבון צריך להיבדק כדי לוודא את כדאיותה. כדי לעשות זאת, ניתן להשתמש בו תא ראשוני המגיב לNGF. פרוטוקול זה משתמש הגבי שורש הגרעינים (DRG) מעוברי עופות ישנים 8-10 יום. חבילות התא הם זורעים על גבי פיגומים המכילים microspheres מלא NGF או אלה כי הם ריקים. אם NGF הוא עדיין בת קיימא אתה צריך לראות צמיחת neurite משופרת על הפיגומים המכילים NGF. אם NGF הוא כבר לא בת קיימא זה יהיהלא לקדם neurites להרחיב ואמורה להופיע דומה לשליטה. ההליך המדויק שתואר במסמך זה מתמקד בתמיכה עצבית, לעומת זאת, עם שינויים פשוטים לחומר, שיטת electrospinning, וחלבוני המערכת יכולה להיות מותאמת לסוגים שונים של תאים ורקמות.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Prepare stock solution in DMSO</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Power Source</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>Motor</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Must attach to a custom built mandrel</td></tr><tr><td>Tachometer</td><td>Network Tool Warehouse</td><td>ESI-330</td><td>Use to monitor mandrel speed</td></tr><tr><td>Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Isoporopyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Protein Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

electrospinning growth factor releasing microspheres into fibrous scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

Microspheres 50 ± 14 מיקרומטר בקוטר עם אנקפסולציה חלבון מעל 85% הופקו באופן עקבי וelectrospun לפיגומים. גודל נקבע על ידי הדמיה דגימות של microspheres משלוש מנות ייצור נפרדות. התמונות שבו נתפסו על מיקרוסקופ אופטי ואורכים שבו נמדד באמצעות תוכנת מעבדה מסחרית. איור 1 מציגה היסטוגרמה...

Watch this Scientific Journal Video about Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds at JoVE.com

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Views.  Wayne State University. This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Video: Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned to completely random. In addition, fibers can be spun from a variety of materials, including biodegradable polymers such as poly-L-lactic acid (PLLA). These characteristics make electrospun fibers suitable for a variety of scaffolding applications in tissue engineering. Our focus is on the use of aligned electrospun fibers for nerve regeneration. We have previously shown that aligned electrospun PLLA fibers direct the outgrowth of both primary sensory and motor neurons in vitro. We maintain that the use of a primary cell culture system is essential when evaluating biomaterials to model real neurons found in vivo as closely as possible. Here, we describe techniques used in our laboratory to electrospin fibrous scaffolds and culture dorsal root ganglia explants, as well as dissociated sensory and motor neurons, on electrospun scaffolds. However, the electrospinning and/or culture techniques presented here are easily adapted for use in other applications.

Aligned electrospun fibers direct the growth of neurons in vitro and are a potential component of nerve regeneration scaffolds. We describe a procedure for preparing electrospun fiber substrates and the serum-free culture of primary rat E15 sensory (DRG) and motor neurons. Visualization of neurons by immunocytochemistry is also included.

תרבות מוטור ראשיים עצב סנסורי בתקשורת מוגדר על electrospun פולי-L-lactide nanofiber פיגומים

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

Neuroscience

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Expansion of Two-dimension Electrospun Nanofiber Mats into Three-dimension Scaffolds

Electrospinning has been the preferred technology in producing a synthetic, functional scaffold due to the biomimicry to extracellular matrix and the ease control of composition, structure, and diameter of fibers. However, despite these advantages, traditional electrospun nanofiber scaffolds come with limitations including disorganized nanofiber orientation, low porosity, small pore size, and mainly two-dimensional mats. As such, there is a great need for developing a new process for fabricating electrospun nanofiber scaffolds that can overcome the above limitations. Herein, a novel and simple method is outlined. A traditional 2D nanofiber mat is transformed into a 3D scaffold with desired thickness, gap distance, porosity, and nanotopographic cues to allow for cell seeding and proliferation through the depressurization of subcritical CO2 fluid. In addition to providing a scaffold for tissue regeneration to occur, this method also provides the opportunity to encapsulate bioactive molecules such as antimicrobial peptides for local drug delivery. The CO2 expanded nanofiber scaffolds hold great potential in tissue regeneration, wound healing, 3D tissue modeling, and topical drug delivery.

This article demonstrates the technique of expanding a traditional, two-dimension (2D) electrospun nanofiber mat into a three-dimension (3D) scaffold through the depressurization of subcritical CO2 fluid. These augmented scaffolds are 3D, closely mimic cellular nanotopographic cues, and preserve the functions of biologic molecules encapsulated within the nanofibers.

ההתרחבות של דו-מימד Electrospun Nanofiber מחצלות שלוש-מימד פיגומים

Electrospinning has been the preferred technology in producing a synthetic, functional scaffold due to the biomimicry to extracellular matrix and the ease ...

Genetics

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

בודה חומרים פולימריים עבור יישומים ביו-הידרופובי

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Biology

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to prevent and treat sexually transmitted infections (STIs). Moreover, many EF technologies focus on encapsulating the active agent, relative to utilizing the surface to impart biofunctionality. Here we describe a method to fabricate and surface-modify poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) electrospun fibers, with the potent antiviral lectin Griffithsin (GRFT). PLGA is an FDA-approved polymer that has been widely used in drug delivery due to its outstanding chemical and biocompatible properties. GRFT is a natural, potent, and safe lectin that possesses broad activity against numerous viruses including human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). When combined, GRFT-modified fibers have demonstrated potent inactivation of HIV-1 in vitro. This manuscript describes the methods to fabricate and characterize GRFT-modified EFs. First, PLGA is electrospun to create a fiber scaffold. Fibers are subsequently surface-modified with GRFT using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)chemistry. Scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the size and morphology of surface-modified formulations. Additionally, a gp120 or hemagglutinin (HA)-based ELISA may be used to quantify the amount of GRFT conjugated to, as well as GRFT desorption from the fiber surface. This protocol can be more widely applied to fabricate fibers that are surface-modified with a variety of different proteins.

This manuscript describes the procedure to fabricate and characterize Griffithsin-modified poly(lactic-co-glycolic acid) electrospun fibers that demonstrate potent adhesive and antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro. Methods used to synthesize, surface-modify, and characterize the resulting morphology, conjugation, and desorption of Griffithsin from surface-modified fibers are described.

ייצור ואפיון של סיבים Griffithsin-השתנה פיגומים לצורך מניעת מחלות המועברות

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...