The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

הערה: כל נהלי בעלי החיים אושרו ובוצעו בעמידה בתקנים של אוניברסיטת תל אביב לרפואה ע&quot;ש סאקלר מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC). 1. הכנת Media אוויר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 2 x 10 6 U-87 תאי MG בצלחת תרבות 10 סנטימטרים בנפח של 8 מיליליטר הבינוני של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו 1% פתרון הפניצילין / סטרפטומיצין / nystatin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 ° C; 5% CO 2 עד להשגת confluency המלא ב 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 10 מיליליטר, למשוך את כל המדיום מהצלחת ולסנן דרך פילטר 0.45 מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא שטיפת צלחת התאים, להוסיף פתרון 1 מיליליטר טריפסין (0.25%) ודגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל התאים מנותקים, להשבית טריפסין באמצעות לפחות 5 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS וpreform ספירת תאים. </li><li<html> &gt; ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מכשיר סלולארי, ספירה אחרת ולחשב את מספר התאים על פי שיטת הספירה בשימוש. הערה: זה ישמש מאוחר יותר על מנת לנרמל את ריכוז CM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את CM לבקבוק מסביב לתחתית כוס ולהתרכז במאייד סיבובי ואקום גבוה. על מנת להאיץ את התהליך, להגדיל את טמפרטורת אמבט 37 ° C, אם תרצה בכך. המשך עד CM משיג מרקם כמו דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ס&quot;מ אחד מצלחת התרבות ב400 מלוח μl. בעת שימוש בצלחת יותר מפעם אחת, להשתמש היקף שווה ערך. לדוגמא, עבור 2 צלחות תרבות, השתמש 800 μl. השתמש בכל צלחת במשך 4 עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להשוות שורות תאים שונות או טיפולים, להתאים את עוצמת הקול בהתאם ליחס התא שהתקבל בשלב 1.6. לדוגמא, אם צלחת אחת מכילה 1.5x תאים יותר, להוסיף 200 μl של תמיסת מלח כדי 400 μl קיים מראש. זה יהיה CM המותאם </li></ol>כותרת &quot;&gt; 2. ECM-לחקות ג&#39;ל Plug הרכבת החיסון לעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני inoculating ג&#39;ל ECM-לחקות לעכברים, להכין את החומרים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמיחה גורמים מופחתים ג&#39;ל ECM-לחקות ללא פנול (להפשיר לילה, יום לפני הניסוי, ב 4 ° C על קרח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכונת גילוח חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטמין וxylazine כדי להרדים את העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח 1,000 טיפים μl סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח מזרק 1 מיליליטר ו -27 מחטי G. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתכונן לכל עכבר צינור 1.5 מיליליטר Eppendorf המכיל 80 μl המותאם CM ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על צינור אחד, להוסיף 600 צמיחה גורמים קר כקרח μl ג&#39;ל ECM-לחקות מופחת ללא פנול שהפשיר לילה ב 4 ° C, על קרח. ג&#39;ל ECM-לחקות הוא נוזלי ב4 ° C ומתמצק בטמפרטורת גוף; על מנת למנוע את הג&#39;ל ECM-לחקות לחיזוק, השתמש 1,000 טיפים μl קר כקרח. מערבבים צינורות בזהירות מבלי להרכיב בועות ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי B 6 בן שבועעכברים / ג ALB באמצעות קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (מ&quot;ג 12 / קילוגרם). אשר הרדמה תקינה על פי טיפול בבעלי החיים המוסדי ועדת שימוש, כלומר לפני תחילת הניסוי. בעלי חיים הגיעו למטוס שלהם הראוי של הרדמה כאשר הם כבר לא מגיבים לקמצוץ הבוהן חברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את אזור הבטן של העכברים ולחטא באמצעות לשפשף / אלכוהול כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 1 מיליליטר קר ומחט 27 G להזריק את התוכן של תת עורי צינור Eppendorf. לבצע ההזרקה באיטיות כדי למנוע היווצרות בועה. ברגע שכל הנפח מנוהל, לא להוציא את המחט לכמה דקות, עד התמצקות מתרחשת. </li></ol> 3. הערכה של ECM-לחקות ג&#39;ל Plug כלי דם באמצעות אולטרסאונד הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש ידע קודם של הפעלת מערכת אולטרסאונד הדמיה, או הסיוע של טכנאי מוסמך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל, יש לי following חומרים ומכשירים מוכנים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכונת גילוח חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . קרם מקריח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטמין וxylazine כדי להרדים את העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -ממוקד ללא microbubbles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר הפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת הדמיה בארה&quot;ב כולל בדיקה 708 55 MHz וmicromanipulator רכישת 3D. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד כלי דם בתוך התקעים שלושה שבועות לאחר חיסון: הערה: במודל החיה מבוסס MG U-87, 3 שבועות נמצאו לייצג את נקודת הזמן האידיאלית להדמיה. תחת הגדרות שונות, לכייל קינטיקה כלי דם החל מכמה ימים לאחר חיסון של תקעים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים באמצעות קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (12 מ&quot;ג / קילוגרם). אשר הרדמה תקינה על פי טיפול בבעלי החיים המוסדי ועדת שימוש, כלומר לפני תחילת הניסוי. בעלי חיים הגיעו למטוס שלהם הראוי של הרדמה כאשר הם כבר לא מגיבים לקמצוץ הבוהן חברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלחאזור בטן של העכברים ולטפל עם קרם מקריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את עכברי supinely על הבמה של מיקרו-מניפולטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מי מלח המכיל מזרק 1 מיליליטר ומחט G 30, למקם את המחט בתוך וריד הזנב, לתקן את המחט בחוזקה ולשחרר את המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר עבור הפעלת רכישת תמונת 3D במצב ניגודיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;3D&quot; כדי לאתחל את שלב מנוע 3D ומניח את המתמר באמצע אזור הסריקה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;3D&quot; וקלט גודל מרחק וצעד הסריקה, ולאחר מכן לחץ &quot;סריקה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכל התוספת נסרקה בנתוני תמונת 3D מוצג. אם לא, להתאים את המתמר, כך שכל התוספת גלויה בצעד הסריקה וחזור על 3.5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;ניגודיות&quot; ולדחוף את פיצוי רווח הזמן (TGC) שולט בצד השמאל כדי להכהות את התמונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את microbubbles בעזרת מערבל בקבוקון שהוא designated להפעלת microbubbles במשך 45 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במזרק 1 מיליליטר 50 μl של microbubbles עם 50 מלוח μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המזרק רופף המכיל תמיסת מלח עם מזרק המכיל microbubbles הופעלה. להזריק את microbubbles המדולל לוריד הזנב של העכברים, לחכות כמה שניות לבועות להגיע למצב יציב, ולאחר מכן לרכוש cine לולאת חומר ניגוד 3D של התקע, באמצעות מנוע רכישת 3D: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;3D&quot; לחץ ובחר באפשרות &quot;סריקה&quot; לרכוש תמונות contrast-enhanced 3D ולאחר מכן לחץ על &quot;Cine חנות&quot; כדי לשמור את נתוני תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;3D&quot; ולחץ על &quot;להשמיד 3D&quot; אבדון microbubbles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;3D&quot; לחץ שוב ובחר &quot;סריקה&quot; לרכוש cine לולאת הודעה הרס, לאחר מכן לחץ על &quot;Cine חנות&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את שכבת מסגרות תמונה של לפני ואחרי חורבן microbubbles: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וב# 8220; הגדרות הפניה &quot;בצד השמאל של המסך לחץ על&quot; צור התייחסות &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;ניהול המחקר&quot; לחץ כדי לפתוח את cine הלולאה מראש הרס שנרכשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;Cine תהליך&quot; כדי ליצור את שכבת הניגוד הירוקה, לאחר מכן לחץ על &quot;Load Into 3D&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ההדמיה בארה&quot;ב על מנת לכמת את תמונת 3D וכתוצאה מכך לדם בתוך התקעים נפח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;הסריקה / Freeze&quot; ולאחר מכן לחץ על &quot;הגדרות מצב&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;נפח&quot; ובחר &quot;מקביל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור 3D נפח של רקמת המטרה על ידי פילוח סדרה של קווי המתאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;סיום&quot; כדי להשלים את הפילוח. הערה: נפח חומר הניגוד של יוצג בצד השמאלי התחתון של המסך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של ההליך, מקום עכברים בסביבה חמה, נקייה, יבשה, שקטה הרחק מבעלי חיים אחרים. לספק חום באמצעות כרית זמינה מסחרי כירורגית חימום או מנורת ליבון (50-75 ואט), להציב 12-14 סנטימטרים ממכרסמים. צג עכברים ברציפות עד שמירה על יציבה זקופה וההליכה בדרך כלל. </li></ol></li></ol> 4. הערכה של ECM-לחקות ג&#39;ל Plug כלי דם מורפולוגיה שימוש fibered Confocal Endomicroscopy הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוצעת הדמיה בארה&quot;ב מייד לאחר וזה דורש ידע קודם של הפעלת מערכת fibered confocal ההדמיה endomicroscopy, או הסיוע של טכנאי מוסמך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל, יש לי החומרים ומכשירים מוכנים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים כמו מלקחיים, מספריים וחוטי תפירה נספגים ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> dextran מצומדות-FITC (70 KDA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות כיול (שלושה צינורות כל מי חמצן המכיל, מים או פתרון ניאון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת ההדמיה ובדיקה מתאימה להדמיה של כלי דם על פי יצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים באמצעות קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (12 מ&quot;ג / קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל iv, דרך וריד הזנב, 200 μl של 10 מ&quot;ג / dextran שכותרתו FITC מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור הבטן באמצעות לשפשף / אלכוהול כירורגית ולהחיל חתך קטן של כ 1 סנטימטר מהתקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חללית endomicroscopy על גבי התקע בעדינות, תוך שמירה על התוספת בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהבדיקה מוגדרת בתוספת, לחץ על &quot;התחל לייזר&quot; באמצעות דוושת הרגל. הקרינה צריכה להיות מוצגת על המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש סרטים קצרים (עד 30 שניות) על ידי לחיצה על &#39;רשומה&#39; על המסך או על &#39;בחרו&#39; באמצעות דוושת הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין סרטים, לשטוף את הבדיקה על ידי הצבת הקצה במים צינור המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, להסיר את הבדיקה ולנקות את הקצה עם קצה כותנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח ממוצע veקוטר SSEL: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הסמל &quot;זיהוי microvessels&quot; בפנל העליון כדי לפתוח את חלון מודול איתור הכלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;העדפות&quot; וסמן &quot;Mean קוטר כלי&quot; ב&quot; סטטיסטיקה של עניין &quot;ו-&quot; ברים תצוגת היסטוגרמה &quot;במצב&quot; התצוגה &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;זיהוי&quot; כדי להציג את המדידות שנבחרו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את עוצמת אות ניאון באזורים סמוכים לכלי דם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;צור ROI המעגל&quot; בלוח השמאלי וליצור מעגל באזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;היסטוגרמה לחשב את ההחזר על ההשקעה בתוך&quot; כדי לחשב את הערכים הקשורים לאזור זה. </li></ol></li></ol> טיפול 5. הודעה-פרוצדוראלי של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של כל הליך הדמיה, מקום עכברים בסביבה חמה, נקייה, יבשה, שקטה הרחק מבעלי חיים אחרים. לספק חום באמצעות מסחרי-כרית vailable כירורגית חימום או מנורת ליבון (50-75 W), ממוקמת במרחק של 12-14 מכרסמים. צג עכברים ברציפות עד שמירה על יציבה זקופה וההליכה בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נוסף של כלי הדם &quot;תקעים בנקודות זמן נוספים, תחול תנאי ההתאוששות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את החתך הקטן באמצעות תפרים נספגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן שיכוך כאבים עכברים כגון עצירות (1 מ&quot;ג / קילוגרם) תת עורי, ולחזור לכלובים נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לכל בעלי החיים על מנת לקבוע אם טיפול במשככי כאבים נוסף הוא הכרחי ולהעריך מחדש מדי יום כדי לעקוב ולהעריך למצוקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת הסיום של הניסוי, להרדים עכברים על ידי isoflurane היישום הראשון, ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה נוספת תבוצע בשבועות הבאים את צעדי הדמיה הראשוניים, יש לשמור את כל הנהלים סטרילי ככל האפשר. לשפשף את עור כירורגית יש לבצע, wa סטרילייש להשתמש בטיפי ter וצמר גפן סטרילי כדי לנקות את הבדיקה endomicroscopy, והבדיקה יש לחטא בין כל בעלי חיים באמצעות מים סטריליים. </li></ol>

<ol>
	<li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth:+an+in+vivo+Matrigel+model.">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li><li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane,+heparin,+and+fibroblast+growth+factor.">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice.">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).</li><li>Adini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+cytometry:+a+novel+method+for+quantifying+angiogenesis+in+vivo.">Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo.</a> J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).</li><li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy:+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs.">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).</li><li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubbles+in+medical+imaging:+current+applications+and+future+directions.">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li><li>Kuliszewski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+endothelial+progenitor+cell+engraftment+using+contrast-enhanced+ultrasound+and+targeted+microbubbles.">Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles.</a> Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).</li><li>Stieger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats.">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li><li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents.">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li><li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors.">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שילוב שיטות הדמיה משלימות מאפשר הקניית המידע על הכלי-הדם הקטן בצפיפות, פונקציונלי והמורפולוגיה של רכיבי אנגיוגנזה שונים. CM Loading על תקעי ג&#39;ל ECM-לחקות יוצר מייקרו-סביבה של גידול, אשר מופרד מאוכלוסיות תאים אחרות, כמו תאי אנדותל, שגויסו וextravasate לתקע. <p class="jove_content" style=";te...

Assay אנגיוגנזה תקע matrigel תואר לראשונה על ידי Kibbey et al. בשנת 1992, שבו הוא משמש להערכת גירוי אנגיוגנזה ידי SIKVAV פפטיד (Ser-איל-ליס-Val-עלא-Val) 1. בניגוד למבחני אנגיוגנזה אחרים in vivo, כמו אנגיוגנזה קרנית העכבר או מבחני קרום chorioallantoic חומוס, assay זה הוא קל יחסית לביצוע 2. ג&#39;ל ECM-לחקות המוזרק עלול להכיל תאים, פרו-angiogenic או תרכובות ו / או גורמים אנטי-angiogenic. כאשר אנו מעריכים את הפעילות של תרכובת אנטי angiogenic, התקע בדרך כלל מכיל תערובת של גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF), והחומר אנטי-angiogenic יכול להינתן ישירות לתקע או מערכתי 3, 4. ג&#39;ל ECM-לחקות מוזרק מתחת לעור שבו הוא מתקשה תוך דקות. הערכה של גיוס כלי דם בתקע וכתוצאה מכך היא typically מבוצע על ידי מדידת רמות המוגלובין בתוך התקע, על ידי מדידת אותות הקרינה לאחר ההזרקה של isothiocyanate והעמסת (FITC), שכותרת dextran, על ידי immunostaining סעיפים היסטולוגיה לסמנים האנדותל ספציפי או על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS) 2,5, 6. עם זאת, הערכה זו מאפשרת רק ניתוח נקודת סיום וחסר מידע על פונקציונלי והמורפולוגיה של כלי דם. בנוסף, מדידות של נפח פלזמה, בין אם על ידי רמות המוגלובין או באמצעות dextran-FITC כאינדיקטור, עלולה להטעות שכן תוכן דם מושפע מגודלם של כלי דם ומידת ברכות עומדות של דם. זה חיוני במיוחד כאשר כלי הדם גויס מאופיין בחדירות המשופרות והשפעת ההחזקה (EPR) 7. אנו מציעים במסמך זה, שיטה חדשה, מדויקת יותר להדמיה של כלי הדם גויסו על ידי שילוב של שתי שיטות הדמיה משלימות. HIGmicrobubbles הרזולוציה h אולטרסאונד בניגוד משופר (ארה&quot;ב) בשילוב עם fibred-confocal endomicroscopy intravital יכול לספק מידע לא רק על צפיפות כלי דם, אלא גם על המורפולוגיה והפונקציונליות שלהם. יתר על כן, ניתוח זה יכול להתבצע במספר נקודות זמן ובכך מאפשרות ניטור של קינטיקה אנגיוגנזה. ארה&quot;ב היא שיטת הדמיה בשימוש נרחב אשר ברשותה רזולוציה מרחבית גבוהה להדמית כלי הדם הבא (iv) הזרקה תוך ורידית של microbubbles שתישאר באופן בלעדי בתא של כלי דם 8-11. Microbubbles היא microbubbles מלאת גז שמייצרת אות echogenic חזקה כאשר נרגש עם דופק ארה&quot;ב ובכך לשמש כחומר ניגוד טוב. תמונות 3D של התקע נרכשות באמצעות תוכנת מערכת ההדמיה בארה&quot;ב בעקבות הרס microbubbles. תמונות וכתוצאה מכך מורכבות ממסגרות תמונה של הרס-לפני ואחרי של microbubbles ומשקפות את ההבדל בעוצמת וידאו בצבע. יכסה אלהתמונות מוצגות באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כתוצאה מכך, אחוז מכולים הפונקציונליים בתוך התוספת ניתן לכמת. רזולוציה גבוהה fibered endomicroscopy confocal משמשת כשיטת הדמיה משלימה על ידי דיווח על מורפולוגיה כלי דם. בשיטה זעיר פולשנית זה, תמונות שנרכשו לאחר נטילת iv של dextran FITC מצומדות- 12. פולימר צבעי ניאון זרם הדם ובכך משמש כ&#39;חומר ניגוד &#39;למורפולוגיה כלי דם וזרימת דם. יתר על כן, מאז הפולימר המוזרק הוא בגודל של 70 kDa, זה יכול רק לחצות כלי דולפים כפי שנמצא בכלי דם של גידול. זה יגרום רקע גבוה מdextran FITC שכותרתו מחוץ לכלי הדם. כתוצאה מכך, endomicroscopy confocal fibered יכול לשמש כדי לחזות מאפיינים טיפוסיים של השפעת EPR בגידול neovasculature- כלי מוגדלים, דולפים, סבוכים-מאוד, עם קצוות קהים. מודל מערכת זו descriמיטה בהשוואה לפוטנציאל angiogenic של גליובלסטומה אדם U-87 MG והשיבוט הרדום שלה 13. כלי דם בתוך התקעים הוערכו שלושה שבועות חיסון הודעת ג&#39;ל ECM-לחקות. זה היה הראה כי כלי הדם בתוך תקעים המכילים CM מU-87 MG מהיר גדל תאים מניבי גידול היה גדלו באופן משמעותי במונחים של מספר, צפיפות ופונקציונליות, בהשוואה לכלי דם בתוך תקעים המכילים CM מהתאים מניב גידול הרדומים. לפיכך, המחברים הצליחו להגיע למסקנה שCM מבודד מU-87 MG מהיר גדל תאים מניבי גידול מכיל רמות גבוהות יותר של גורמים פרו-angiogenic, לעומת CM מהתאים מניב גידול רדומים. גורמים אלה מעוררים את היווצרותם של כלי דם פונקציונליים על ידי באופן חיובי משפיע על כל השלבים של מפל angiogenic (כלומר, התפשטות, הנבטה, ההגירה וסופו של דבר, ההיווצרות של מבנים צינוריים של תאי אנדותל).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Company</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Catalog number</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Rotary Vacuum Evaporator</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">BD Bioscience</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">FAL356231</td>
			<td style="width:251px;">Thaw overnight, at 40C on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Depilatory cream&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 US imaging system</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">55 MHz 708 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 imaging software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">VialMix&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VMIX</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">DEFINITY microbubbles</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DE4</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Activate for 45 seconds using Vialmix before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ProFlex MiniO/30 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">70 kD FITC-labeled Dextran</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">46945</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ImageCell software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Calibration Kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td align="left">Gibco Life Tecchnologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td align="left" height="37" style="height:37px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td align="left" height="39" style="height:39px;">Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring functionality and morphology of vasculature recruited by factors secreted by fast-growing tumor-generating cells

Assay תקע matrigel תת-עורי בעכברים הוא שיטת הבחירה להערכת in vivo של גורמים פרו ואנטי-angiogenic. בשיטה זו, גורמים רצויים מוכנסים ג&#39;ל ECM-לחקות קר-הנוזלי ש, לאחר הזרקה תת עורית, מתמצק ליצירת סביבה מחקה את הסביבה בסרטן. מטריצה ​​זו מאפשרת החדירה של תאי מארח, כגון תאי אנדותל, ולכן, ההיווצרות של כלי דם. במסמך זה אנו מציעים בדיקה חדשה ששונתה תקע matrigel, אשר יכול להיות מנוצלת כדי להמחיש את פוטנציאל angiogenic של בריכה של גורמים המופרשים על ידי תאי סרטן, בניגוד לגורם ספציפי (למשל, bFGF וVEGF) או סוכן. התקע המכיל ג&#39;ל ECM-לחקות מנוצל כדי להציג את המארח (כלומר, עכבר) עם בריכה של גורמים המופרשים לCM של תאי גליובלסטומה מניב גידול בצמיחה מהירה. שתארנו השוואה מקיפה של פוטנציאל angiogenic של עברגליובלסטומה U-87 MG אדם והשיבוט הנגזר הרדום שלה, במודל מערכת זו, המציגה אנגיוגנזה המושרית בU-87 התאים MG ההורים. CM הוא הוכן על ידי סינון תקשורת שנאספו מצלחות תרבית רקמה ומחוברות של שני שורות תאים הבאים דגירה 48 שעות. מכאן, שהוא מכיל גורמים היחידים המופרשים על ידי התאים, ללא התאים עצמם. שתוארה כאן הוא השילוב של שתי שיטות הדמיה, microbubbles הדמיה אולטרסאונד חומר ניגוד וendomicroscopy fibered-confocal intravital, לאפיון מדויק, בזמן אמת של המידה, המורפולוגיה ופונקציונליות של כלי דם חדש שיוקמו בתוך התקעים.

השתלת תקעי ג&#39;ל ECM-לחקות עם CM משורת תאים מניב גידול angiogenic בצמיחה מהירה U-87 MG, תוצאות באנגיוגנזה הנרחבת. כלי דם זה יכול להיות חוקרים בהרחבה על ידי שימוש בשתי שיטות הדמיה משלימות. ההדמיה בארה&quot;ב חומר ניגוד microbubbles מגלה גיוס נרחב של כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells at JoVE.com

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Tel Aviv University. We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Video: Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

דיקור ניטור השפעות על המוח האנושי על ידי fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

ב אנדוציטוזה כבד vivo ואחריו טיהור בתאי הכבד על ידי זלוף כבד

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה &#39;Peroxidative&#39; ו &#39;חמצוני &quot;footprinting רדיקלי הידרוקסיל

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

בתכנות מחדש vivo של תאים סומטיים למבוגרים לpluripotency ידי ביטוי יתר של גורמי יאמאנאקה

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

ניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים חיידקיים על ידי Cocultivation של זנים שכותרתו פלואורסצנטית

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...