ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

הפרוטוקול הבא מתבצע על פי הנחיות שנקבעו על ידי המחלקה לבעלי חיים במעבדה לרפואה באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל. 1. מכין את החומר וריאגנטים הבאים לפני שמתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת EC על ידי השלמה הנמוך גלוקוז 400 מיליליטר השתנה בינוני של הנשר (DMEM) עם 50 מיליליטר סרום חום מומת שור עוברי, 50 מיליליטר נו-סרום IV, 5 מיליליטר אנטיביוטיקה antimycotic, (ז 1 / D-גלוקוז או L LG) של Dulbecco וhFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, ורכיבי הפרין מהערכה המסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ 500 מיליליטר FACS (BSA 0.5% ו- 2 mM EDTA ב PBS); לסנן באמצעות כוס סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר או לחטא לנתח לוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר סיכות לנתיחה, מספריים כירורגיות, ומבתרים. </li></ol> 2. בידוד EC (יום 1, ~ שעה 5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם פחמן דו חמצני או בשיטות אחרות שנינות תואמותמדיניות h ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC). הערה: גידולי החלב מרובים משתנים בגודלם (5 - 15 מ&quot;מ קוטר) עלולים לפתח בעכבר מהונדס גנטי בודד כגון C3-תג, כדי להיות בטוח לקצור את כולם לבידוד TEC. אם משתמשים בגידולי הengrafted orthotopically בעכברים, בריכה שתיים עד שלוש 1 סנטימטר 3 גידולים לבידוד EC יחיד. כאן אנו משתמשים גידולי החלב כהפגנה, אבל הפרוטוקול יכול להיות שונה עבור סוגים אחרים של גידולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא עכבר על ידי ריסוס או לנגב את צד הגחון העכבר עם כמות גדולה של אתנול 75% V / V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות גידולים עם זוג אחד של מספריים ומבתרים תוך שימוש בטכניקות אספטיים במנדף סטרילי או בספסל נקי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתרע ולהצמיד את הגפיים של העכברים על לוח לנתח. לעשות חתך הגחון קו האמצע עם המספריים מבלי לפתוח את הצפק. לנתח רוחבי בין העור והצפק לבלוטות החלב שבו גידולים ממוקמים.אל תפתח את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו רק רקמת גידול מבלוטות החלב, ומשאיר את שוליים החלב רגילים. לקצץ בזהירות את רקמות שאינן סרטניים כגון עור ושרירים, ולמקם את הגידולים גזור בצינור חרוטי המכילים 30 מיליליטר של LG-DMEM על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא דגימות גידול למכסה מנוע תרבית רקמה; לשטוף רקמות עם LG-DMEM סטרילי 1 - 2 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת גידולים מצינור חרוטי לצלחת פטרי רקמות תרבות סטרילי, להוסיף 2 מיליליטר של LG-DMEM בצלחת, ובררו עם זוג המספריים סטרילי לחתיכות &lt;5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של collagenase (מניות = 2 מ&quot;ג / מיליליטר במאוזן מלח הפתרון של האנק, להלן HBSS), 1 מיליליטר של dispase (מניות = 2.5 U / ml בHBSS) ו -75 μl של deoxyribonuclease (מניות = 1 מ&quot;ג / מיליליטר PBS ) לצלחת פטרי. נפח כולל הוא עכשיו ~ 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תערובת collagenase / רקמות מצלחת פטרי לצינור רקמות Dissociator ולרוץ על Dissociator רקמה למשך 60 שניות פעמיים (שנקבע מראש ניתוק יחסי הציבורogram על Dissociator: 1,270 סיבובים הכולל להפעלה). דגירה עם אור רועד על שייקר במשך 75 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן מתעכל רקמת דרך מסננת תא 100 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מיליליטר. מסנן לשטוף עם 5 מיליליטר של חיץ FACS לשטוף את כל תאים שנותרו. ספין ב 280 XG במשך 5 דקות ולשאוב supernatant בזהירות מבלי להפריע תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 מיליליטר של חיץ מניית RBC תמוגה (10x) ב 9 מיליליטר של מים סטריליים. תאי דם אדום Lyse עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה (1x), ומייד ספין 5 דקות ב 280 x גרם. הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם הדם קטן גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 10 מיליליטר של חיץ FACS. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 10 μl של trypan כחול, ולספור תאי חיים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב ~ 10 7 תאים / μl 100. הוסף 10 μl של בלוק FCR להשעית תא 100 μl, דגירה על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן CD31 עכברוש אנטי עכבר PE-מצומדות פי. לטבלת 1 לדגור על קרח במשך 10 - 15 דקות וצינור קפיצי מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של חיץ FACS לצינור והספין ב 280 XG במשך 5 דקות. מוציא בזהירות את supernatant, ולשטוף את התא גלולה שוב עם 5 מיליליטר של חיץ FACS. צנטריפוגה לגלולת תאים. לשאוב supernatant ללא תא גלולה מטריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף microbeads חיץ ואנטי-PE FACS לפי טבלה 2 לדגור על קרח במשך 10 -. 15 דקות. צינור קפיצי מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של דגימות חיץ וספין FACS ב 280 XG במשך 5 דקות; לשטוף פעם אחת עם 5 מיליליטר של חיץ FACS ו צנטריפוגות שוב. לשאוב supernatant בלי גלולה מטרידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא נפח 300 μl במאגר FACS. ספין באמצעות 35 דקות צינור 5 כתרים מיקרומטר תא-מסננת ב 280 x גרם. השתמש 2 צינורות ונפח גדול יותר במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת multistand מגנטי ועמודות מגנטיות במכסת מנוע, לצרף לעמודה מפרידה ולאזן את העמודה עם 2 מיליליטר של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspiratדואר supernatant ו resuspend התא גלולה ב0.5-1 מיליליטר של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא דרך העמודה המגנטית equilibrated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS, ולאסוף זרימה דרך (FT) בצינור 15 מיליליטר (חלק FT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הטור את המפריד וelute עם 2 מיליליטר של חיץ FACS לעוד 15 צינור מיליליטר (חלק eluate). השתמש בוכנה כדי להבטיח את כל התאים מהטור. חזור על elution עוד פעמיים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין eluate ב 280 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של תקשורת EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותה מידה לחלק את חלק eluate (~ 6 מיליליטר) לתוך מנות ג&#39;לטין מצופה 10 סנטימטר. במשך שלושה 1 סנטימטר 3 גידולים, צלחת eluted תאים בלפחות ארבע צלחות. תאים לחלופין, צלחת eluted בריכוזים שונים בצלחות מרובות (לדוגמא., זרע 0.5 מיליליטר, 1 מיליליטר, 1.5 מיליליטר, ו -3 מיליליטר של eluate לארבע צלחות) כדי להבטיח שצלחת לא לפחות אחד זרע בדלילות עם תאי eluted. בדוק שconfluency של התאים המצורפים הוא ב~ 1% ביום שלמחרת (כלומר, 1.0 כ - 2.0 X 10 5 תאים מצורפים). הערה: התאים צריכים להיות מצופים דליל כך שמושבות EC יכולות ליצור מבלי שזוהמה על ידי סוגי תאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת שבריר FT בצלחת 10 סנטימטר אחד כדי לאפשר לתאים להתאושש O / N. בדוק שהצלחת היא 80 - 100% ומחוברות למחרת. להקפיא את התאים (-80 ° C) בתקשורת 250 μl הקפאת תאים בcryotube ולאחסן אותם בחנקן נוזלי למחרת. הערה: חלק FT יכול לשמש לבידוד תאים סרטניים בשלב מאוחר יותר ו / או כביקורת שלילית לניתוח ביטוי גני EC של השיבוטים EC המבודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. מושבות מתחילות טופס לאחר 7 - 10 ימים. ניתן לזהות מושבות EC קטנות כבר ביום 3. מארק המושבות עם סמן עדין קצה בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד ג אינו ספציפיאמות המקיפות את המושבות המזוהות עם קצה pippet 200 μl סטרילי. </li></ol> 3. טבעות שיבוט שימוש מושבה בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. טוהר EC ניתן לבדוק על ידי ה- LDL (DiI-AC-LDL) בנוסף על כ 5 - 7 ימים. הוסף 50 μl של LDL לכל 10 מיליליטר בינוני EC ודגירה של 3 - 4 שעות לפני בדיקת התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: LDL מרובה + השיבוטים EC יכול להיבחן ב~ יום 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל קצירת מושבות EC, כאשר הם מגיעים בקטרים ​​של 3 - 5 מ&quot;מ בגודל. (בחר מושבות גדולות כי הם ארוזים עם LDL תאים + קטנים לתוצאות הטובות ביותר.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני קצירת EC עם טבעות שיבוט, מראש מעיל כמה 6-גם צלחות עם ג&#39;לטין 0.5%. ג&#39;לטין לשאוב, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת EC היטב כל אחד, ולשמור על הצלחות בחממה עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את הלא-EC בשולי המושבות כדי לוודא שאין סוגי תאים אחרים יהיה לכוד בתוך טבעת השיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימושמיקרוסקופ שלב בניגוד (אובייקטיבי 4X או 10X), מתאר בסמן עדין קצה בתחתית צלחת תרבות האזורים המכילים מושבות EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת עם 10 מיליליטר של PBS ולהשאיר שכבה דקה מאוד של PBS בצלחת כאשר aspirating. (חשובה: כמות קטנה (~ 0.5 מיליליטר) של PBS ישמור תאי חיים במהלך הליך שיבוט-טבעת; גם, דבק רקמות זקוק למים כדי להתחבר.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר טבעת שיבוט של גודל מתאים. השתמש זוג המלקחיים לנתח להרים טבעת, ועם קצה pipet 10 μl באופן שווה להחיל כמות קטנה של דבק רקמות על טבעת השיבוט. הערה: השתמש רק בסכום מינימאלי (~ 0.2 μl לטבעת קטנה) של דבק רקמות על טבעות שיבוט, ולהפוך את דבק רקמות בטוח פרוש באופן שווה סביב המשטח התחתון, כדי להבטיח אטימה טובה. דבק רקמות מוגזם מייצר חום ויוצר סרטים שעלולות להרוג את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטבעת על שיבוט המושבה EC. לחץ בעדינות את טבעת השיבוט להדביק ריng לצלחת. ודא שהמושבות לא התייבשו לפני הדבקת הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד pipet 25 μl של פתרון ניתוק תא האנזימטית לזירת שיבוט דגירה דקות ~ 1 או עד שהתאים מחוברים באופן רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Pipet בטבעת שיבוט ירידה מבחינת לתוך היטב אחד של צלחת 6 היטב המכילה תקשורת EC המחוממת מראש. (חשוב: אין לטלטל את הצלחת לפזר תאים; EC מעדיף לגדול באשכולות צפופים.) שטוף את טבעת השיבוט עם 50-100 תקשורת EC μl לאסוף תאים רבים ככל האפשר, ולהעביר את כל שטיפות לתוך אותו 6-גם . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כמה מושבות בצלחת 10 סנטימטר קטנות מדי כדי לקצור, להוסיף 10 מיליליטר תקשורת טרי, תן ​​לגדול המושבות לעוד כמה ימים, ולחזור על התהליך שוב טבעת השיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מושבות שנקטפו ב6-גם צלחות עד 80 - ומחוברות 100%, והעברת תאים עד 3 בארות של צלחת 6 היטב, לפני הרחבתם בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. לגרד את תאים מזהמים. חזורסיבוב של הליך טבעת שיבוט אחר (שלבי 3.5-3.10) במידת צורך. שמור את התאים יחסית מחוברות (~ 60 - 70%), כאשר הרחבת. EC יכול להפסיק לגדול אם מצופה דליל מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין EC על ידי FACS, צביעה, PCR, וכו &#39;שים לב שדיל-AC-LDL הוא ניאון ועלול להפריע לPE או נוגדני ניאון אחרים לFACS. </li></ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis:+new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors.</a> Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instructive+role+of+the+vascular+niche+in+promoting+tumour+growth+and+tissue+repair+by+angiocrine+factors.">Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).</li><li>Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+endothelial+cells+directly+influence+cancer+progression.">Stromal endothelial cells directly influence cancer progression.</a> Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Beck, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vascular+niche+and+a+VEGF-Nrp1+loop+regulate+the+initiation+and+stemness+of+skin+tumours.">A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours.</a> Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429 (2012).</li><li>Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells.">Tumor endothelial cells.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+tumor+endothelium.">Molecular heterogeneity of tumor endothelium.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).</li><li>Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+endothelial+cells+based+on+their+increased+uptake+of+acetylated-low+density+lipoprotein.">Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein.</a> J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li><li>Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stable+molecular+signature+in+mammary+tumor+endothelial+cells+that+persists+in+vitro.">Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro.</a> Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).</li><li>Beijnum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+tumor+angiogenesis+dissected:+specific+targeting+of+colon+cancer+angiogenic+vasculature.">Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature.</a> Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).</li><li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+angiogenesis:+from+microscope+to+clinic.">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).</li><li>Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+abnormalities+of+blood+vessels+as+targets+in+cancer.">Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer.</a> Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).</li><li>Ghosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+endothelial+cells+exhibit+aberrant+Rho-mediated+mechanosensing+and+abnormal+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).</li><li>Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+express+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+but+not+ErbB3+and+are+responsive+to+EGF+and+to+EGFR+kinase+inhibitors.">Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors.</a> Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).</li><li>Hida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+endothelial+cells+with+cytogenetic+abnormalities.">Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities.</a> Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).</li><li>Dudley, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcification+of+multipotent+prostate+tumor+endothelium.">Calcification of multipotent prostate tumor endothelium.</a> Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).</li><li>Dunleavey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+channels+formed+by+subpopulations+of+PECAM1(+)+melanoma+cells.">Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells.</a> Nat. Comm. 5, 5200 (2014).</li><li>St Croix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+human+tumor+endothelium.">Genes expressed in human tumor endothelium.</a> Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).</li><li>Bhati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+human+breast+tumor+vascular+cells.">Molecular characterization of human breast tumor vascular cells.</a> Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).</li><li>Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+CYP24+in+the+tumor+microenvironment.">Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis.">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).</li><li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries.">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).</li><li>Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+differences+between+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries+revealed+by+microarray+analysis.">In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).</li><li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial/mesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2.">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -. H., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+endothelial+cells+with+osteogenic+differentiation+potential.">Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).</li><li>Ginsberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+direct+reprogramming+of+mature+amniotic+cells+into+endothelial+cells+by+ETS+factors+and+TGF&#946;+suppression.">Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGF&#946; suppression.</a> Cell. 151 (3), 559-575 (2012).</li><li>Sapino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD31+by+cells+of+extensive+ductal+in+situ+and+invasive+carcinomas+of+the+breast.">Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast.</a> J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).</li><li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations.">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li><li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+(EndMT)+during+vein+graft+remodeling.">TGF-&#946; signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).</li><li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie1+deficiency+induces+endothelial-mesenchymal+transition.">Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition.</a> EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+with+distinct+patterns+of+TGF&#946;-driven+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGF&#946;-driven endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+clonally+expanding+haematopoietic+compartment+in+bone+marrow.">Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow.</a> EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).</li><li>Sawamiphak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+regulates+VEGFR2+function+in+developmental+and+tumour+angiogenesis.">Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).</li><li>Chi, J. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+diversity+revealed+by+global+expression+profiling.">Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration.">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells.">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בשל הקשיים בהשגת תרבויות TEC העיקרי טהורות, רב במחקרי מבחנה TEC תחליף עם קווים זמינים מסחרי EC או EC העיקרי כגון וריד טבור האנושי EC (HUVEC) 13. עם זאת, אוכלוסיות אלה EC מרקמות נורמליות יכולות רק לשמש כמדד לTEC אשר נבדלים במידה ניכרת מעמיתיהם הרגילים. לדוגמא, TEC הם phenotypicall...

תאי האנדותל (EC) הם חיוניים במהלך הפיתוח של גידולים מוצקים. מייזום מתג angiogenic בגידולים רדומים להפצה וזריעה של גרורות באתרים מרוחקים, EC ליצור צינורות המספקים דם, חמצן וחומרים מזינים כדי לקיים את צמיחת גידול 1. כפי שהוצע לאחרונה, EC יש גם פונקציות זלוף-עצמאי ויוצר נישה שתומכת בצמיחה של תאי גזע סרטני ותאי סטרומה גידול אחרים 2-5. לפיכך, מטוהר ביותר גידול ספציפי EC (TEC) לתרבות במבחנה מאפשר ללימודים תפקודיים שיגרתי שישפוך אור על מנגנונים מולקולריים רומן תיווך אנגיוגנזה גידול ולדבר לחצות עם תאים סרטניים. EC הם מאוד מיוחדים בהתאם לרקמת המוצא 6. בשל האופי הטרוגני סוגים שונים של גידול ומייקרו-הסביבה של הגידול, TEC יכול גם להציג תכונות ייחודיות המשקפות את גידול o התמחות ספציפיו בכלי הדם. לדוגמא, יש שונות בולטות בחתימות ביטוי גנים בTEC מבודדות מסוגים או ציונים של גידולי 7,8 שונים. עם זאת, שיתוף טיהור תכופה של אי-EC, במיוחד fibroblasts הקשורים גידול ותאים סרטניים, עם TEC יכולה לבלבל ביטוי הגנום מנתח. סוגי התאים לא רצויים אלה הם בעייתיים במיוחד במחקרים המסתמכים על טווח ארוך בהרחבת מבחנה של תרבויות TEC. שתואר כאן היא שיטה באיכות גבוהה שמייצרת באופן עקבי תרבויות EC טהורות מגידולים ורקמות אחרות. בעקבות העשרת עמודת immunomagnetic של שברים EC והסרת מטוהר שיתוף הלא-EC, צעד שיבוט-טבעת נוספת כדי ללכוד מושבות EC טהורות משמשת 9. כל מושבה ניתן להרחיב בתרבות לקטעים מרובים ללא ההופעה של זיהום שאינו EC. שיטה זו גם תשואות שיבוטים EC מרובים מהליך בידוד יחיד, שהוא אידיאלי ללימוד אנדוההטרוגניות thelial. בנוסף, הוא הראה כי cre Cdh5: עכברי הכתב / L / L ZsGreen שלהם כלי רב ערך ליצירת EC &quot;ממופה גורל&quot; ובל יימחו-מסומן אשר לשמור על הקרינה ZsGreen בתרבות 10. עם התאמות קלות לפרוטוקול, שיטה זו צריכה להיות להתאמה לסוגי גידולים שונים או רקמות נורמליות.

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Bullet Kit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td>Not all components used</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (Hyclone)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Heat inactivated at 56 &amp;deg;C for 30 min</td></tr><tr><td>Nu-Serum IV</td><td>Corning</td><td>CB-51004</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBBS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 &amp;mu;m filter</td></tr><tr><td>75% v/v ethanol for disinfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE microbeads&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260-37</td><td></td></tr><tr><td>Cell freezing media (Bambanker)</td><td>Wako Chemicals</td><td>302-14681</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td>Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002004</td><td>Make stock concentration 1 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Dil-Ac-LDL</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-902</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CL</td><td></td></tr><tr><td>Enzymatic cell detachment solution (Accutase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin, 2% in water, tissue culture grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100ML</td><td>Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution</td></tr><tr><td>Mouse FcR Blocking Reagent&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Neutral protease (Dispase)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02104</td><td>Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS</td></tr><tr><td>PE-rat anti-mouse CD31 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4 %&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10 mm tissue culture dishes</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes (sterile)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes (sterile)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator&amp;nbsp; (MidiMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cloning rings (assorted sizes)</td><td>Bel-Art Products</td><td>378470000</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting board</td><td></td><td></td><td>Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting forceps and scissors</td><td></td><td></td><td>Sterilize before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting pins 2&quot;</td><td></td><td></td><td>Sterilize before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FACS tubes with 35 &amp;mu;m filter cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Filter cup (Stericup, 0.22 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Fine-tip marker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Tissue adhesive (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation</td></tr><tr><td>Tissue culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue dissociator (gentleMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Preset program &quot;m_impTumor_01&quot; used for tissue dissociation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate or rotary shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells

תאי גידול ספציפי מבודדים טרי אנדותל (TEC) יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה גידול ולשמש כמודל במבחנה לפיתוח מעכבי אנגיוגנזה חדשים לטיפול בסרטן. עם זאת, לטווח ארוך בהרחבת מבחנה של תאי האנדותל עכברי (EC) הוא מאתגר עקב סחיפה פנוטיפי בתרבות (מעבר אנדותל לmesenchymal) וזיהום עם לא-אירופי. זה נכון במיוחד עבור TEC הoutcompeted בקלות על ידי fibroblasts-מטוהר שיתוף או תאים סרטניים בתרבות. הנה, שיטת בידוד איכות גבוהה שמנצלת העשרת immunomagnetic בשילוב עם מבחר מושבה ובהרחבת מבחנה מתוארת. גישה זו יוצרת שברי EC טהורים שהם חופשיים לחלוטין של זיהום תאי סטרומה או גידול. כמו כן הוא הראה שcre Cdh5-לייחס שושלת: העכברים / ליטר ZsGreen s / l כתב, בשימוש עם הפרוטוקול מתואר במסמך זה, הינו כלי רב ערך כדי לוודא תאטוהר כמושבות EC המבודדות מעכברים אלה מראה הקרינה ZsGreen עמידה ומבריקה בתרבות.

EC מייצג רק קטין חלק מכלל אוכלוסיית התא ברוב הרקמות בוגרות 11. לכן חשוב לעיכול הרקמה שנקטפו במלואו לתוך השעיה תא בודד שמבטיחה את השחרור המקסימאלי של EC ממטריצה ​​תאית (ECM) ורקמות חיבור. מניסיוננו, בחירת immunomagnetic תיווך CD31 מספקת רק שברי EC מועשר אבל לא טהורים; לכן, עוד צ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

isolation-and-culture-expansion-of-tumor-specific-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models. 

Video: Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

בידוד של תאי אנדותל אדם נורמלי המעי הגס, סרטן המעי הגס - פרוטוקול משופר

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Cancer Research

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Developmental Biology

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Bioengineering

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Biology

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Neuroscience

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional veins. The purpose of this article is to carefully describe the establishment of a murine xenograft model that mimics human VM and is able to reflect patient heterogeneity. Hyper-activating non-inherited (somatic) TEK (TIE2) and PIK3CA mutations in endothelial cells (EC) have been identified as the main drivers of pathological vessel enlargement in VM. The following protocol describes the isolation, purification and expansion of patient-derived EC expressing mutant TIE2 and/or PIK3CA. These EC are injected subcutaneously into the back of immunodeficient athymic mice to generate ectatic vascular channels. Lesions generated with TIE2 or PIK3CA-mutant EC are visibly vascularized within 7&#8210;9 days of injection and recapitulate histopathological features of VM patient tissue. This VM xenograft model provides a reliable platform to investigate the cellular and molecular mechanisms driving VM formation and expansion. In addition, this model will be instrumental for translational studies testing the efficacy of novel drug candidates in preventing the abnormal vessel enlargement seen in human VM.

We present a detailed protocol to generate a murine xenograft model of venous malformation. This model is based on the subcutaneous injection of patient-derived endothelial cells containing hyper-activating TIE2 and/or PIK3CA gene mutations. Xenograft lesions closely recapitulate the histopathological features of VM patient tissue.

מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

בידוד של הכבד CD133 + בתאי גזע משובטים עבור הרחבת

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.