ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

הפרוטוקול הבא מתבצע על פי הנחיות שנקבעו על ידי המחלקה לבעלי חיים במעבדה לרפואה באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל. 1. מכין את החומר וריאגנטים הבאים לפני שמתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת EC על ידי השלמה הנמוך גלוקוז 400 מיליליטר השתנה בינוני של הנשר (DMEM) עם 50 מיליליטר סרום חום מומת שור עוברי, 50 מיליליטר נו-סרום IV, 5 מיליליטר אנטיביוטיקה antimycotic, (ז 1 / D-גלוקוז או L LG) של Dulbecco וhFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, ורכיבי הפרין מהערכה המסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ 500 מיליליטר FACS (BSA 0.5% ו- 2 mM EDTA ב PBS); לסנן באמצעות כוס סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר או לחטא לנתח לוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר סיכות לנתיחה, מספריים כירורגיות, ומבתרים. </li></ol> 2. בידוד EC (יום 1, ~ שעה 5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם פחמן דו חמצני או בשיטות אחרות שנינות תואמותמדיניות h ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC). הערה: גידולי החלב מרובים משתנים בגודלם (5 - 15 מ&quot;מ קוטר) עלולים לפתח בעכבר מהונדס גנטי בודד כגון C3-תג, כדי להיות בטוח לקצור את כולם לבידוד TEC. אם משתמשים בגידולי הengrafted orthotopically בעכברים, בריכה שתיים עד שלוש 1 סנטימטר 3 גידולים לבידוד EC יחיד. כאן אנו משתמשים גידולי החלב כהפגנה, אבל הפרוטוקול יכול להיות שונה עבור סוגים אחרים של גידולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא עכבר על ידי ריסוס או לנגב את צד הגחון העכבר עם כמות גדולה של אתנול 75% V / V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות גידולים עם זוג אחד של מספריים ומבתרים תוך שימוש בטכניקות אספטיים במנדף סטרילי או בספסל נקי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתרע ולהצמיד את הגפיים של העכברים על לוח לנתח. לעשות חתך הגחון קו האמצע עם המספריים מבלי לפתוח את הצפק. לנתח רוחבי בין העור והצפק לבלוטות החלב שבו גידולים ממוקמים.אל תפתח את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו רק רקמת גידול מבלוטות החלב, ומשאיר את שוליים החלב רגילים. לקצץ בזהירות את רקמות שאינן סרטניים כגון עור ושרירים, ולמקם את הגידולים גזור בצינור חרוטי המכילים 30 מיליליטר של LG-DMEM על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא דגימות גידול למכסה מנוע תרבית רקמה; לשטוף רקמות עם LG-DMEM סטרילי 1 - 2 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת גידולים מצינור חרוטי לצלחת פטרי רקמות תרבות סטרילי, להוסיף 2 מיליליטר של LG-DMEM בצלחת, ובררו עם זוג המספריים סטרילי לחתיכות &lt;5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של collagenase (מניות = 2 מ&quot;ג / מיליליטר במאוזן מלח הפתרון של האנק, להלן HBSS), 1 מיליליטר של dispase (מניות = 2.5 U / ml בHBSS) ו -75 μl של deoxyribonuclease (מניות = 1 מ&quot;ג / מיליליטר PBS ) לצלחת פטרי. נפח כולל הוא עכשיו ~ 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תערובת collagenase / רקמות מצלחת פטרי לצינור רקמות Dissociator ולרוץ על Dissociator רקמה למשך 60 שניות פעמיים (שנקבע מראש ניתוק יחסי הציבורogram על Dissociator: 1,270 סיבובים הכולל להפעלה). דגירה עם אור רועד על שייקר במשך 75 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן מתעכל רקמת דרך מסננת תא 100 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מיליליטר. מסנן לשטוף עם 5 מיליליטר של חיץ FACS לשטוף את כל תאים שנותרו. ספין ב 280 XG במשך 5 דקות ולשאוב supernatant בזהירות מבלי להפריע תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 מיליליטר של חיץ מניית RBC תמוגה (10x) ב 9 מיליליטר של מים סטריליים. תאי דם אדום Lyse עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה (1x), ומייד ספין 5 דקות ב 280 x גרם. הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם הדם קטן גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 10 מיליליטר של חיץ FACS. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 10 μl של trypan כחול, ולספור תאי חיים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב ~ 10 7 תאים / μl 100. הוסף 10 μl של בלוק FCR להשעית תא 100 μl, דגירה על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן CD31 עכברוש אנטי עכבר PE-מצומדות פי. לטבלת 1 לדגור על קרח במשך 10 - 15 דקות וצינור קפיצי מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של חיץ FACS לצינור והספין ב 280 XG במשך 5 דקות. מוציא בזהירות את supernatant, ולשטוף את התא גלולה שוב עם 5 מיליליטר של חיץ FACS. צנטריפוגה לגלולת תאים. לשאוב supernatant ללא תא גלולה מטריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף microbeads חיץ ואנטי-PE FACS לפי טבלה 2 לדגור על קרח במשך 10 -. 15 דקות. צינור קפיצי מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של דגימות חיץ וספין FACS ב 280 XG במשך 5 דקות; לשטוף פעם אחת עם 5 מיליליטר של חיץ FACS ו צנטריפוגות שוב. לשאוב supernatant בלי גלולה מטרידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא נפח 300 μl במאגר FACS. ספין באמצעות 35 דקות צינור 5 כתרים מיקרומטר תא-מסננת ב 280 x גרם. השתמש 2 צינורות ונפח גדול יותר במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת multistand מגנטי ועמודות מגנטיות במכסת מנוע, לצרף לעמודה מפרידה ולאזן את העמודה עם 2 מיליליטר של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspiratדואר supernatant ו resuspend התא גלולה ב0.5-1 מיליליטר של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא דרך העמודה המגנטית equilibrated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS, ולאסוף זרימה דרך (FT) בצינור 15 מיליליטר (חלק FT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הטור את המפריד וelute עם 2 מיליליטר של חיץ FACS לעוד 15 צינור מיליליטר (חלק eluate). השתמש בוכנה כדי להבטיח את כל התאים מהטור. חזור על elution עוד פעמיים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין eluate ב 280 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של תקשורת EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותה מידה לחלק את חלק eluate (~ 6 מיליליטר) לתוך מנות ג&#39;לטין מצופה 10 סנטימטר. במשך שלושה 1 סנטימטר 3 גידולים, צלחת eluted תאים בלפחות ארבע צלחות. תאים לחלופין, צלחת eluted בריכוזים שונים בצלחות מרובות (לדוגמא., זרע 0.5 מיליליטר, 1 מיליליטר, 1.5 מיליליטר, ו -3 מיליליטר של eluate לארבע צלחות) כדי להבטיח שצלחת לא לפחות אחד זרע בדלילות עם תאי eluted. בדוק שconfluency של התאים המצורפים הוא ב~ 1% ביום שלמחרת (כלומר, 1.0 כ - 2.0 X 10 5 תאים מצורפים). הערה: התאים צריכים להיות מצופים דליל כך שמושבות EC יכולות ליצור מבלי שזוהמה על ידי סוגי תאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת שבריר FT בצלחת 10 סנטימטר אחד כדי לאפשר לתאים להתאושש O / N. בדוק שהצלחת היא 80 - 100% ומחוברות למחרת. להקפיא את התאים (-80 ° C) בתקשורת 250 μl הקפאת תאים בcryotube ולאחסן אותם בחנקן נוזלי למחרת. הערה: חלק FT יכול לשמש לבידוד תאים סרטניים בשלב מאוחר יותר ו / או כביקורת שלילית לניתוח ביטוי גני EC של השיבוטים EC המבודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. מושבות מתחילות טופס לאחר 7 - 10 ימים. ניתן לזהות מושבות EC קטנות כבר ביום 3. מארק המושבות עם סמן עדין קצה בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד ג אינו ספציפיאמות המקיפות את המושבות המזוהות עם קצה pippet 200 μl סטרילי. </li></ol> 3. טבעות שיבוט שימוש מושבה בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. טוהר EC ניתן לבדוק על ידי ה- LDL (DiI-AC-LDL) בנוסף על כ 5 - 7 ימים. הוסף 50 μl של LDL לכל 10 מיליליטר בינוני EC ודגירה של 3 - 4 שעות לפני בדיקת התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: LDL מרובה + השיבוטים EC יכול להיבחן ב~ יום 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל קצירת מושבות EC, כאשר הם מגיעים בקטרים ​​של 3 - 5 מ&quot;מ בגודל. (בחר מושבות גדולות כי הם ארוזים עם LDL תאים + קטנים לתוצאות הטובות ביותר.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני קצירת EC עם טבעות שיבוט, מראש מעיל כמה 6-גם צלחות עם ג&#39;לטין 0.5%. ג&#39;לטין לשאוב, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת EC היטב כל אחד, ולשמור על הצלחות בחממה עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את הלא-EC בשולי המושבות כדי לוודא שאין סוגי תאים אחרים יהיה לכוד בתוך טבעת השיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימושמיקרוסקופ שלב בניגוד (אובייקטיבי 4X או 10X), מתאר בסמן עדין קצה בתחתית צלחת תרבות האזורים המכילים מושבות EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת עם 10 מיליליטר של PBS ולהשאיר שכבה דקה מאוד של PBS בצלחת כאשר aspirating. (חשובה: כמות קטנה (~ 0.5 מיליליטר) של PBS ישמור תאי חיים במהלך הליך שיבוט-טבעת; גם, דבק רקמות זקוק למים כדי להתחבר.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר טבעת שיבוט של גודל מתאים. השתמש זוג המלקחיים לנתח להרים טבעת, ועם קצה pipet 10 μl באופן שווה להחיל כמות קטנה של דבק רקמות על טבעת השיבוט. הערה: השתמש רק בסכום מינימאלי (~ 0.2 μl לטבעת קטנה) של דבק רקמות על טבעות שיבוט, ולהפוך את דבק רקמות בטוח פרוש באופן שווה סביב המשטח התחתון, כדי להבטיח אטימה טובה. דבק רקמות מוגזם מייצר חום ויוצר סרטים שעלולות להרוג את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטבעת על שיבוט המושבה EC. לחץ בעדינות את טבעת השיבוט להדביק ריng לצלחת. ודא שהמושבות לא התייבשו לפני הדבקת הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד pipet 25 μl של פתרון ניתוק תא האנזימטית לזירת שיבוט דגירה דקות ~ 1 או עד שהתאים מחוברים באופן רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Pipet בטבעת שיבוט ירידה מבחינת לתוך היטב אחד של צלחת 6 היטב המכילה תקשורת EC המחוממת מראש. (חשוב: אין לטלטל את הצלחת לפזר תאים; EC מעדיף לגדול באשכולות צפופים.) שטוף את טבעת השיבוט עם 50-100 תקשורת EC μl לאסוף תאים רבים ככל האפשר, ולהעביר את כל שטיפות לתוך אותו 6-גם . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כמה מושבות בצלחת 10 סנטימטר קטנות מדי כדי לקצור, להוסיף 10 מיליליטר תקשורת טרי, תן ​​לגדול המושבות לעוד כמה ימים, ולחזור על התהליך שוב טבעת השיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מושבות שנקטפו ב6-גם צלחות עד 80 - ומחוברות 100%, והעברת תאים עד 3 בארות של צלחת 6 היטב, לפני הרחבתם בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. לגרד את תאים מזהמים. חזורסיבוב של הליך טבעת שיבוט אחר (שלבי 3.5-3.10) במידת צורך. שמור את התאים יחסית מחוברות (~ 60 - 70%), כאשר הרחבת. EC יכול להפסיק לגדול אם מצופה דליל מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין EC על ידי FACS, צביעה, PCR, וכו &#39;שים לב שדיל-AC-LDL הוא ניאון ועלול להפריע לPE או נוגדני ניאון אחרים לFACS. </li></ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis:+new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors.</a> Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instructive+role+of+the+vascular+niche+in+promoting+tumour+growth+and+tissue+repair+by+angiocrine+factors.">Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).</li><li>Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+endothelial+cells+directly+influence+cancer+progression.">Stromal endothelial cells directly influence cancer progression.</a> Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Beck, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vascular+niche+and+a+VEGF-Nrp1+loop+regulate+the+initiation+and+stemness+of+skin+tumours.">A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours.</a> Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429 (2012).</li><li>Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells.">Tumor endothelial cells.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+tumor+endothelium.">Molecular heterogeneity of tumor endothelium.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).</li><li>Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+endothelial+cells+based+on+their+increased+uptake+of+acetylated-low+density+lipoprotein.">Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein.</a> J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li><li>Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stable+molecular+signature+in+mammary+tumor+endothelial+cells+that+persists+in+vitro.">Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro.</a> Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).</li><li>Beijnum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+tumor+angiogenesis+dissected:+specific+targeting+of+colon+cancer+angiogenic+vasculature.">Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature.</a> Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).</li><li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+angiogenesis:+from+microscope+to+clinic.">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).</li><li>Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+abnormalities+of+blood+vessels+as+targets+in+cancer.">Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer.</a> Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).</li><li>Ghosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+endothelial+cells+exhibit+aberrant+Rho-mediated+mechanosensing+and+abnormal+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).</li><li>Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+express+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+but+not+ErbB3+and+are+responsive+to+EGF+and+to+EGFR+kinase+inhibitors.">Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors.</a> Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).</li><li>Hida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+endothelial+cells+with+cytogenetic+abnormalities.">Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities.</a> Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).</li><li>Dudley, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcification+of+multipotent+prostate+tumor+endothelium.">Calcification of multipotent prostate tumor endothelium.</a> Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).</li><li>Dunleavey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+channels+formed+by+subpopulations+of+PECAM1(+)+melanoma+cells.">Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells.</a> Nat. Comm. 5, 5200 (2014).</li><li>St Croix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+human+tumor+endothelium.">Genes expressed in human tumor endothelium.</a> Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).</li><li>Bhati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+human+breast+tumor+vascular+cells.">Molecular characterization of human breast tumor vascular cells.</a> Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).</li><li>Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+CYP24+in+the+tumor+microenvironment.">Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis.">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).</li><li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries.">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).</li><li>Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+differences+between+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries+revealed+by+microarray+analysis.">In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).</li><li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial/mesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2.">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -. H., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+endothelial+cells+with+osteogenic+differentiation+potential.">Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).</li><li>Ginsberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+direct+reprogramming+of+mature+amniotic+cells+into+endothelial+cells+by+ETS+factors+and+TGF&#946;+suppression.">Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGF&#946; suppression.</a> Cell. 151 (3), 559-575 (2012).</li><li>Sapino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD31+by+cells+of+extensive+ductal+in+situ+and+invasive+carcinomas+of+the+breast.">Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast.</a> J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).</li><li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations.">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li><li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+(EndMT)+during+vein+graft+remodeling.">TGF-&#946; signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).</li><li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie1+deficiency+induces+endothelial-mesenchymal+transition.">Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition.</a> EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+with+distinct+patterns+of+TGF&#946;-driven+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGF&#946;-driven endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+clonally+expanding+haematopoietic+compartment+in+bone+marrow.">Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow.</a> EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).</li><li>Sawamiphak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+regulates+VEGFR2+function+in+developmental+and+tumour+angiogenesis.">Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).</li><li>Chi, J. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+diversity+revealed+by+global+expression+profiling.">Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration.">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells.">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בשל הקשיים בהשגת תרבויות TEC העיקרי טהורות, רב במחקרי מבחנה TEC תחליף עם קווים זמינים מסחרי EC או EC העיקרי כגון וריד טבור האנושי EC (HUVEC) 13. עם זאת, אוכלוסיות אלה EC מרקמות נורמליות יכולות רק לשמש כמדד לTEC אשר נבדלים במידה ניכרת מעמיתיהם הרגילים. לדוגמא, TEC הם phenotypicall...

תאי האנדותל (EC) הם חיוניים במהלך הפיתוח של גידולים מוצקים. מייזום מתג angiogenic בגידולים רדומים להפצה וזריעה של גרורות באתרים מרוחקים, EC ליצור צינורות המספקים דם, חמצן וחומרים מזינים כדי לקיים את צמיחת גידול 1. כפי שהוצע לאחרונה, EC יש גם פונקציות זלוף-עצמאי ויוצר נישה שתומכת בצמיחה של תאי גזע סרטני ותאי סטרומה גידול אחרים 2-5. לפיכך, מטוהר ביותר גידול ספציפי EC (TEC) לתרבות במבחנה מאפשר ללימודים תפקודיים שיגרתי שישפוך אור על מנגנונים מולקולריים רומן תיווך אנגיוגנזה גידול ולדבר לחצות עם תאים סרטניים. EC הם מאוד מיוחדים בהתאם לרקמת המוצא 6. בשל האופי הטרוגני סוגים שונים של גידול ומייקרו-הסביבה של הגידול, TEC יכול גם להציג תכונות ייחודיות המשקפות את גידול o התמחות ספציפיו בכלי הדם. לדוגמא, יש שונות בולטות בחתימות ביטוי גנים בTEC מבודדות מסוגים או ציונים של גידולי 7,8 שונים. עם זאת, שיתוף טיהור תכופה של אי-EC, במיוחד fibroblasts הקשורים גידול ותאים סרטניים, עם TEC יכולה לבלבל ביטוי הגנום מנתח. סוגי התאים לא רצויים אלה הם בעייתיים במיוחד במחקרים המסתמכים על טווח ארוך בהרחבת מבחנה של תרבויות TEC. שתואר כאן היא שיטה באיכות גבוהה שמייצרת באופן עקבי תרבויות EC טהורות מגידולים ורקמות אחרות. בעקבות העשרת עמודת immunomagnetic של שברים EC והסרת מטוהר שיתוף הלא-EC, צעד שיבוט-טבעת נוספת כדי ללכוד מושבות EC טהורות משמשת 9. כל מושבה ניתן להרחיב בתרבות לקטעים מרובים ללא ההופעה של זיהום שאינו EC. שיטה זו גם תשואות שיבוטים EC מרובים מהליך בידוד יחיד, שהוא אידיאלי ללימוד אנדוההטרוגניות thelial. בנוסף, הוא הראה כי cre Cdh5: עכברי הכתב / L / L ZsGreen שלהם כלי רב ערך ליצירת EC &quot;ממופה גורל&quot; ובל יימחו-מסומן אשר לשמור על הקרינה ZsGreen בתרבות 10. עם התאמות קלות לפרוטוקול, שיטה זו צריכה להיות להתאמה לסוגי גידולים שונים או רקמות נורמליות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Bullet Kit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td>Not all components used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (Hyclone)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated at 56&#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Serum IV</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-51004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 &#956;m filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% v/v ethanol for disinfection</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing media (Bambanker)</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>302-14681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II&#160;&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002004</td>
			<td>Make stock concentration 1 mg/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil-Ac-LDL</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>46-034-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymatic cell detachment solution (Accutase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393-100ML</td>
			<td>Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FcR Blocking Reagent&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral protease (Dispase)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS02104</td>
			<td>Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-rat anti-mouse CD31 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4 %&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes (sterile)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes (sterile)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator&#160; (MidiMACS)</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 100 &#956;m&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning rings (assorted sizes)</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>378470000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps and scissors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterilize before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins 2&#34;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterilize before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes with 35 &#956;m filter cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cup (Stericup, 0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip marker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive (Vetbond)</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociator (gentleMACS)</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Preset program &#34;m_impTumor_01&#34; used for tissue dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen freezer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate or rotary shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells

תאי גידול ספציפי מבודדים טרי אנדותל (TEC) יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה גידול ולשמש כמודל במבחנה לפיתוח מעכבי אנגיוגנזה חדשים לטיפול בסרטן. עם זאת, לטווח ארוך בהרחבת מבחנה של תאי האנדותל עכברי (EC) הוא מאתגר עקב סחיפה פנוטיפי בתרבות (מעבר אנדותל לmesenchymal) וזיהום עם לא-אירופי. זה נכון במיוחד עבור TEC הoutcompeted בקלות על ידי fibroblasts-מטוהר שיתוף או תאים סרטניים בתרבות. הנה, שיטת בידוד איכות גבוהה שמנצלת העשרת immunomagnetic בשילוב עם מבחר מושבה ובהרחבת מבחנה מתוארת. גישה זו יוצרת שברי EC טהורים שהם חופשיים לחלוטין של זיהום תאי סטרומה או גידול. כמו כן הוא הראה שcre Cdh5-לייחס שושלת: העכברים / ליטר ZsGreen s / l כתב, בשימוש עם הפרוטוקול מתואר במסמך זה, הינו כלי רב ערך כדי לוודא תאטוהר כמושבות EC המבודדות מעכברים אלה מראה הקרינה ZsGreen עמידה ומבריקה בתרבות.

EC מייצג רק קטין חלק מכלל אוכלוסיית התא ברוב הרקמות בוגרות 11. לכן חשוב לעיכול הרקמה שנקטפו במלואו לתוך השעיה תא בודד שמבטיחה את השחרור המקסימאלי של EC ממטריצה ​​תאית (ECM) ורקמות חיבור. מניסיוננו, בחירת immunomagnetic תיווך CD31 מספקת רק שברי EC מועשר אבל לא טהורים; לכן, עוד צ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

isolation-and-culture-expansion-of-tumor-specific-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models. 

Video: Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

בידוד של ובתאים אנדותל מן הבריאה מתנדבת ופוטנציאל הנדידה שלהם בהשפעת דגימות סרום לאחר ניתוח הלב

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite of these eccentric hamstring actions are concentric quadriceps actions, where the larger and likely stronger quadriceps straighten the knee. Therefore, to stabilize the lower limbs during movement, the hamstrings must eccentrically combat against the strong knee-straightening torque of the quadriceps. As such, eccentric hamstring strength expressed relative to concentric quadricep strength is commonly referred to as the &#34;functional ratio&#34; as most movements in sports require simultaneous concentric knee extension and eccentric knee flexion. To increase the strength, resiliency, and functional performance of the hamstrings, it is necessary to test and train the hamstrings at different eccentric speeds. The main purpose of this work is to provide instructions for measuring and interpreting eccentric hamstring strength. Techniques for measuring the functional ratio using isokinetic dynamometry are provided and sample data will be compared. Additionally, we briefly describe how to address hamstring strength deficiencies or unilateral strength differences using exercises that specifically focus on increasing eccentric hamstring strength.

The hamstrings are a group of muscles that are sometimes problematic for athletes, resulting in soft tissue injury in the lower limbs. To prevent such injuries, functional training of the hamstrings requires intensive eccentric contractions. Additionally, hamstring function should be tested in relation to quadricep function at different contraction speeds.

איזון שרירים: בדיקות והדרכה כוח שריר הירך אקסצנטרי פונקציונלי באוכלוסיות אתלטי

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...