The authors would like to acknowledge the CIHR for fellowship support of Steve Deimling and the Department of Paediatrics, University of Western Ontario for support of Steve Deimling, Rami Halabi and Stephanie Grover. This work was supported by the NSERC grant R2654A11 and an NSERC Discovery Accelerator Supplement

<ol>
	<li>Ninomiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-dependent+differential+cell+adhesion+in+Xenopus+causes+cell+sorting+in+vitro+but+not+in+the+embryo.">Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo.</a> J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).</li><li>Movassagh, M., Philpott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+differentiation+in+Xenopus+requires+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor,+p27Xic1.">Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1.</a> Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration,+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis.">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2.">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li><li>Deimling, S. J., Drysdale, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+is+required+to+regulate+anterior-posterior+patterning+in+the+Xenopus+lateral+plate+mesoderm.">Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm.</a> Mech Dev. , (2011).</li><li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus.">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cDNA+microarray+identification+of+genes+with+endodermal+organ+expression.">Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression.</a> Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).</li><li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos.">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum.">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li><li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+artificially+activated+ectoderm+(Rana+pipiens+and+Ambystoma+punctatum).">Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum).</a> Dev Biol. 6, 255-279 (1963).</li><li>Sato, S. M., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approach+to+dorsoanterior+development+in+Xenopus+laevis.">Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 137, 135-141 (1990).</li><li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus.">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li><li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo:+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis.">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li><li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+pronephric+development.">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li><li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XNkx-2.5,+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman:+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development.">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li><li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis.">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li><li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination.">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li></ol>

Authors have no competing financial interests to disclose.

היכולת להשתמש בכלאה באתר כדי להמחיש את דפוס הביטוי של גנים מסוימים נשארת השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לזיהוי איברים ספציפיים או סוגי תאים בעובר Xenopus. סיבה לכך הוא מספר יתרונות המוצעים על ידי טכניקה זו. הביטוי של גן יכול לזהות מבנים ספציפיים היטב לפני כל סימן היסטולוגית של בידול כגון במקרה של ביטוי nkx2.5 באבות הלב לפני כל תיחום ברור של תאים אלה 18. לאחר שכל חומרים כימיים נמצאים ביד, זה גם מאוד חסכוני. דור של רבים בדיקות בודדות, שניתן לעשות שימוש חוזר ביעילות, אפשר עם תוספת זמן קטן והשקעת העלות אחרת מאשר קבלת פלסמידים המקודדים את הגנים של עניין. מניסיוננו, ניתן לעשות שימוש חוזר בדיקות במשך שנים עם הפסד קטן בפעילות למרות דילולים הקטנים בלתי נמנעים שמגיעים עם כל שימוש. לבסוף, יש requi אופטימיזציה הקטןאדום כאשר ניצול בדיקות שונות. האיכות של סינתזת הבדיקה היא גורם מפתח בהצלחתה של הפרוטוקול. ישנן דרכים רבות כדי לבדוק את האיכות של חללית RNA אלא פשוט מפעילה את הבדיקה RNA על ג&#39;ל טה היא שיטה מהירה וקלה שהיא די אמין. אנו משתמשים באופן שיגרתי ברומיד ethidium להכתים את RNA וזה דורש טיפול מיוחד ורשותו של ג &#39;על ידי רוב המוסדות. חלופות שאינן רעילות זמינות מסחרי למרות שאנחנו לא בהשוואה במיוחד אלה לבדיקות הדמיה. הבדיקה צריכה לרוץ כלהקה אחת למרות שזה יופיע מטושטש במקצת בהשוואה ל- DNA על ג&#39;ל טה. ניתן להשיג אומדן כמות RNA: תגובה טובה תהיה על 1 מיקרוגרם / μl של RNA. להקה דמיין בקלות תייצג לפחות 0.5 מיקרוגרם של RNA ולהקה בהירה תייצג מעל 1 מיקרוגרם. למרות שברור שלא לגמרי מדויק ודורש קצת ניסיון, כימות מבוסס על ג&#39;ל הוא ראפid וחוסנו של הליך באתרו מאפשר לו לעבוד היטב. אם קיים חשש לגבי הדירות, אפשר בקלות להשתמש ספיגת UV לכמת כמות קטנה של תגובת השעתוק, אם כי לא מצאו את זה כדי להיות דאגה העיקרית. לבסוף, ג&#39;ל מאפשר לאדם לראות אם תבנית ה- DNA כבר בוטל. אם הג&#39;ל מציין כי אין RNA, שני ההסברים הסביר ביותר הם תבנית ה- DNA רעה או שחיץ השעתוק לא עובד טוב. חימום חיץ השעתוק עד 37 מעלות צלזיוס וערבוב יסודי לפני השימוש, או תוספת של 1 μl של טרי 100 מ&quot;מ DTT לתגובת השעתוק יכול לעתים לעזור בזה האחרון. מרכיב חשוב של חיץ תגובת השעתוק הוא spermidine וזה יכול לזרז את תבנית ה- DNA בטמפרטורות נמוכות מה שהופך את ההתחממות של החיץ החשוב. DTT במאגר יכול גם לזרז באופן משמעותי מעכב את התגובה. אם משקע נראה בחיץ, לחמם את הפתרון ומערבולת במרץ. אין צורך בנקיטה כל אמצעי זהירות יוצאת דופן, כגון טיפול במים עם טיפים DEPC או מעוקר וצינורות, כדי למנוע פעילות RNAse. הנוכחות של המעכב ריבונוקלאז המסחרי מספקת הגנה משמעותית נגד RNAses מהסביבה. שימו לב שניתן להשתמש בם תוויות UTP אחרות, כגון והעמסת, למרות הניסיון שלנו, UTP שכותרת digoxigenin ושילוב נוגדן אנטי digoxigenin מספק תוצאות עקביות ביותר. פרוטוקולים מוקדמים לדור בדיקה מצביעים על כך שהידרוליזה בסיסית של הבדיקות המסונתזת צריכה להיעשות 4 על מנת לאפשר לחדירת בדיקה גדולה יותר. הידרוליזה של החללית אינה מופיעה כדי לעזור עם בתהליך הכלאה באתר; בדיקות RNA של יותר מ -500 נ&quot;ב בדרך כלל לתת אות ובדיקות שהם יותר מ 2 קילו באורך גם לעבוד היטב מצוינות. בדיקות קצרות יותר יכולות לעבוד אם RNA היעד הוא בשפע, אך בדיקות כבר תיתן לי בצביעת אטר. יש לא נראה כל יתרון ברור בשימוש בעיכול בסיסי כדי לשבור את הבדיקות ארוכות יותר. אכפת לי בטיפול הראשוני של העוברים הוא מאוד חשוב. הסרת מעטפת ההפריה היא מועילה במיוחד עבור עוברים לאחר סגירה לקפל עצבית ולפני הבקיעה טבעית ממעטפת ההפריה. במהלך התארכות של העובר בתוך מעטפת ההפריה, העובר הופך מסולסל ואם קבוע בעמדה ש, עובר קשה יותר לתמונה לאחר הכלאה באתר. עם זאת, אם את העוברים יוסרו ממעטפת ההפריה לפני הקיבעון, הם במהירות ליישר את. אם עוברים פגומים במהלך הסרת קרום, לאפשר להם לרפא את הפצע לפני הקיבעון כי רקמה פגומה עלולה לגרום כוזב באות הכלאה באתר באתר הפצע. אם קטן, לרפא את הפצעים במהירות רב, לעתים קרובות תוך דקות 19. מאוחר יותר צעדים יכול גם להזיק לעוברים duיש צורך בטיפול העברה ולכן נוזל טבעת כאשר שינוי פתרונות. נזק בשלבים מוקדמים בדרך כלל אומר שהעובר יהיה נפגע קשה בסוף ההליך ואזורים פגועים יגרמו כוזבים באותות באתר למראה הנזק. יתר על כן, יכולים להיות נחקרים עד 30 עוברים בבקבוקון אחד אבל עם יותר עוברים יש סיכוי גדול יותר של רקע גבוה לפתח במהלך תגובת colorimetric, אך להגדיל את שטיפות ביום 3 או שטיפת לילה יכול לפצות על זה. בפרוטוקול זה, את מספר הצעדים צומצם והשימוש בכמה חומרים כימיים נפוצים כבר בוטל. שים לב כי פרוטוקול זה מבטל מספר צעדים שנמצאים בשימוש בפרוטוקולים רבים נוספים כולל עיכול K proteinase ושימוש באנהידריד אצטית לחסום קבוצות טעונות חיובי. צעדים אלה, עדיין עשויים להיות שימושיים כאשר מסתכלים על עוברי יונקים ועופות אך בשימוש Xenopus, יש ביטול צעדים אלה השפעה מועטת on התוצאות הסופיות של הכלאה באתר. המעבדה שלנו לא קבעה אם ניתן ליישם אותו ההפשטות הללו בפרוטוקולי הכלאה באתר למינים אחרים. עיכול proteinase K בפרט, עדיין עשוי להידרש בעוברים אחרים כגון חומוס או עכבר שבו חדירת בדיקה עלולה להיות מגבלות רבות יותר. השימוש במצע סגול BM הוא נוח ואמין. עם זאת, יש מספר אפשרויות אחרות זמינים עבור מזרזים, מצעי אלקליין צבע הנדרשים לתהליך הלוקליזציה של RNA היעד בעובר. בפרט, שילוב של NBT / BCIP משמש בדרך כלל 4 ועובד היטב. ריאגנטים צבע חלקם מסיסים במתנול, ובמקרה זה, השימוש במתנול לאחר הצביעה יבטל את הכתם ויש להימנע. שילובי צבעים אחרים יכולים לשמש גם בעת ביצוע כפול במנח. השימוש בשילוב דומה (NBT / BCIP במקום BM סגול) גם הוכחלהיות מאוד חזק בעת שימוש בעוברי עכברים 20. הצבע הכחול של הצביעה ופיגמנט אנדוגני של העובר הם לעתים קרובות קשים להבחין בתמונות באופן ברור. שימוש בעוברים לבקן גם יבטלו פיגמנט אבל פתרון ההלבנה יעיל כמעט באותה, והוא הרבה יותר נוח כפי שהוא אינו דורש התחזוקה של מבוגרים לבקן לרבייה. אם הכתמים הוא חלשים יחסית, הלבנה חזקה יכולה להדגיש מכתים ש. אם הכתמים הוא חזקים, והותיר חלק מפיגמנט אור יכול להיות ניגוד יעיל וגם לעזור עם מכוון וביים את העובר. לאחר ההכלאה בין לילה בבדיקת RNA, הפרוטוקול יכול לסטות מהפרוטוקול הידני בהחלט המתואר כאן לשימוש ברובוט בכלאה באתר. השימוש ברובוט בכלאה באתר חוסך כמעט יום שלם כימים שני ויום שלישי לפרוטוקול הידני יכול להיות מופחת ליום אחד כרובוט עובד כל הלילהד יכול לעשות את כל שינויי הטמפרטורה המתאימים. הרובוט גם הוא מאוד עקבי בתוצאותיה ובו זמנית מאפשר חיטוט של דגימות רבות ביעילות. הוא נשאר יתרון לעשות ביום הראשון בעבודת יד כמו שמאפשר לשימוש חוזר של בדיקות ושימוש בכמויות קטנות יותר של מגיב. החסרון המשמעותי היחיד של שימוש ברובוט הוא את העלות הראשונית של המכשיר. פרוטוקול זה דן בכמה הדרכים יעילות תמונת הכלאה באתר. חשוב לעשות זאת כמה שיותר המידע יכול ללכת לאיבוד אם התמונה היא עניה. במקרים רבים, הדמיה של באתר התוצאות של ניסוי דורשת באותו זמן כמו הניסוי הראשוני. יש כמה אלמנטים של משתני ההליך כגון מידת הלבנת אלמנט של העדפה אישית. ניתן להשיג אפקטי הדמיה אחרים על ידי הצבת את המנה על בסיס צבע. לעתים קרובות צל כחול קל לאגר יכול להדגיש את הכתמים הכחולים העמוקים של בכפיפותהכלאה u. במילים פשוטות צלחת פטרי המכילה אגר על יריעת פלסטיק הכחול כדי לקבל את האפקט הרצוי. עם זאת, השיטות שתוארו כאן לספק בסיס שעם לחקור אפשרויות הדמיה. ניתן לצפות בעוברים או פינו (שנעשה שקוף למבנים פנימיים לראות טובים יותר) או הבלתי מסולקת (נצפה כפי שהם מופיעים בתנאי תאורה רגילים). חלק מההחלטות בכל הקשור לאיך תמונת העובר תלוי באתר של ביטוי. אם הביטוי הוא על או בקרבת פני השטח של העובר, דרך טובה ביותר הוא תמונת העובר ללא סליקה. ישנם מספר יתרונות לשימוש בעוברים הבלתי מסולקת. התהליך של ניקוי העוברים דורש צעדים רבים והכימיקלים המשמשים כדי לנקות את העוברים הם קשה להתמודד. כמו כן, כמה חללים בעובר יאפשר משקעים של מצעי פוספט אלקליין שיכול לגרום לצביעת חלל שווא. בפרט, blastocoel של עוברים מוקדמים וpharynחלל גאל מציג לעתים קרובות מכתים (איור 4). הכתמת שווא זה לא נראה לעין בעוברים שאינם מסומנות. על פי רוב, אפילו מתון ביטוי עמוק יכול להיות דמיין בעוברים הבלתי מסולקת, כולל רקמות mesodermal כגון לב, כליות, וsomites, וMetall מטבל endodermal כגון בלוטת התריס וכבד. העברת העוברים דרך סדרת מתנול לאו מימה בPBS לצפייה או מתנול להכניס 100% לאחסון מאפשרת לסבבים רבים של אחסון והדמיה. אחסון מתנול מאפשר לנסות שינויים שונים להדמיה לאורך זמן ממושך. יש כמה חסרונות לשימוש בטכניקת הכלאה באתר להסתכל על ביטוי גנים. רמות ביטוי אינן ניתנות לכימות בקפדנות אם כי השוואה בתוך עובר ושינויי ברוטו בהבעה ושינויים בגודל תחום ביטוי הן בדרך כלל ברורה. כמו בטכניקות מבוססות RNA אחרים, הוא אינו מספק כל מידע כto החלבונים המקודדים על ידי הגן של עניין, אשר יכול להגביל את הפרשנות של תוצאות. לבסוף, הוא לעתים קרובות קשה לקבוע מה יכול להיות מכתים רקע בהשוואה לתחום הביטוי האמיתי. הדבר נכון במיוחד בעיה עם גנים עם דפוס ביטוי ידוע שיכול להיות נפוצה. לעתים קרובות, בדיקה שנוצרה מגדיל התחושה של אותו הגן משמשת כביקורת מכתים שאינו ספציפי. שימוש בשליטת גדיל תחושה יכולה לספק קצת מידע לגבי בעיה עם ריאגנטים אבל זה אינו מספק ראיות מוחלטות שמכתים מבוססים על הבדיקה antisense הוא מדויק לחלוטין. תוצאות באתר הן בדרך כלל להפליא עקביות על פני עוברים כאשר עוברים מרובים משמשים וזה יכול לשמש כמדד לאמון בדפוס מכתים. כמו כן, בדיקות antisense שונות, שנוצרו מחלקים שונים של הגן, במיוחד אזורים מתורגמים, ניתן להשתמש בו כדי לראות אם הם נותנים את אותו דפוס מכתים. אם הם עושים זאת,הוא גם מספק ביטחון בדפוס מכתים ציין אם הוא זהה. גם בדיקות מדוללים ניתן להשתמש עם חשיפה ממושכת לפתרון מכתים כדי לראות אם אותו הדפוס מכתים עולה. גורם אחד שבדרך כלל מעורר אמון בדפוס מכתים הוא האם הדפוס שמתאים למבנה עוברי ספציפי. מספיק במנח עכשיו נעשה עם מגוון גדול של גנים שדפוסי ביטוי רומן צפויים אירועים נדירים יחסית. מסדי נתונים גדולים של בתמונות באתר כבר הקימו לאורגניזמים שונים שיכול לשמש כדי להשוות את תוצאות תמונה. לעוברי צפרדעים, Xenbase (www.xenbase.org) היא דוגמא מצוינת למשאב שניתן להשתמש כדי להבין דפוסי ביטוי. אורגניזמים מודל אחרים יש גם מאגרים דומים, נרחבים של תמונות. למרות אזהרות הפוטנציאליות אלה, באתר הכלאה נשארה כלי רב עוצמה ואמין שהוא מאוד שימושי עבורהמחקר של organogenesis. זה צפוי להישאר שיטת הבחירה לזיהוי סוגי תאים ובחינת שינוי בתחומים ביטוי גנים לעתיד הנראה לעין.

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own 1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established 4. Our protocol is a streamlined version of the original protocol 4 that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines. 
In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo 5. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains 6,7. 
The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="557">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:304px;">Name of the reagent or equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labguake Tube Shakers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>17-08-2011</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">VWR Vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10-07-2012</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">L-Cysteine</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>CYS342.500</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11209256910</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Rnase inhibator (Rnase OUT)</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>10777-019</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EPO111</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EPO101</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EPO131</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Dnase 1</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18047-019</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Sheep Serum</td>
			<td>&#160;Wisent</td>
			<td>31150</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Blocking reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">BM purple Ap Substrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442094001</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAMX0485-7</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">NaCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD002.10</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">SDS</td>
			<td>EM&#160;</td>
			<td>7910</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">EDTA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT001.500</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS003.5</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Tween-20</td>
			<td>EM&#160;</td>
			<td>9480</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2643</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Mops</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MOP001.250</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3889-25G</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>PAR070.500&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Formamide</td>
			<td>&#160;VWR&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CAFX0420-4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">RNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109223001</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Maleic Acid</td>
			<td>&#160;VWR&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CAMX0100-3</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">tri-Sodium Citrate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>CIT001</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Hydrogen Peroxide (30% Solution)</td>
			<td>EM&#160;</td>
			<td>HX0635-2</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">BSA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB001.100</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">PVP-40</td>
			<td>ICN</td>
			<td>195451</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Ficoll 400</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0300-10</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Benzyl Alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-1042</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Benzyl Benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6630</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>16500-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

understanding early organogenesis using a simplified in situ hybridization protocol in xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Watch this Scientific Journal Video about Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus at JoVE.com

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

understanding-early-organogenesis-using-simplified-situ-hybridization

Google

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

38.9K Views.  Hospital for Sick Children. The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Video: Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...