פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר קביעת ביטוי גנים בזחלי דגי זברה ישנים וצעירים במהלך מטמורפוזה. היתרון של טכניקה זו הוא כי כמה שלבים כבר אופטימיזציה עבור חדירת בדיקה ויזואליזציה של הכליה. כדי להתחיל, הקם דגי זברה בוגרים להזדווג על ידי הוספת זכר אחד ונקבה אחת במיכל הזדווגות בשעות אחר הצהריים המאוחרות לאחר הארוחה האחרונה שלהם.
למחרת, לאסוף את העוברים בצלחות פטרי המכילים E3 בינוני. חמישה ימים לאחר ההפריה, הניחו מסך 400 מיקרומטר במיכל 2.8 ליטר ומלאו אותו ב-2 ס"מ של מי מערכת. לאחר מכן מוסיפים את הזחל מצלחת פטרי אחת.
כדי לתקן את הזחל, להסיר מיכל של זחל בנקודת הזמן הרצויה, ולאחר מכן, באמצעות רשת ולהעביר pipette עם קצה שלה מנותק, להעביר את הזחל לצלחת פטרי. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של 2% tricaine כדי לשתק את הזחל. לאחר אימוביליזציה, להחליף את tricaine עם 20 מיליליטר של פתרון תיקון.
לאחר 30 דקות, להעביר את הזחל לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של פתרון תיקון טרי. לאחר מכן, להבטיח כי המכסה הוא חזק, לאט לאט לטלטל את הצינור בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים. ביום השלישי, להחליף את פתרון התיקון עם 20 מיליליטר של PBST ולאחר מכן להעביר את הזחל לצלחת פטרי.
כדי למדוד את הזחל, מניחים את צלחת הפטרי על גבי סרגל שטוח תחת מיקרוסקופ מנתח, ולאחר מכן, באמצעות מניפולטור ריסים, להזיז כל זחל על הסרגל כדי למדוד את אורכו הכולל. לאחר מדידת כל הזחלים, לשלב כמה זחלים באורכים דומים על בקבוקון זכוכית אחד 5.5 מיליליטר עם PBST. להתייבשות, להחליף את PBST ב בקבוקון זכוכית עם ארבעה מיליליטר של 100%מתנול, ולאחר מכן לאחסן את בקבוקון במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
עבור rehydration, להחליף את 100%מתנול עם ארבעה מיליליטר של 75% מתנול ו 25% פתרון PBST ולטלטל את המשחקון במשך חמש דקות. לאחר מכן, להחליף את פתרון מתנול ו PBST עם ארבעה מיליליטר של PBST טרי ולטלטל את המשחקון שוב במשך 10 דקות. לעיכול Proteinase K, החליפו את ה-PBST בשני מיליליטרים של תמיסת פרוטאינאז K ונענעו את הוויאל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר מכן, להלבנה, להעביר את הזחל לצלחת שש טוב ולהחליף את PBST עם שלושה מיליליטר של פתרון להלבנה טרי. לאחר היעלמותו המוחלטת של פיגמנטציה לאורך mesonephros, להעביר את הזחל בחזרה לתוך בקבוקון זכוכית, להחליף את פתרון ההלבנה עם ארבעה מיליליטר של PBST, ולטלטל את בקבוקון במשך 10 דקות. עבור טרום הכלאה, להחליף את פתרון התיקון עם ארבעה מיליליטר של PBST ולטלטל את הבקינה במשך 10 דקות, ולאחר מכן, להחליף את PBST עם ארבעה מיליליטר של Hyb-פתרון וסלע במשך 10 דקות.
לאחר שתי דגרות נוספות בתמיסת Hyb, החלף את הפתרון בארבעה מיליליטרים של פתרון Hyb+. בו זמנית לדלל את גשושית פלואורסצ'ין EGFP אחד עד 100 ב 500 microliters של הכלאה בתוספת פתרון, ולדגירה את הנקינה ואת הבדיקה ב 70 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, כדי להכלא את הגשושית, החליפו את תמיסת Hyb+בבקריאלין בגשוש שהתחמם מראש ודגרה ב-70 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
למחרת, להוסיף 50 מיליליטר של 0.2 פעמים SSCT מחומם מראש לתוך צינור 50 מיליליטר. לאחר מכן, הכנס מסננת תא 100 מיקרומטר לחלק העליון של הצינור, להעביר את הזחל מן בקבוקון הזכוכית לתוך מסננת התא, ולהבטיח כי הזחל שקועים במאגר, לדגור על בקבוקון ב 70 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר הדגירה, להעביר את מסננת התא לתוך צינור חדש המכיל מחומם מראש 0.2 פעמים SSCT, ודגרה שוב ב 70 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
לאחר מכן, לחסימה, מעבירים את הזחל ל בקבוקון זכוכית חדש ומאפשרים לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את פתרון SSCT 0.2 פעמים עם ארבעה מיליליטר של 67%0.2 פעמים SSCT ו 33%MABT פתרון ולטלטל את המשחקון בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן, להחליף את פתרון SSCTT MABT עם ארבעה מיליליטר של MABT טרי, ולדגירה את המשחקון על רוקר במשך 10 דקות.
לאחר מכן, להחליף את MABT עם ארבעה מיליליטר של פתרון חסימה ודגור ארבע מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, להחליף את פתרון החסימה עם פתרון נוגדנים ודגור בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים. לשטיפת נוגדנים, להעביר את הזחל לתוך צינור 50 מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף 40 מיליליטר של PBST2, ולהניח את הצינור שוכב על צדו עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.
ביום 12, לאחר העברת הלבה לצלחת שש בארות, להחליף את PBST2 עם שלושה מיליליטר של חוצץ כתמים. לאחר דגירה של חמש דקות על רוקר, החליפו את מאגר הכתמים בשלושה מיליליטרים של תמיסת הכתמים. כאשר עוצמת הכתמים הרצויה מגיעה, החליפו את תמיסת הכתמים בשלושה מיליליטרים של פתרון העצירה והסלע למשך 30 דקות.
לאחר מכן, להעביר את הזחל ל בקבוקון זכוכית חדש, להחליף את פתרון עצירה עם ארבעה מיליליטר של פתרון תיקון טרי, ודגורה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. להדמיה, החלף את פתרון התיקון בארבעה מיליליטרים של PBST טרי. לאחר דגירה של 10 דקות על רוקר, להעביר את הזחל לצלחת שש באר, ולאחר מכן להחליף את PBST עם ארבעה מיליליטר של PBST טרי לטלטל את הצלחת שוב במשך 10 דקות.
לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של 50%גליצל ב PBST וסלע במשך 10 דקות, ולאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ לנתח, תמונה הזחל ישירות בצלחת שש טוב. פרוטוקול הכלאה זה במקום מתייג ביעילות תאי אבות כליות ומבנים שונים של נפרון באמצעות פיתוח mesonephros. הנפרון המזונפרי הראשוני נוצר בערך 5.2 מילימטרים גב לנטייה.
אשכולות של תאי אבות נמצאים במהלך התפתחות mesonephros בנוסף לתאי אבות יחיד. אצל קטינים גדולים יותר, כתמי רקע יכולים להתרחש בסמיטים. בסך הכל, שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד רקמות אחרות שנוצרו במהלך מטמורפוזה, בנוסף לאיברים בוגרים ניתחו.
