עבודה זו נתמכה על קרן מדע קריירת הפרס הלאומי (0953583) והמכון הלאומי לבריאות NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 על ידי.

בפרוטוקול זה, oligonucleotide אחד (RBMB1) היה כותרת ב5&#39;-end שלה עם צבע כתב CF640R ויש רצף: 5&#39;- mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 &quot;. תחומים עצמי משלימה, אשר כונן את ההיווצרות של מבנה סיכת הראש, הם באותיות מודגשות. Oligonucleotide השני (RBMB2) היה כותרת ב3&#39;-end עם מרווה איווה השחור RQ-Sp ויש רצף: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 &quot;. .1 הכנת RBMBs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סיבוב מהיר של הצינורות המכילים oligonucleotides RBMB1 וRBMB2, על מנת להבטיח את oligonucleotide המיובש הוא בחלק התחתון של הצינור, והגלול בDNase ומים RNase חינם לריכוז סופי של 100 מיקרומטר. לדוגמא, מדגם nmole 10 של oligonucleotide יש resuspended במים 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Measיור הריכוז המדויק של דגימות RBMB1 ומניית RBMB2 ידי ספקטרוסקופיה UV מול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 3 μl של מדגם RBMB עם 117 DPBS μl (ללא סידן ומגנזיום) בצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלנק ספקטרופוטומטר עם DPBS ולמדוד את הספיגה 200-800 ננומטר. הערה: שיא absorbances ב 260 ננומטר ו650 ננומטר צריך להיות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ריכוז המניות של דגימות RBMB מבוססות על הספיגה ב 260 ננומטר (או 650 ננומטר לRBMB1), תוך שימוש במשוואה: ריכוז מניות (M) = 260 גורם לדילול * / מקדם הכחדה בי 260 היא את הספיגה ב 260 ננומטר והגורם לדילול היא 40. הערה: ניתן למצוא מקדם ההכחדה לRBMB בגיליון המפרט הניתן על ידי יצרן oligonucleotide. מקדם ההכחדה של CF640R ב650 ננומטר הוא 103,000. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 20 μl של 100 RBMB1 מיקרומטר, 30 μl של RBMB2 100 מיקרומטר, 6 μl 10x; חיץ פוספט (10x חיץ פוספט: 480 מ&quot;מ K 2 4 HPO, 45 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 140 מ&quot;מ לאא 2 PO 4, pH 7.2) ו4 DNase μl ומים RNase חינם. דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. הערה: זה בדרך כלל מספיק עבור כ 50 לימודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עמודה כרומטוגרפיה נוזלית באמצעות הכיתה Superdex 75 הכנה כדי להסיר כל oligonucleotides RBMB2 unhybridized. השתמש ב8 מ&quot;ל (0.7 x 20 סנטימטר) עמודה כרומטוגרפיה נוזלית עם ~ 4 מ&quot;ל מיטת נפח לטהר את הנפח הקטן של מעורבות בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולאזן Superdex עם ~ 50 מ&quot;ל של חיץ פוספט 1x באמצעות משאבת מזרק פועלת בזרימה בקצב זרימה של 0.6 מ&quot;ל / דקה. לפני כל הנוזל נכנס למיטת הנפח, לעצור את משאבת המזרק, לנתק אותו, ולתת את הנוזל שנותר לעבור את העמודה על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת RBMB (60 μl) על טור כרומטוגרפיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי מדגם RBMB יש לחלוטיןנכנס למיטה, לאט להוסיף עוד 250 μl של חיץ פוספט 1x לחלק העליון של המיטה על מנת להבטיח שכל המדגם נכנס לטור לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את העמודה לשפה עם חיץ פוספט 1x. סגור את החלק העליון, ולהתחיל את משאבת מזרק - המזרק צריך להיות מלא עם ~ 50 מ&quot;ל 1x PBS ולרוץ בקצב זרימה של 0.6 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שRBMB מתקרב תחתית הטור - מדגם RBMB יכול בדרך כלל להיות דמיינו בקלות בשל הצבע של הצבע שולב בחללית - לאסוף את הזרימה דרך ב2 טיפות לכל צינור microcentrifuge (1.5 מ&quot;ל). לחדול מגביית המדגם פעם הצבע בתוך צינורות microcentrifuge מתבהר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הצינורות המכילים מדגם RBMB הצבעוני - בדרך כלל 5-6 צינורות - ולטעון לתוך מכשיר צנטריפוגלי מסנן (10,000 MW הפסקת). צנטריפוגה המדגם ב 10,000 RCF עבור 20 דקות או עד שהנפח הרצוי. הערה: מהירויות וזמנים אלה יהיו בדרך כללתניב נפח סופי של ~ 30 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של מדגם RBMB המטוהר על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis המדויק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3 μl של מדגם RBMB המרוכז ולערבב עם 117 DPBS μl בצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלנק ספקטרופוטומטר עם DPBS ולמדוד את הספיגה 200-800 ננומטר. הערה: שיא absorbances ב 260 ננומטר ו650 ננומטר צריך להיות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ריכוז המניות של RBMB הכלאה מבוססת על הספיגה ב 650 ננומטר, באמצעות המשוואה: ריכוז מניות (M) = 650 גורם לדילול * / מקדם נכחד בי 650 היא את הספיגה ב 650 ננומטר, גורם לדילול הוא 40. הערה: מקדם ההכחדה לCF640R ב650nm הוא 103,000 ומקדם ההכחדה לאיווה השחור RQ הוא ~ 20,000. מקדמי ההכחדה הם תוסף ואינם רגישים להכלאה. לכן, יש לו את מדגם RBMB המניה מקדם הכחדה משולבת של approximately 123,000 ב650 ננומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית הצינור כראוי עם שם וריכוז וחנות ב -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. </li></ol> 2 הכנת פולי-D-ליזין מצופה 8 היטב Chambered coverglass <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של פולי-D-ליזין על ידי המסת 5 מ&quot;ג של פולי-D-ליזין (אבקת lyophilized, g-מוקרן) ב25 מ&quot;ל מים מעוקרים בסביבת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של / פתרון פולי-D-ליזין מ&quot;ל 0.2 מ&quot;ג היטב בכל coverglass 8 היטב chambered, בסביבת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 16-18 במכסת מנוע תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פולי-D-ליזין ולשטוף היטב 3 פעמים עם מים מזוקקים סטריליים. הערה: ניתן לאחסן השקופיות קאמריות מצופים ב 4 ° C.. </li></ol> משלוח .3 Probe הערה: מערכת התא המשמשת צריך להכיל מבנה גן משולב המבטא RNA עם לפחות 4-רציף לאגדing אתרים לRBMB באזור 3&#39;-מתורגם (UTR). רצפי היעד צריכים להיות משלימים ללולאה של RBMB. זה מומלץ כי כביקורת שלילית, באותו קו התא להיות מהונדס לבטא אותו מבנה הגן, אך ללא חוזר טנדם. בפרוטוקול זה, שורת תאי פיברוסרקומה אנושית, HT1080, הייתה שהונדסה RNA GFP עם חזרות 96-טנדם של רצף יעד RBMB ב3&#39;-UTR. שורת תאי שליטה תוכננה כדי להביע RNA GFP wild-type. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בבקבוק T25 בconfluency 40-50% יום לפני מסירת בדיקה. תרבות תאים עם תקשורת DMEM בתוספת עט 1% / סטרפטוקוקוס ו10% בסרום שור העובר (FBS), ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להדליק את microporator ולהגדיר את הפרמטרים microporation ל950 V, 2 פעימות, 25 אלפית שניים. הערה: פרמטרים אלו עברו אופטימיזציה עבור HT1080 תאים, אבל הם תאים מסוג תלויים ויכולים להיות adjusטד לסוגי תאים אחרים, כמתואר בהוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צינור microporation עם חיץ אלקטרוליטי 4 מ&quot;ל ומניח אותו על תחנת microporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מניית המדגם של RBMB מטוהר ולהפשיר אותו. לדלל כמה מיקרוליטר לריכוז סופי של מיקרומטר 12 עם חיץ פוספט 1x. 1 μl נחוץ עבור כל microporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של מדיום התרבות עם FBS אבל בלי אנטיביוטיקה לתוך צינור microcentrifuge. הערה: זה ישמש להשעות את התאים מייד לאחר microporation וניתן להפריש, סמוך למכשיר microporation, לעת עתה. ההכללה של אנטיביוטיקה בתקשורת והתרבות תקטין את כדאיות התא לאחר microporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה תרבות תא מהתאים המהונדסים HT1080 (מחוברות 60-80%), לשטוף את התאים עם 1 מ&quot;ל Ca 2 + וMg 2 + DPBS -חינם פעם אחת, ודגירה עם טריפסין 1 מ&quot;ל ל1-2 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את trypsinization על ידי הוספת 1 מ&quot;ל תקשורת DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי, ללא אנטיביוטיקה ופנול אדום, ולהעביר את התאים לשני 1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים בצינור microcentrifuge ב XG 200 למשך 5 דקות. הסר את supernatant, resuspend ולשלב את כדורי התא בנפח סופי של 1 מ&quot;ל DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl מהשעית התא המעורבת היטב ולספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לוודא שהם מפוזרים היטב ולהעביר 300,000 תאים עם DPBS לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש וספין למטה XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, נזהר שלא להפריע תא גלולה. Resuspend גלולה במאגר 11 μl resuspension ופיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לוודא שהתאים מפוזרים היטב. הקפד לא ליצור בועות אוויר. הערה: בועות אוויר תגרום ניצוץ במהלך microporation ולגרום למסירת RBMB עניה ומוות של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של RBMB המדולל (מיקרומטר 12) ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. שוב להיזהר שלא ליצור בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 10 μl של תערובת RBMB התאים, באמצעות פיפטה microporation, והכנס את פיפטה לתוך צינור microporation. לחץ על הכפתור התחל כדי להתחיל את microporation. הערה: לא צריך להיות שום בועות אוויר נראות לעין בקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המסך של microporator תערוכות השלמה, להסיר את פיפטה מהתחנה, לגרש את תערובת 10 μl לתוך צינור microcentrifuge שהוכן קודם לכן, עם מדיום תרבות מ&quot;ל 1 עם FBS אבל בלי אנטיביוטיקה. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה מספר פעמים מצד לצד צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים ב XG 200 למשך 5 דקות ולשטוף את התאים פעמיים נוספות, ב1 בינוני תרבות החופשית אדומה מ&quot;ל פנול עם FBS אבל בלי אנטיביוטיקה, כדי להסיר כל RBMBs שלא נמסרו לתוך התאים. Resuspend עם מדיום תרבות אדום חינם 400 פנול μl עם FBS אבל בליאנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת תאי microporated לפולי-D-ליזין המצופה coverglass חדרי 8 היטב ב200 μl בכל טוב או בconfluency הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: אם רצוי תמונת הגרעין, להוסיף Hoescht 33342 לתאים בריכוז סופי של 0.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את coverglass החדרים לחממת תרבות תא. דגירה התאים עבור 1-2 שעות לפני ההדמיה, כך שהתאים יש מספיק זמן להתיישב על פני השטח coverglass. שים לב: הדמיה יכולה להתבצע בהקדם 30 דקות שלאחר microporation-. </li></ol> .4 תמונת רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת הדגירה העליונה שלב תא החי ולאזן אותו עד שהוא מגיע 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולחות 75%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור אור מיקרוסקופ והניאון ולפתוח את תוכנת Metamorph. הערה: ניתן להשתמש גם חבילות תוכנה דומות אחרות לשליטת מיקרוסקופ ורכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שמן Immersol למטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את coverglass חדרים עם תאי microporated למערכת הדגירה העליונה שלב תא החי. דגירה המערכת העליונה שלב עד שהטמפרטורה וCO 2 רמות התייצבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הכרטיסייה לרכוש, בתוכנת Metamorph. לחץ על לחצן Live Show כדי למצוא את השדה, לשנות את הפוקוס תחת אור לבן ולחץ על לחצן עצירה חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הלשונית לרכוש, לחץ ולפתוח את הכפתור המוקפץ רכישת זרם, ולהגדיר את הפרמטרים לרכישת סרט הרצויים. לרכוש 150 מסגרות באמצעות מסנן Cy5 / CF640R ושמור את התמונות בכונן הקשיח. </li></ol>

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Dictenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+fluorescent+RNA+ensures+a+bright+future+for+visualizing+nucleic+acid+dynamics.">Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics.</a> Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).</li><li>Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+pulsing+of+a+developmental+gene.">Transcriptional pulsing of a developmental gene.</a> Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).</li><li>Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+nascent+RNA+dynamics+reveals+distinct+types+of+transcriptional+pulse+regulation.">Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).</li><li>Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+endogenous+RNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila.">Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).</li><li>Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+bicoid+mRNA+in+late+oocytes+is+maintained+by+continual+active+transport.">Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport.</a> Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).</li><li>Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+beta-actin+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+a+living+cell.">Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell.</a> Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).</li><li>Fusco, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mRNA+molecules+demonstrate+probabilistic+movement+in+living+mammalian+cells.">Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).</li><li>Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+endogenous+mitochondrial+RNA+in+single+living+cells.">Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells.</a> Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).</li><li>Daigle, N., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LambdaN-GFP:+an+RNA+reporter+system+for+live-cell+imaging.">LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).</li><li>Bogaard, P. T., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacons+to+study+dispersal+of+mRNPs+from+the+gene+locus.">Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus.</a> Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).</li><li>Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+transport+in+the+nucleus.">Mechanism of mRNA transport in the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).</li><li>Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+bimolecular+beacons+for+the+sensitive+detection+of+RNA+in+single+living+cells.">Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+shared-stem+and+conventional+molecular+beacons.">Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+kinetics+and+thermodynamics+of+molecular+beacons.">Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).</li><li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction.">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).</li><li>Ainger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+and+localization+of+exogenous+myelin+basic+protein+mRNA+microinjected+into+oligodendrocytes.">Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes.</a> J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells:+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs.">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).</li><li>Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+visualization+in+live+bacterial+cells+using+fluorescent+protein+complementation.">RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation.</a> Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Chen, A. K., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+RNA+in+living+cells+with+molecular+beacons:+current+perspectives+and+challenges.">Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FRET+molecular+beacons+for+mRNA+detection+in+living+cells.">Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).</li><li>Altman, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

ד&quot;ר מארק Behlke וד&quot;ר לינג הואנג מועסקים על ידי IDT אשר מציעים oligonucleotides למכירה דומה לחלק מהתרכובות שתוארו בכתב היד. IDT, עם זאת, לא חברה ציבורית, והם באופן אישי לא בעלי מניות כלשהן / הון בIDT.

יכולת תמלילים יחידים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי דורשת אות ניאון בהירה וphotostable להיות מזוהה עם כל תעתיקי הרנ&quot;א ורקע ניאון נמוך הנובע מבדיקות ניאון מאוגדים. בשיטה זו, אות ניאון בהירה מושגת על ידי הכלאה מרובה (עד 96) בדיקות ניאון מב...

הביטוי והרגולציה של מולקולות RNA הוא תהליך מורכב ודינמי שהוא אחראי במידה רבה לשליטה בהתנהגות תא וגורל. למרות חשיבותו של RNA בתפקוד תא מכתיב כבר ידועה לכמה זמן, הוא לעתים קרובות קשה לצייר קשרים ברורים בין השניים שכן רוב כלי ניתוח RNA חסרי הרזולוציה המרחב ובזמן הנדרשת כדי ללכוד אירועי רגולציה חשובים כגון התפוצצות שעתוק, RNA סחר, ועיבוד RNA מקומי. זה הוביל להופעתו של מספר טכניקות שתאפשרנה תעתיקי רנ&quot;א בודדים להיות דמיינו בתאים חיים בזמן אמת 1. אולי, הבולט ביותר של טכניקות אלה מנצל חלבון היתוך GFP-MS2 למקד RNA שתוכנן כדי להכיל חוזר טנדם של האתר מחייב MS2 ב3&#39;-UTR 2,3. על ידי הבאת מולקולות GFP מרובות לתוך סמיכות, תעתיקי רנ&quot;א בודדים מופיעים כתמים בהירים כמו ניאוןבאמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מערכת GFP-MS2 סיפקה תובנה חסרת תקדים לתוך RNA התנהגות, כוללים הדמיה ישירה ומדידות של תעתיק מתפוצצת 4,5, זיהוי של לוקליזציה משנה הסלולר ייחודית ועיבוד 6-9, והדמיה של רנ&quot;א תחבורה 10 בזמן אמת. עם זאת, למרות הפוטנציאל העצום של מערכת GFP-MS2, חלבוני היתוך GFP-MS2 מאוגדים יכולים ליצור אות ניאון גבוה רקע שמגבילה את הגמישות וטווח דינמי של טכניקה זו. מספר גישות פותחו כדי להגביל את אות רקע זה, לרבות מידור subcellular של GFP-MS2 מאוגד 10, שלמת בר חלבון 11, וחלבוני RNA מחייב חלופיים ומטרות 12. עם זאת, כל הגישות הללו יישארו רגישים לביטוי היחסי ומוחלט של יעד RNA וחלבון היתוך GFP-MS2. כlternative למערכות GFP-MS2, משואות מולקולריות יש גם משמשות לאיתור תעתיקי רנ&quot;א מהונדס עם חוזר טנדם של האתר הקישור משלים ב3&#39;-UTR 13,14. משואות מולקולריות הן בדיקות oligonucleotide יוצרי סיכת ראש שמסומנות בקצה אחד עם מרווה ובקצה השני עם כתב ניאון. כאשר אינו מחויבים למקד RNA כתב הניאון ומרווה להישאר בסמיכות, וכתוצאה מכך מדינה נמוכה ניאון. על הכלאה, הכתב ומרווית הניאון נאלצים לגזרים והקרינה משוחזרת. בדומה למערכת GFP-MS2, את הכריכה של משואות מולקולריות מרובות על תוצאות תעתיקי הרנ&quot;א יחידים במיקום ניאון בהיר שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי; עם זאת, הקרינה הרקע צפויה להיות נמוכים בהרבה, בשל התצורה הרווה של משואות מולקולריות מאוגדים. למרבה הצער, למרות מנגנון ההפעלה המתוחכם שהוא שולב מ &#39;עיצוב משואת olecular, עכשיו יש ראיות הולכות ומצטברות כי unhybridized משואות מולקולריות לא נשאר בקונפורמציה סיכת הראש בעת שהוכנס לתאים חיים. כתוצאה מכך, הם מייצרים אות חיובית שגויה שמפחיתה את האות לרקע באופן משמעותי. כדי להתגבר על חסרון זה, לאחרונה פיתח בדיקה סינתטית חדשה לRNA הדמיה בתאים חיים, משואות bimolecular ratiometric (RBMBs; איור 1 א) 15,16. RBMBs מורכב משני גדילי oligonucleotide 2&#39;-O-מתיל היוצרים מבנה היברידי עם תכונות משני RNA הקצר סיכת הראש (shRNA) ומשואות מולקולריות. מנגנון הלולאה והפעלת הקרינה דומה למגדלור המולקולרי, ואילו תחום פעמיים התקועות הארוך עם הסככה 3&#39;-UU הוא יותר אופייני לshRNA. תכונות shRNA נועדו להסיע את היצוא גרעיני, שבו אנו מוצאים עליות חיים תאיים ל&gt; 24 שעות, עם השפלה נצפית מינימאלית, ומונע פתיחה הלא ספציפית של הלולאה. כתוצאת RBMBs תערוכת רקע אות לגבוה יותר באופן משמעותי ממשואות מולקולריות. יש לציין כי RBMBs לא יכול להיות מוכן באמצעות oligonucleotides DNA, מאז בדיקות מבוססות DNA לא להחזיק את אותן יכולות יצוא גרעיניות כמו בדיקות מבוססות RNA. מבחינה מבנית, RBMB הלולאה נועדה בדרך כלל להיות בין 15 ו21 בסיסים ארוכים, כדי ליצור איזון בין הספציפיות וסלקטיביות על הכלאת RNA. הגבעול הקצר שיוצר מהתחומים שני עצמי משלים בדרך כלל נועד להיות 4 בסיסים. אם גזע כבר נבחר, השיעור של הכלאה בין לולאת RBMB וRNA היעד מואט באופן משמעותי 17,18. לעומת זאת, כאשר רצף גזע קצר יותר נבחר טמפרטורת ההתכה היא לעתים קרובות נמוכה מדי כדי לקיים את מבנה גזע הלולאה על 37 מעלות צלזיוס, מה שמוביל לאות רקע גבוהה. את הספציפיות של RBMB היא גם אדומותuced כאורך הגזע מתקצר. מאז הרצף של גזע הלולאה RBMB גם יכול להשפיע על תפקוד RBMB, זה חייב להיות שנבחר בקפידה 19. בפרט, צריכים להיות רצפי לולאה אידיאליים מבנה המשני מינימאלי, להכליא רצפי הרנ&quot;א עם מבנה משני מינימאלי, להימנע מאתרי קישור של חלבון, ולהימנע מחוץ יעד מחייב. ניתן להשיג את תחזיות של שני RBMB ומבנה משני RNA באמצעות תוכנה כגון mfold 20. משלימים אתרים מחוץ היעד יכולים זוהו באמצעות כלי נוקלאוטיד יסוד מקומי חיפוש הקצאה (תפציץ). עם זאת, בשל חוסר עקביות בתחזיות מודל ואת הקושי בזיהוי אתרי מכבדי חלבון, את הספציפיות של כל RBMBs חייבות סופו של דבר להיות מאומתות בניסוי. אם רצוי, צבע התייחסות unquenched שאינו רגיש למדינת ההכלאה ניתן להוסיף לRBMB 15. התוספת של צבע התייחסות יכולה יחסי הציבורovide סמן למסירת בדיקה ולשמש הדמיה ratiometric, אם מדידות מדויקות יותר של הקרינה סלולרית בסך הכל נדרשות. צבעי ההתייחסות מאפשר מדידות להיות מותאמות להבדלים ברקע בשל וריאציות תא אל התא במשלוח. עם זאת, כאשר ההדמיה RNA הבודד תמלילי צבע ההתייחסות הוא לא הכרחי. יש לציין, צבעים מסוימים התייחסות יכולים להפריע ליצוא של RBMBs מהגרעין, שהוביל לאות רקע מעט גבוהה יותר בגרעין. כאשר מתוכנן כראוי, יכול לשמש RBMBs לתעתיקי רנ&quot;א הבודד תמונה בתאי חיים בודדים, אם RNA היעד מתוכנן להכיל לפחות ארבעה אתרי RBMB מחייבים (איור 1 ב) 16. RBMBs יכול להיות מועבר בצורה יעילה למגוון רחב של סוגי תאים באמצעות microporation, עם לא מעט השפעה על תא כדאיות 21, ומדידות כמותיות של ביטוי גנים יכולות להיותרכש בתוך 30 דקות. יתר על כן, המתודולוגיה היא די רגישה לרמות ריכוז RBMB וRNA היעד, שכן הקרינה מRBMBs מאוגד הוא הרווה ביעילות. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיה המשמשת להכנה ולטהר RBMBs, כמו גם נוהל כללי לאספקת RBMBs לחית תאים באמצעות microporation וההדמיה של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

ההבנה הגוברת ששתי הרגולציה של הזמן ומרחב של ביטוי גנים יכולה להיות השלכות חשובות על תפקוד תאים הובילה לפיתוחן של טכניקות מגוונות לדמיין תעתיקי רנ&quot;א פרט בתאי חיים בודדים. טכניקה מבטיחה אחת לאחרונה כי תוארה מנצלת בדיקה מבוססת oligonucleotide אופטי, ratiometric משואת bimolecular (RBMB), כדי לזהות מולקולות RNA שהונדסו כדי להכיל לפחות ארבעה חוזרים טנדם של רצף יעד RBMB באזור 3&#39;-מתורגם. RBMBs נועד במיוחד כדי לפלוט אות ניאון בוהקת על הכלאה לRNA המשלים, אבל חוץ מזה נשאר הרווה. השימוש בבדיקה סינתטית בגישה זו מאפשרת photostable, אדום העביר, וצבעים אורגניים emissive מאוד לשמש הדמיה. כריכה של RBMBs מרובה לתוצאות תעתיקי רנ&quot;א המהונדסים במקומות דיסקרטיים הקרינה כאשר מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום. כתוצאה מכך, התנועה של מולקולות RNA בודדות יכולה להיות דמיין בקלות בזמן אמת על ידי לקיחת סדרת זמן של תמונות ניאון. כאן אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, משלוח לתאים על ידי microporation ולחיות תאי הדמיה של מולקולות RNA בודדות.

זמן קצר לאחר microporation של HT1080 תאים בנוכחות RBMBs, תעתיקי רנ&quot;א אדם שהונדסו כדי להכיל אתרי RBMB מחייב מרובים ב3&#39;-UTR שלהם מופיעים כתמים בהירים כמו ניאון כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב (איור 2). בעוד תעתיקי רנ&quot;א אדם עם אתרי קישור כמה כמו ארבעה RBMB נית...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons at JoVE.com

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  University of Pennsylvania.  משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת. 

Video: Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

יישום של תחמוצת החנקן פלורסנט מקודדים גנטית (NO •) בדיקות, את geNOps, הדמיה בזמן אמת של אותות NO • ב תאים בודדים

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

ניטור בזמן אמת של אורורה קינאז הפעלה באמצעות Biosensors FRET קונפורמציה בתאים חיים

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...