وأيد هذا العمل من قبل جائزة مؤسسة العلوم الوطنية التوظيف (0953583) والمعهد الوطني للصحة NCI / R21-CA116102، NCI / R21-CA125088، NIBIB / R01-EB012065، NCI / R01-CA157766.

في هذا البروتوكول، وصفت قليل النوكليوتيد واحد (RBMB1) في جلساتها 5&#39;النهاية مع مراسل صبغ CF640R ولها تسلسل: 5&#39;- mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC مو mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC MUMU-3. نطاقات مكمل الذات، مما يؤدي بدوره تشكيل هيكل دبوس الشعر، وبالخط العريض. وصفت قليل النوكليوتيد الثاني (RBMB2) في نهاية 3&#39;مع فاكهه تقضي أيوا الأسود RQ-SP ولديه تسلسل: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3. 1. إعداد RBMBs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور إجراء سريع للأنابيب تحتوي على RBMB1 وRBMB2 أليغنوكليوتيد]، لضمان قليل النوكليوتيد المجففة في الجزء السفلي من الأنبوب، وresuspend في الدناز وريبونوكلياز خالية من المياه إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر. على سبيل المثال، ينبغي معلق على 10 عينة من nmole قليل النوكليوتيد في 100 ميكرولتر من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مياسلدى عودتهم تركيز الدقيق للعينات RBMB1 والأسهم RBMB2 بواسطة الأشعة فوق البنفسجية في مواجهة الطيفي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 3 ميكرولتر من العينة RBMB مع 117 ميكرولتر DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) في أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فارغة لطيفي مع DPBS وقياس الامتصاصية 200-800 نانومتر. ملاحظة: قمة الامتصاصية في 260 نانومتر و 650 نانومتر يجب أن تكون مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيز الأسهم من العينات RBMB على أساس الامتصاصية في 260 نانومتر (أو 650 نانومتر لRBMB1)، وذلك باستخدام المعادلة: الأسهم التركيز (M) = A * 260 عامل التخفيف / معامل الانقراض حيث A 260 هو الامتصاصية في 260 نانومتر وعامل التخفيف و40. ملاحظة: معامل الانقراض لRBMB يمكن العثور على ورقة المواصفات المقدمة من قبل الشركة المصنعة قليل النوكليوتيد. معامل انقراض CF640R في 650 نانومتر هو 103،000. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 20 ميكرولتر من 100 ميكرومتر RBMB1، 30 ميكرولتر من 100 ميكرومتر RBMB2، 6 ميكرولتر 10X، عازلة الفوسفات (10X العازلة الفوسفات: 480 ملم K 2 هبو 4، 45 ملي KH 2 PO 4، 140 ملي ناه 2 ص 4، ودرجة الحموضة 7.2) و 4 ميكرولتر الدناز وريبونوكلياز خالية من المياه. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: هذا هو عادة كافية لحوالي 50 دراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العمود اللوني السائل باستخدام 75 الإعدادية الصف Superdex لإزالة أي أليغنوكليوتيد] RBMB2 الغير مهجنة. استخدام 8 مل (0.7 × 20 سم) العمود اللوني السائل مع ~ 4 مل حجم السرير لتنقية صغر حجم المجسات مختلطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل وتتوازن مع Superdex ~ 50 مل من العازلة الفوسفات 1X باستخدام مضخة محقنة على التوالي في تدفق بمعدل تدفق 0.6 مل / دقيقة. قبل كل من السائل يدخل حجم السرير، ووقف ضخ حقنة، سلخه، وترك السائل المتبقي تمر العمود بفعل الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخليط RBMB (60 ميكرولتر) على العمود اللوني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العينة RBMB لها تمامادخلت السرير، إضافة ببطء 250 ميكرولتر من العازلة الفوسفات آخر 1x إلى الجزء العلوي من السرير لضمان أن العينة كلها قد دخل تماما العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء العمود إلى حافة مع العازلة الفوسفات 1X. إغلاق الأعلى، وبدء ضخ حقنة - ينبغي أن تملأ المحقنة مع ~ 50 مل 1X PBS وتشغيل بمعدل تدفق 0.6 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن تقترب RBMB الجزء السفلي من العمود - يمكن عادة العينة RBMB يمكن تصور بسهولة بسبب لون الصبغة دمجها في التحقيق - جمع من خلال تدفق في 2 قطرات في أنبوب microcentrifuge (1.5 مل). وقف جمع عينة مرة واحدة لون داخل أنابيب microcentrifuge يصبح واضحا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الأنابيب التي تحتوي على عينة RBMB الملونة - عادة 5-6 الأنابيب - وتحميلها إلى جهاز الطرد المركزي فلتر (10،000 ميجاوات قطع). أجهزة الطرد المركزي لعينة في إطار التعاون الإقليمي 10،000 لمدة 20 دقيقة أو حتى حجم المطلوب. ملاحظة: هذه السرعات وأوقات وعادةتسفر عن الحجم النهائي من ~ 30 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الدقيق للعينة RBMB تنقيته بواسطة الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 3 ميكرولتر من العينة RBMB المركزة وتخلط مع 117 ميكرولتر DPBS في أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فارغة لطيفي مع DPBS وقياس الامتصاصية 200-800 نانومتر. ملاحظة: قمة الامتصاصية في 260 نانومتر و 650 نانومتر يجب أن تكون مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيز الأسهم من RBMB تهجين على أساس الامتصاصية في 650 نانومتر، وذلك باستخدام المعادلة: الأسهم التركيز (M) = A * 650 عامل التخفيف / معامل انقرضت حيث A 650 هو الامتصاصية في 650 نانومتر، عامل التخفيف هو 40. ملاحظة: معامل الانقراض لCF640R في 650NM هو 103،000 ومعامل الانقراض لأيوا الأسود هو RQ ~ 20،000. معاملات الانقراض هي المضافة وليست حساسة لالتهجين. وبالتالي فإن عينة الأسهم RBMB لديها معامل الانقراض مجتمعة approximatelص 123،000 في 650 نانومتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية أنبوب مناسب مع اسم والتركيز وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ol> 2. إعداد بولي د يسين المغلفة 8 جيدا تشامبيريد ساترة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول 0.2 ملغ / مل بولي-D-يسين عن طريق إذابة 5 ملغ بولي-D-يسين (مسحوق مجفف بالتجميد، ز المشع) في 25 مل من الماء المعقم في بيئة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 0.2 ملغ / مل من محلول بولي D-يسين إلى كل بئر من ساترة 8 غرف جيدا، في بيئة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 16-18 ساعة في الثقافة هود الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بولي-D-يسين ويغسل جيدا 3 مرات بالماء المقطر المعقم. ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح الغرفة المغلفة في 4 درجة مئوية. </li></ol> 3. التحقيق التسليم ملاحظة: يجب أن تستخدم نظام خلية تحتوي على التركيبة الجينية متكامل عن RNA مع 4-متتابعة على الأقل مأزقمواقع لRBMB في المنطقة 3&#39;-غير مترجمة (UTR) جي. يجب أن يكون تسلسل الهدف مكملة لحلقة من RBMB. ينصح بأن كعنصر تحكم السلبية، يتم هندستها خط الخلية نفسها للتعبير عن نفس التركيبة الجينية، ولكن من دون تكرار جنبا إلى جنب. في هذا البروتوكول، خط خلية ليفية البشري، HT1080، تم تصميمها للتعبير عن GFP RNA مع يكرر 96، جنبا إلى جنب من تسلسل الهدف RBMB في 3&#39;-UTR. تم تصميم خط الخلية السيطرة للتعبير عن GFP البرية من نوع RNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في قارورة T25 في 40-50٪ confluency يوم واحد قبل التسليم التحقيق. ثقافة الخلايا مع وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع 1٪ القلم / بكتيريا و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، بدوره على microporator وإعداد المعلمات microporation إلى 950 V، 2 البقول، 25 ميللي ثانية. ملاحظة: لقد تم تحسين هذه المعلمات للخلايا HT1080، لكنها خلية من نوع يعتمد ويمكن أن تكون adjusتيد لأنواع الخلايا الأخرى كما هو موضح في تعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنبوب microporation مع 4 مل عازلة كهربائيا ووضعه على محطة microporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج عينة من الأسهم RBMB تنقيته وتذويب ذلك. تمييع عدة ميكرولتر لتركيز النهائي من 12 ميكرومتر مع العازلة 1X الفوسفات. هناك حاجة إلى 1 ميكرولتر لكل microporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 مل من مستنبت مع FBS ولكن من دون المضادات الحيوية في أنبوب microcentrifuge. ملاحظة: وسوف تستخدم هذه لتعليق الخلايا مباشرة بعد microporation ويمكن وضعها جانبا، بالقرب من جهاز microporation، في الوقت الراهن. سيتم إدراج المضادات الحيوية في وسائل الإعلام ثقافة تقلل من بقاء الخلية بعد microporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام ثقافة خلية من الخلايا HT1080 هندسيا (60-80٪ متموجة)، وغسل الخلايا مع 1 مل 2+ الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ DPBS خالية من مرة واحدة، واحتضان مع 1 مل التربسين لمدة 1-2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف trypsinizatioن وذلك بإضافة 1 مل سائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، دون المضادات الحيوية والفينول الأحمر، ونقل الخلايا إلى قسمين 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار خلايا في أنبوب microcentrifuge في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف، في resuspend والجمع بين الكريات خلية في الحجم النهائي من 1 مل DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 ميكرولتر من تعليق خلية مختلطة بشكل جيد والاعتماد على الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أنها فرقت جيدا ونقل 300،000 الخلايا مع DPBS جديد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتدور باستمرار في 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. Resuspend وبيليه في 11 ميكرولتر العازلة إعادة تعليق وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أن الخلايا الموزعة توزيعا جيدا. تأكد من عدم توليد أي فقاعات الهواء. ملاحظة: سوف فقاعات الهواء يسبب شرارة أثناء microporation ويؤدي ذلك إلى ضعف تسليم RBMB وموت الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من RBMB المخفف (12 ميكرومتر) ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. مرة أخرى يكون الحرص على عدم توليد أي فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح 10 ميكرولتر من خليط من الخلايا RBMB، وذلك باستخدام ماصة microporation، وإدراج ماصة في أنبوب microporation. دفع زر البدء لبدء microporation. ملاحظة: يجب أن يكون هناك فقاعات الهواء مرئية في الطرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يظهر على الشاشة من microporator الانتهاء، إزالة ماصة من المحطة، وطرد الخليط 10 ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge التي أعدت في وقت سابق، مع 1 مل الثقافة المتوسطة مع FBS ولكن من دون المضادات الحيوية. المزيج بلطف بواسطة أنبوب هزاز جنبا إلى جنب عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل خلايا مرتين أخريين، في 1 مل الفينول الأحمر مستنبت الحرة مع FBS ولكن من دون المضادات الحيوية، لإزالة أي RBMBs التي لم يتم تسليمها إلى الخلايا. في resuspend مع 400 ميكرولتر الفينول الثقافة الحرة أحمر المتوسطة مع FBS ولكن من دونالمضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا microporated في بولي-D-يسين المغلفة ساترة غرف 8 جيدا في 200 ميكرولتر لكل بئر أو في confluency المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: إذا كان من المرغوب فيه صورة النواة، إضافة Hoescht 33342 إلى الخلايا في تركيز النهائي من 0.01 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة غرف في حاضنة ثقافة الخلية. احتضان الخلايا لمدة 1-2 ساعة قبل التصوير، حتى أن الخلايا لديها الوقت الكافي ليستقر على سطح ساترة. ملاحظة: التصوير لا يمكن أن يؤديها في أقرب وقت 30 دقيقة بعد microporation. </li></ol> 4. الحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مرحلة أعلى خلية النظام الحضانة الحية وتتوازن عليه حتى تصل إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 75٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصدر الضوء والمجهر الفلورسنت وفتح برنامج Metamorph. ملاحظة: يمكن أيضا حزم برامج أخرى مشابهة من أجل السيطرة المجهر والحصول على الصور يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق زيت Immersol لالهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ساترة غرف مع الخلايا microporated إلى مرحلة أعلى خلية النظام الحضانة الحية. احتضان النظام مرحلة أعلى حتى درجة حرارة واستقرت مستويات CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح علامة التبويب اكتساب، في مجال البرمجيات Metamorph. انقر فوق زر إظهار لايف للعثور على الميدان، وضبط التركيز تحت الضوء الأبيض وانقر فوق الزر إيقاف لايف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت علامة التبويب اكتساب، وانقر على زر فتح المنبثقة اكتساب تيار، وإعداد المعلمات اقتناء الفيلم المطلوب. الحصول على 150 لقطة باستخدام فلتر Cy5 / CF640R وحفظ الصور على القرص الصلب. </li></ol>

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Dictenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+fluorescent+RNA+ensures+a+bright+future+for+visualizing+nucleic+acid+dynamics.">Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics.</a> Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).</li><li>Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+pulsing+of+a+developmental+gene.">Transcriptional pulsing of a developmental gene.</a> Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).</li><li>Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+nascent+RNA+dynamics+reveals+distinct+types+of+transcriptional+pulse+regulation.">Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).</li><li>Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+endogenous+RNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila.">Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).</li><li>Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+bicoid+mRNA+in+late+oocytes+is+maintained+by+continual+active+transport.">Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport.</a> Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).</li><li>Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+beta-actin+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+a+living+cell.">Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell.</a> Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).</li><li>Fusco, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mRNA+molecules+demonstrate+probabilistic+movement+in+living+mammalian+cells.">Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).</li><li>Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+endogenous+mitochondrial+RNA+in+single+living+cells.">Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells.</a> Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).</li><li>Daigle, N., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LambdaN-GFP:+an+RNA+reporter+system+for+live-cell+imaging.">LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).</li><li>Bogaard, P. T., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacons+to+study+dispersal+of+mRNPs+from+the+gene+locus.">Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus.</a> Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).</li><li>Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+transport+in+the+nucleus.">Mechanism of mRNA transport in the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).</li><li>Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+bimolecular+beacons+for+the+sensitive+detection+of+RNA+in+single+living+cells.">Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+shared-stem+and+conventional+molecular+beacons.">Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+kinetics+and+thermodynamics+of+molecular+beacons.">Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).</li><li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction.">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).</li><li>Ainger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+and+localization+of+exogenous+myelin+basic+protein+mRNA+microinjected+into+oligodendrocytes.">Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes.</a> J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells:+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs.">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).</li><li>Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+visualization+in+live+bacterial+cells+using+fluorescent+protein+complementation.">RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation.</a> Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Chen, A. K., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+RNA+in+living+cells+with+molecular+beacons:+current+perspectives+and+challenges.">Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FRET+molecular+beacons+for+mRNA+detection+in+living+cells.">Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).</li><li>Altman, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

ويعمل الدكتور مارك Behlke والدكتور لينغ هوانغ بواسطة IDT التي تقدم أليغنوكليوتيد] للبيع مشابه لبعض المركبات وصفها في المخطوطة. IDT هو، ومع ذلك، وليس شركة للتداول العام، وأنها شخصيا لا تملك أي أسهم / أسهم في IDT.

القدرة على صورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية باستخدام المجهر واسعة المجال التقليدي تتطلب إشارة مشرقة وصامد الفلورية لتترافق مع كل نسخة RNA وخلفية منخفضة الفلورسنت المنبعثة من تحقيقات الفلورسنت غير منضم. في هذه الطريقة، يتم التوصل إلى إشارة الفلورسنت مشرق بوا?...

التعبير وتنظيم محاضر RNA هو عملية معقدة وديناميكية هي المسؤولة إلى حد كبير عن السيطرة على سلوك الخلية ومصير. على الرغم من أهمية RNA في فرض وظيفة الخلية كان معروفا لبعض الوقت، غالبا ما يكون من الصعب رسم وصلات واضحة بين الاثنين لأن معظم أدوات التحليل RNA تفتقر إلى القرار المكانية والزمانية اللازمة لالتقاط الأحداث التنظيمية الهامة مثل النسخ انفجار، RNA الاتجار، ومعالجة RNA محلية. وقد أدى ذلك إلى ظهور العديد من التقنيات التي تسمح النصوص RNA الفردية أن تصور في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي 1. ولعل أبرز هذه التقنيات تستخدم انصهار بروتين GFP-MS2 لاستهداف RNA التي تم تصميمها لاحتواء يكرر جنبا إلى جنب لموقع ملزمة MS2 في 3&#39;-UTR 2،3. من خلال جلب جزيئات GFP متعددة في مقربة، تظهر النصوص RNA الفردية البقع الفلورسنت ومشرقعبر مضان المجهري. وقد وفرت نظام GFP-MS2 نظرة غير مسبوقة في السلوك RNA، بما في ذلك التصور المباشر وقياسات النسخي انفجار 4،5، كشف فريد التعريب شبه الخلوية والمعالجة 6-9، في الوقت الحقيقي والتصوير النقل RNA 10. ومع ذلك، على الرغم من الإمكانات الهائلة للنظام GFP-MS2، يمكن غير منضم GFP-MS2 البروتينات الانصهار إنشاء إشارة الفلورسنت الخلفية العالية التي تحد من التنوع والنطاق الديناميكي لهذه التقنية. وقد وضعت عدة طرق للحد من هذه الإشارة الخلفية، بما في ذلك التقسيم التحت خلوية من غير منضم GFP-MS2 10، البروتين جزء تكامل 11، وRNA ملزم البروتينات البديلة ويستهدف 12. ومع ذلك، كل هذه الأساليب لا تزال حساسة إلى التعبير النسبي والكلي للهدف RNA والبروتين GFP-MS2 الانصهار. باعتبارها وlternative إلى أنظمة GFP-MS2، قد استخدمت أيضا منارات الجزيئية للكشف عن النصوص RNA هندسيا مع تكرار جنبا إلى جنب لموقع ملزم التكميلي في 3&#39;-UTR 13،14. منارات الجزيئية هي تحقيقات قليل النوكليوتيد تشكيل دبوس الشعر التي وصفت في نهاية واحدة مع وفاكهه تقضي على الطرف الآخر مع مراسل الفلورسنت. عندما لا تكون ملزمة لاستهداف RNA مراسل الفلورسنت وفاكهه تقضي تبقى على مقربة، مما أدى إلى حالة منخفضة الفلورسنت. على التهجين، ويضطر مراسل الفلورسنت وفاكهه تقضي على حدة ويتم استعادة مضان. على غرار نظام GFP-MS2، ربط منارات الجزيئية متعددة على واحدة النتائج RNA نسخة في بقعة مضيئة الفلورسنت التي يمكن تحديدها بواسطة المجهر مضان. ومع ذلك، من المتوقع أن تكون أقل من ذلك بكثير، وذلك بسبب التكوين مروي من منارات الجزيئية غير منضم مضان الخلفية. للأسف، على الرغم من أن آلية تفعيل ذكية وهو مدرج في متصميم منارة olecular، هناك الآن أدلة متزايدة على أن الغير مهجنة منارات الجزيئية لا تبقى في التشكل عند منعطف حاد أدخلت الخلايا الحية. وبالتالي، فإنها تولد إشارة إيجابية كاذبة أن يخفف كثيرا للإشارة إلى الخلفية. للتغلب على هذا القصور، وضعنا مؤخرا تحقيقا اصطناعي جديد لتصوير RNA في الخلايا الحية، منارات ثنائي الجزيء ratiometric (RBMBs، الشكل 1A) 15،16. وتتكون من شقين RBMBs قليل النوكليوتيد 2&#39;-O-الميثيل التي تشكل هيكل هجين مع ميزات من كلا دبوس الشعر القصير RNA (shRNA) ومنارات الجزيئية. آلية حلقة وتفعيل مضان مشابهة لمنارة الجزيئية، في حين أن نطاق طويل مزدوج تقطعت بهم السبل مع عبء 3&#39;-UU هو أكثر سمة من shRNA. تم تصميم ميزات shRNA لدفع التصدير النووي الذي وجدنا زيادة عمر الخلايا إلى&gt; 24 ساعة، مع الحد الأدنى من تحلل ملحوظ، ويمنع فتح غير محددة من الحلقة. ونتيجة لذلك RBMBs تظهر خلفية إشارة إلى أعلى بكثير من منارات الجزيئية. تجدر الإشارة إلى أن RBMBs لا يمكن إعدادها باستخدام أليغنوكليوتيد] الحمض النووي، منذ تحقيقات المعتمدة على الحمض النووي لا تمتلك نفس القدرات التصديرية النووية تحقيقات القائم على الحمض النووي الريبي. هيكليا، تم تصميم حلقة RBMB عادة ما بين 15 و 21 قواعد طويلة، لخلق التوازن بين الخصوصية والانتقائية على RNA التهجين. تم تصميم جذع قصير الذي يشكل من نطاقات مكمل النفس اثنين عادة ما يكون 4 القواعد. إذا تم تحديد الجذعية أطول، فإن معدل التهجين بين حلقة RBMB وRNA الهدف هو تباطأ بشكل ملحوظ 17،18. على العكس، عندما يتم تحديد تسلسل الجذعية أقصر درجة حرارة انصهار غالبا ما تكون منخفضة جدا للحفاظ على الهيكل الجذعية حلقة عند 37 درجة مئوية، مما يؤدي إلى إشارة خلفية عالية. خصوصية RBMB هي أيضا حمراءuced كما هو تقصير طول الساق. منذ تسلسل RBMB الجذعية حلقة يمكن أيضا أن تؤثر على الأداء RBMB، فإنه يجب أن يتم اختيار بعناية 19. على وجه الخصوص، ينبغي أن يكون تسلسل حلقة مثالية الحد الأدنى من هيكل الثانوي، هجن لتسلسل RNA مع الحد الأدنى من هيكل الثانوي، وتجنب مواقع الربط البروتين، وتجنب خارج هدف ملزم. التوقعات كل RBMB وRNA هيكل الثانوي يمكن الحصول عليها باستخدام برنامج مثل mfold 20. يمكن تحديد التكميلية خارج المواقع المستهدفة باستخدام أداة بسيطة المحلية تعيين بحث النوكليوتيدات (انفجار). ومع ذلك، بسبب التضارب في توقعات النموذج وصعوبة في تحديد مواقع المتعهدة البروتين، ويجب في نهاية المطاف يمكن التحقق من صحة خصوصية كل RBMBs تجريبيا. إذا المرغوب فيه، وهو صبغ إشارة غير مروي الذي هو غير حساس للدولة التهجين يمكن أن تضاف إلى RBMB 15. إضافة صبغة مرجعية يمكن للعلاقات العامةأوفيد علامة للتسليم التحقيق واستخدامها للتصوير ratiometric، إذا كانت هناك حاجة قياسات أكثر دقة من إجمالي مضان الخلوية. الأصباغ إشارة تسمح القياسات لتعديلها الاختلافات في الخلفية بسبب خلية الى خلية الاختلافات في التسليم. ومع ذلك، عندما التصوير RNA الفردية النصوص الصبغة المرجعية ليس ضروريا. والجدير بالذكر، أن بعض الأصباغ إشارة تتداخل مع تصدير RBMBs من النواة، مما أدى إلى إشارة الخلفية أعلى قليلا في النواة. عندما تكون مصممة بشكل صحيح، RBMBs يمكن استخدامها لنسخ صورة RNA الفردية في الخلايا الحية واحدة، إذا تم تصميم الحمض النووي الريبي الهدف لاحتواء أربعة مواقع على الأقل RBMB ملزم (الشكل 1B) 16. RBMBs يمكن تقديمها بكفاءة إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا عبر microporation، مع قليل من دون التأثير على الخلايا الحيوية 21، والقياسات الكمية في التعبير الجيني يمكن أن تكونحصلت في غضون 30 دقيقة. وعلاوة على ذلك، فإن المنهجية هي حساسة نسبيا لمستويات تركيز RBMB وRNA الهدف، منذ مضان من RBMBs غير منضم تطفئ بكفاءة. هنا نقدم وصفا مفصلا للمنهجية المستخدمة في إعداد وتنقية RBMBs، فضلا عن إجراء عام لتقديم RBMBs في الخلايا الحية عبر microporation والتصوير النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

أدى إدراك متزايد أن كلا من التنظيم الزماني والمكاني في التعبير الجيني يمكن أن يكون لها عواقب مهمة على وظيفة الخلية إلى تطوير تقنيات مختلفة لتصور النصوص الفردية RNA في الخلايا الحية واحدة. أسلوب واحد الواعدة التي تمت مؤخرا وصفت تستخدم تحقيقا القائم على قليل النوكليوتيد البصرية، ratiometric منارة ثنائي الجزيء (RBMB)، للكشف عن النصوص RNA التي تم تصميمها لاحتواء أربعة على الأقل يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل الهدف RBMB في المنطقة 3&#39;-غير مترجمة. صممت خصيصا لRBMBs تنبعث منها إشارة مشرق الفلورسنت على التهجين إلى RNA مكمل، لكن على خلاف ذلك تبقى مروي. استخدام مسبار الاصطناعية في هذا النهج يتيح صامد، أحمر تحول، والأصباغ العضوية انبعاثاتها للغاية لاستخدامها في التصوير. ربط RBMBs متعددة إلى RNA محاضر النتائج هندسيا في بقع منفصلة مضان عندما ينظر إليها تحت المجهر الفلورسنت واسعة المجال. وبالتالي، فإن حركة النصوص RNA الفردية يمكن تصور بسهولة في الوقت الحقيقي من خلال اتخاذ سلسلة زمنية من الصور الفلورسنت. نحن هنا وصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم في الخلايا عن طريق microporation والعيش خلية التصوير النصوص RNA واحدة.

بعد وقت قصير من microporation الخلايا HT1080 بحضور RBMBs، RNA النصوص الفردية التي تم تصميمها لاحتواء متعددة RBMB ملزمة مواقع في هم 3&#39;-UTR تظهر البقع الفلورسنت ومشرق عندما التقط بواسطة اسعة المجال المجهري مضان (الشكل 2). بينما النصوص RNA الفردية مع مواقع الربط عدد قليل من أربعة...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons at JoVE.com

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

منارات ثنائي الجزيء Ratiometric (RBMBs) يمكن استخدامها لصورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية. هنا، نحن تصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم من RBMBs إلى الخلايا عن طريق microporation والتصوير الفلورسنت النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي.

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  University of Pennsylvania.  منارات ثنائي الجزيء Ratiometric (RBMBs) يمكن استخدامها لصورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية. هنا، نحن تصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم من RBMBs إلى الخلايا عن طريق microporation والتصوير الفلورسنت النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي. 

Video: Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

كمي، في الوقت الحقيقي وتحليل قاعدة الختان في نشاط إصلاح Lysates خلية الاستفادة من الآفات محددة منارات الجزيئية

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

تطبيق مشفرة وراثيا نيون اكسيد النيتريك (NO •) تحقيقات، وgeNOps، التصوير في الوقت الحقيقي من NO • إشارات في زنازين انفرادية

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

فحص حركية الميرنا في المكان والزمان في الإشريكية القولونية باستخدام الفلورس أحادي الجزيء بلونين في التهجين الموقعي

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

المراقبة في الوقت الحقيقي لتنشيط Aurora kinase A باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET التوافقية في الخلايا الحية

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...