ברצוננו להודות לקרן ריימונד ובברלי סאקלר על תמיכתם במחקר שלנו.

1. היווצרות הספרואידים גידול 3D, טיפולים תרופתיים ואוסף תמונה מבוצעים כפי שתוארו במאמר הקודם שלנו 15. 2. התקנת תוכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת תוכנת MATLAB מורשה למחשב המשמש לניתוח תמונה. ארגזי הכלים מMATLAB הבאים נדרשים גם כדי להיות מותקנות - ארגז כלים לעיבוד אותות, ארגז כלים של עיבוד תמונה, ו* ארגז כלים של מחשוב מקביל (* דרוש למצב מחשוב מקביל בלבד). הערה: אוניברסיטאות רבות לרכוש ולתחזק את רישיונות קבוצה, כך שהתוכנה היא חופשית להורדה ושימוש על ידי מדענים כלולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את תכנית SpheroidSizer מקובץ SpheroidSizer.zip (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קובץ zip במערכת הקבצים המקומי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את קובץ SpheroidSizer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הקבצים בספרייה / תיקייה ייעודית, אשר יכונה בהמשך כלtהוא &quot;מדריך התקנה&quot;. הערה: SpheroidSizer נבדק בהרחבה על מערכת הפעלה Windows 7. הוא צפוי לעבוד על מערכות הפעלה חלופיות עם התאמות מינימליות (לא נבדקו). </li></ol></li></ol> 3. הכנה לניתוח תמונה על ידי SpheroidSizer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הרזולוציה / קנה מידה תמונה של מערכת ההדמיה (בקנה מידה מוחלטת של התמונה במיקרון לכל פיקסל (מיקרומטר / pix)). הערה: אם גודלו של כל פיקסל על שבב המצלמה ידוע, בקנה מידה התמונה יכולה להיות מחושב כגודל פיקסל x ההגדלה אובייקטיבית (מיקרומטר / Pix). ניתן להשיג ערך זה מתוכנת ההדמיה מצוידת במיקרוסקופ כמטה משובץ או עם עזרה מיצרן מערכת הדמיה. ערך זה יידרש בשלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את כל פורמטי קובץ תמונת קניינית לפורמטים של קבצים המקובלים - TIFF, JPEG, ו פורמטים של קבצי תמונה נפוצה אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם קבצי תמונה ולסדר directories (איור 5 א). הערה: התוכנה מסתמכת על הפריסה הנכונה של מבנה ספריות ושמות קבצים כדי לאתחל מחדש את התוצאות לפורמט צלחת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן שם לקבצי התמונה בפורמט הבא: [שם צלחת] _ [שורה] [עמודה] [ארכה] או [שם צלחת] [רווח] [שורה] [עמודה] [ארכה]... [שורה] להלן סדר א&quot;ב ו[ עמודה] כדלקמן בסדר המספרים. הערה: ניתן למצוא תוכנת שינוי שם אצווה אוטומטי זמינה באופן חופשי כדי לסייע למשתמשים בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים את הספרייה / תיקייה המבוססת על הניסוי באופן הבא: כל ניסוי צריך להיות מדריך אחד. תחת הספרייה של כל ניסוי, לא אמור להיות תיקיות המשנה עבור כל נקודת זמן. מתחת לכל תיקיית נקודת זמן, לא אמורה להיות כל תמונות מכל הלוחות. הערה: על מנת שתוצאות הניתוח להיות מסודרים בצורה אופטימלית בתוצאות מעוצבות, אנו ממליצים לשמור על אותו מספר הספרות עבור כל מזהה ידי מילוי 0 על lEFT, למשל, נקודות זמן נקראות כמו 000H, 072H, ו144H. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח תמונה של spheroids ידי SpheroidSizer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MATLAB הפתוח, לאחר מכן פתח את &quot;החלון הפקודה&quot;, הקלד cd &#39;[מדריך התקנה]&#39; ולחץ על [RETURN]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד &quot;SpheroidSizer1_0&quot; ב&quot; Command Window &quot;ולחץ על [RETURN] כדי להפעיל את תכנית SpheroidSizer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;עיון&quot; בחלון SpheroidSizer1.0 כדי לבחור את ספריית הניסוי המכילה את כל תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;כלול תיקיות משנה&quot; לעבור מתחת לשדה הטקסט &quot;התיקייה&quot; לעבד תיקיות תמונה מקוננות מרובות תחת הספרייה המיועדת. הערה: אם &quot;כלול תיקיות משנה&quot; לעבור לא נבחר, רק התמונות ישירות תחת הספרייה מעובדות, וכל תיקיות המשנה הם התעלמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;On-the-fly תצוגה&quot; לחד פעמיתלהניח כל תמונה מפולחות על גבי תמונת המקור שלה לבקרת איכות כחישוב הוא להיות מוצא להורג. הערה: מהירות חישוב מהירה, אם אפשרות &quot;On-the-fly תצוגה&quot; לא נבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין &quot;החלטה&quot; (בקנה מידה תמונה / רזולוציה במיקרומטר / Pix) של התמונות ניתחו בתיבה, לתכנית להמיר כראוי מדידות של אליפטית מפיקסל למיקרומטר. הערה: כל התמונות באותה התיקייה או ניתח יחד יש לנקוט באותם מיקרוסקופ עם אותה המטרה, כך שהיקף תמונה / הרזולוציה נשארה קבועה לכל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמשים (אופציונליים) יכולים לעקוב שלב 5 להגדרות משתמש מוגדר מתקדמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מחשוב&quot; כדי להתחיל את החישוב. הערה: התוכנה מבצעת בדיקה אוטומטית שם קובץ לפני שתמשיך לחישוב. אם תיבת הדו שיח מופיעה המציין - &quot;שגיאה קיימת בקובץ&quot;, לחץ על &quot;היציאה ולהראות רשימה של טעויות&quot;ולתקן את השגיאות בשמות קבצים מופיעים (ראה שלב 3.3). לאחר מכן, לחץ על &quot;מחשוב&quot; כדי להתחיל את החישוב מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &quot;השהה&quot; כדי להשהות את החישוב; וניתן לחדש חישוב על ידי לחיצה על אותו כפתור המראה על &quot;המשך&quot;. הערה: &quot;לוח התוצאות&quot; מציג את &quot;קובץ&quot; &quot;התיקייה&quot;, &quot;נפח&quot; (במ&quot;מ 3), &quot;זמן&quot; (במיקרומטר), &quot;רוחב&quot; (במיקרומטר), ו( תיבת סימון) &quot;חוקית&quot; לכל הספרואידים ניתחו (איור 5 ג). נפח מחושב על בסיס הציר נמדד גדול (אורך) וציר המשני (רוחב) (V = 0.5 * אורך * רוחב 2). תיבת הסימון &quot;חוקית&quot; היא אופציה למשתמש לבחור אם הניתוח של התמונה הוא חוקי או לא חוקי, לאחר בקרת איכות, ראה שלב 6. </li></ol> 5. הגדרות משתמש מתקדמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;מתקדם&quot; בSpheroidSizer1.0 חלון כדי להעלות את החלון מתקדם תצורות על מנת להתאים את הגדרות משתמש מוגדר (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את שמות הקבצים של עניין &quot;פלט פורמט&quot; ותיבות &quot;פלט רשימה&quot; בחלון מתקדם התצורות תחת &quot;קלט&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן מספר בין &quot;2-10&quot; בתיבת &quot;צמצום&quot;. זה מקדם לתוכנה כדי להקטין את גודל התמונה בחישוב על מנת לשפר את מהירות החישוב. ככל שמספר, מהר יותר את מהירות החישוב. ברירת המחדל &quot;להפחית&quot; מוגדר 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את סיומת קובץ תמונה להיות-מעובד בתיבת &quot;כלול סוג&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את סיומות קבצי תמונה או סופים שלא הולכים להיות מעובד על ידי התכנית בתיבת &quot;תכלול סוג&quot; כדלקמן: &quot;_crude.jpg&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;ללא&quot; עבור &quot;מיוחד צבע&quot; לעבד 8 ביט וcol 16 קצתאו תמונות כמו שצריך; בחר &quot;קצת 12&quot; עבור &quot;מיוחד צבע&quot; לעיבוד תמונות צבע 12 סיביות כראוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק &quot;השתמש במחשוב מקביל&quot; אם המחשב משמש לניתוח תמונה מצויד במעבדים מרובים ו / או מעבדים מרובות ליבות. אם זה נכון, ואז ללכת לצעד 5.7.1; אם לא, אז לדלג 5.7.1 צעדים ו5.7.2. הערה: שגיאה תתרחש אם המחשב נמצא בשימוש אינו תומך בתצורה שנבחרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את האפשרות &quot;השתמש במחשוב מקביל&quot; בחלון מתקדם התצורות. הערה: השתמש רק במצב המחשוב המקביל, כאשר 4 או יותר ליבות זמינות למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיבת הזן מספר 4-12 ב&quot; # העובדים &quot;(מחשוב ליבות). הערה: מספר זה חייב להיות שווה או פחות ממספר ליבות מחשוב במחשב של המשתמש. מרבי של 12 מוטל על ידי ארגז הכלים המחשוב המקביל MATLAB תומך במקסימום של 12 ליבות. כאשר מחשוב המקבילי להיותING להורג, מופיע תיבת הדיאלוג קטנה לשאול את המשתמש להמתין לחישוב המקביל לסיים; החישוב לא יכול להיות מושהה, וגם לא תכונת &quot;On-the-fly תצוגה&quot; הוצאתו להורג במצב מחשוב מקביל. </li></ol></li></ol> 6. בקרת האיכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התא המתאים ב&quot; טבלת תוצאות &quot;כדי לאשר את גובה הגבול מדויק של אליפטית בתמונות מנותחות, הערה: התמונות המקוריות ובקרת האיכות תופיע בצד ימין לבדיקה. המשתמש יכול לבחון את כל התמונות ברצף באמצעות החץ למטה במקלדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקד את הגבול של אליפטית בתמונה שנבחרה באמצעות שני הכלים הבאים, במידת צורך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;אתחול ידני&quot; כדי להציג את התמונה המקורית. לאחר מכן לחץ והחזק העכבר ימני מחוץ אליפטית ולגרור את כלי האליפסה כדי לכסות אליפטית בתמונה המקורית. הערה:אלגוריתם ctive-קונטור יוזם באמצעות קווי המתאר שהוגש משתמש ומבצע להתכנס על המתווה אליפטית הרצויה. &quot;לוח התוצאות&quot; יתעדכן באופן אוטומטי עם התוצאות חדשות. האפשרות &quot;האתחול ידני&quot; מאפשרת למשתמש לספק אתחול ידני לפעיל גובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;יד צייר&quot; כדי להציג את התמונה המקורית. לאחר מכן השתמשתי בעכבר או מסך מגע אפשר לשרטט את הגבול של אליפטית בדיוק. הערה: קווי המתאר זו נמדד ישירות כדי לייצר צירים ראשיים ומשניות, המתעדכנים ב&quot; לוח התוצאות &quot;. כלי &quot;יד צייר&quot; משמש רק כאשר באפשרות &quot;ידני אתחול&quot; לא מצליחה להתכנס על הגבול הרצוי של אליפטית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסימון מתיבת הסימון בעמודה &quot;חוקית&quot; בשורה המתאימה של &quot;לוח התוצאות&quot;, כאשר תמונה אינה מכילה כל אליפטית תקף בעת הבדיקה. &quot;; תווית לא חוקית &quot;מופיעה בפינה השמאלית העליונה של תמונת בקרת האיכות. אם &quot;חוקי&quot; הוא לא מסומן, הערכים של כל המדידות הם ריקים לאליפטית בקבצי תוצאות מעוצבות ופלט המיוצאים. הערה: קיצורי המקשים הבאים זמינים לשימוש ב&quot; טבלת תוצאות &quot;:&quot; חץ למטה &quot;לתמונה הבאה; &quot;V&quot; בתוקף / לא חוקי; &quot;מ &#39;&quot; לאפשרות &quot;אתחול ידני&quot; ו &quot;h&quot; לאפשרות &quot;צייר יד&quot;. </li></ol> 7. שמירה ויצוא של נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;יצוא המחקר&quot; בחלון SpheroidSizer1.0 לייצא את מצב הביניים של הניתוח, אם המשתמש צריך כדי לצאת מהתוכנה לפני שסיימתי את הפרויקט. ציין את השם וספרייה של הקובץ כדי להינצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;יבוא מחקר&quot; כדי להחזיר את תוצאת מצב הביניים לעיל מ&quot; יצוא מחקר &quot;ונמשיך work על זה. הערה: קבצי מצב הביניים הם בפורמט טבעי של MATLAB (מחצלת.) ואינם ניתן לקריאה באופן ישיר על ידי כל תוכנות אחרות. תכונת בטיחות מובנהית בתוך התוכנה הופכת את היצוא אוטומטי של הפרויקט הפתוח למקרה שהתכנית יוצאת שלא בכוונה. בעת צורך, המשתמש יכול למצוא את הקובץ הזה, ששמה מתחיל ב &quot;~ tmp&quot; המכיל את חותמת הזמן המקבילה ב[ מדריך ההתקנה]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;תוצאות פורמט&quot; בחלון SpheroidSizer1.0 כדי לשמור את התוצאות. הערה: שתי צורות של תוצאות נשמרות בספרייה של הניסוי. ניתן להגדיר שמות הקבצים מיוצאים בחלון מתקדם התצורות (ראו שלב פרוטוקול 5.2). קובץ הפלט בפורמט הוא שולחן שמסומן כרטיסייה שמארגן את ערך הנפח לפורמט הצלחת המקורי לפי הסדר של מספר לוחית עולה עבור כל נקודת זמן; וכל נקודות הזמן מאורגנות בבסדר עולה (איור 5D). O הרשימהקובץ utput הוא שולחן שמסומן כרטיסייה המכיל את כל המדידות בצורה של רשימות ממוספרות (איור 5E). </li></ol>

<ol>
	<li>Hamilton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids+as+an+in+vitro+tumor+model.">Multicellular spheroids as an in vitro tumor model.</a> Cancer Lett. 131, 29-34 (1998).</li><li>Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+multicell+spheroids+in+tissue+culture+as+a+model+of+nodular+carcinomas.">Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas.</a> J Natl Cancer Inst. 46, 113-120 (1971).</li><li>Inch, W. R., McCredie, J. A., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+nodular+carcinomas+in+rodents+compared+with+multi-cell+spheroids+in+tissue+culture.">Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture.</a> Growth. 34, 271-282 (1970).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids.">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37, 3639-3643 (1977).</li><li>Ayers, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+of+preclinical+xenograft+tumors+is+more+accurately+assessed+by+ultrasound+imaging+than+manual+caliper+measurements.">Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements.</a> J Ultrasound Med. 29, 891-901 (2010).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).</li><li>Monazzam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new,+fast+and+semi-automated+size+determination+method+(SASDM)+for+studying+multicellular+tumor+spheroids.">A new, fast and semi-automated size determination method (SASDM) for studying multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Cell Int. 5, 32 (2005).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Chan, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).</li><li>Bernard, O., Friboulet, D., Thevenaz, P., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variational+B-spline+level-set:+a+linear+filtering+approach+for+fast+deformable+model+evolution.">Variational B-spline level-set: a linear filtering approach for fast deformable model evolution.</a> IEEE Trans Image Process. 18, 1179-1191 (2009).</li><li>Kass, M. W. A., Terzopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snakes:+Active+contour+models.">Snakes: Active contour models.</a> International Journal of Computer Vision. 1, 321-331 (1987).</li><li>Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neuroendocrine+tumor+cell+lines+as+a+three-dimensional+model+for+the+study+of+human+neuroendocrine+tumor+therapy.">Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy.</a> J Vis Exp. (66), (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מחקר זה מציג תכנית מהירה, גמישה, יעילה ואוטומטית - SpheroidSizer לקביעה מדויקת של הגודל של הספרואידים גידול 3D. SpheroidSizer הוא קל לשימוש ודורש קלט משתמש מינימאלי. השלבים הקריטיים ביותר לריצה מדויקת, חלק והמוצלח של SpheroidSizer כוללים: שהספרואידים הם צילמו במרכז השדה בלי לגעת בקצה של באר; כל הקבצים שנתחו יחד כפרויקט אחד צריכים להיות צילמו באותם מיקרוסקופ עם אותה המטרה; כל הקבצים להיות מנותחים נקראים בצורה נכונה ומסודר כפי שמצוינים בפרוטוקול; והגדרות המוגדר על ידי משתמש נכונים הם נכנסו לפני החישוב. היתרונות של SpheroidSizer כוללים את יכולתו לסבול את שינוי רקע הדרגתי בתמונה, כמו גם ליצירת קווי המתאר חלק שמתאימות לצורות כדוריות הכלליות של הספרואידים ניצול אלגוריתם מתאר הפעיל. ביצועים של פעילגובה יכול להיות בסכנה בשני מצבים: אתחול עני, או נוכחות של קצוות מקומיים אחרים להסיח מהגובה הרצוי. במיוחד במקרים שנבדקו, המצב השני לפעמים קורה כאשר ליבת נמקים של אליפטית גדול מושך אליו את קווי המתאר הפעילים וכתוצאה מכך גובה קטן יותר שדווח. ראוי לציין כי שיטות המבוסס על סף אוטומטי אחרות סובלות גם במצב זה, אלא אם כן לסף מוגדר באופן ספציפי ביד. התוכנה לכן מעבירה קדימה מאמץ כדי לסייע למשתמשים לזהות ולתקן פילוח נפרץ על ידי אספקת תכונות בקרת איכות קלה. אם שגיאת פילוח קורה מאתחול עני, שימושים יכולים להשתמש בכלי &quot;ידני אתחול&quot; כדי לעקוף את האתחול האוטומטי. כאשר איכות תמונה ירודה מדי לקווי מתאר פעילים, משתמשים יכולים בקלות &quot;יד צייר&quot; את קווי המתאר שמזין לכימות. תוכנה הקיימת כגון CellProfiler יכולה להיות מותאמת ליישום זה בfashio חצי אוטומטי-n. זרימת העבודה יכולה להיות מסורבלת, כאשר כמויות גדולות של תמונות בתנאי הדמיה שונות מוצגות או כאשר קבוצת משנה של תמונות צריכה התערבות אנושית יותר למדוד בצורה נכונה. SpheroidSizer מספק חבילת All-in-One עבור חישוב ובקרת איכות לניהול זרימת עבודה ניתוח תמונת תפוקה גבוהה. SpheroidSizer כיום מוגבל לאיתור אליפטית אחת לכל תמונה ורק מודד את האורך הצירי של אליפטית. ניתן להרחיב את התכנית לתמיכה בכימות נוסף לפי צורך על ידי חוקרים כגון כימות על הספרואידים עם ליבת נמקים, גילוי הספרואידים מרובים בתמונה אחת או ניטור צורת הספרואידים. יתר על כן, ניתן לשנות את התכנית כדי לזהות ולמדוד את הגודל של הגידולים נכרת מבעלי חיים או בני אדם, אשר בהחלט יהיו מועילה לחוקרים בעת ביצוע in vivo טרום קליני או מחקר קליני. לאחר עיבוד של הספרואידים זוהו גם יכול להיחקר מטרהing בהפחתת מאמץ אנושי הנדרש לבקרת איכות ועוד שיפור תפוקה. SpheroidSizer הוא יישום ניתוח תמונה כללי להספרואידים גידול 3D, המיוצרים מכל סוגי תאים, ולכן ניתן להשתמש בו על ידי קהילת חקר הסרטן רחבה.

הספרואידים גידול תלת ממדי (3D) הם &quot;מצרפי סימטריה כדורית של תאים סרטניים דומים לרקמות, ללא מצע מלאכותי לקובץ מצורף תא&quot; 1-3. הציטולוגיה והמורפולוגיה של הגידול spheroids מחקה טוב יותר in vivo ארגון רקמת גידול וmicroenvironments מאשר תאי monolayer דו ממדים (2D). הספרואידים גידול 3D הפכו למודל מעשי במבחנה להקרנות תפוקה גבוהה של תרופות טיפוליות אנטי סרטניות או לבחון את היעילות של תרופות מועמד לפני בעלי החיים in vivo או בדיקה קלינית 4. מבחינה קלינית, את היעילות של כל טיפול תרופה נגד סרטן מוערך בהתבסס על צמיחת גידול מופחתת. בדומה לכך, אליפטית נפח יכול לשמש כמדד ליעילות ללימודי תרופה לסרטן במבחנה. נפח אליפטית (V = 0.5 * אורך * רוחב 2) נקבע בהתבסס על האורך הצירי הראשי ומשניות (ידוע יותר בכינויו אורך ורוחב)של הספרואידים 6, 7. רוב החוקרים צריכים לצייר באופן ידני את האורך ורוחב על כל אליפטית, לעתים קרובות באמצעות התוכנה המוצעים על ידי חברות מיקרוסקופיה ונמכרת יחד עם מכשירי ההדמיה. טכניקה זו הופכת להיות בעייתית כאשר מסכי סמים תפוקה גבוהה מבוצעים ויותר ממאה תמונות מיוצרים. כמה מחקרים שנעשה לאחרונה דיווחו על השימוש בארגזי כלי תוכנה לניתוח פתוחים תמונת המקור כגון CellProfiler 8-10 ו11 ImageJ לפתח שגרת פילוח / פקודות מאקרו הבסיסיות שהיה כרוך בתיקון תאורה וthresholding הפשוט. אלה שגרות לעתים קרובות צריכה להיות מחדש מותאמות לקבוצות שונות של תמונות על פי תנאי תאורה והשינוי לעומת תמונה; לכן, חבילות תוכנה אלה לא יכולים לענות על דרישת חוסנו של ניתוח תמונת תפוקה גבוהה. פרידריך ומשתפי פעולה (2009) השתמשו בתוכנת קניינית למדוד למחצה מכוניו הנפח של אליפטיתatically 5. השיטה המתוארת בMonazzam ונייר &#39;עמיתיו 10 הייתה שיטה חצי אוטומטי למדידת הגודל של אליפטית רק למספר קטן של תמונות. משום כך, קיים צורך ברור בכלים חזקים, גמישים, אוטומטיים וניתוח תמונה מוכן לשימוש להספרואידים גידול 3D. במחקר זה, אנו מתארים SpheroidSizer - יישום תוכנה בקוד פתוח המבוסס על MATLAB ולמדוד את הגודל של הספרואידים גידול באופן אוטומטי ובאופן מדויק. SpheroidSizer נועד לעבד קבוצות רבות ושונות של תמונות של הספרואידים 3D באותה הפגישה. ניצול אלגוריתם מתאר הפעיל 12-14, SpheroidSizer יכול לסבול שינוי לעומת תמונה, וחסונה להתעלם שינוי הדרגתי בתאורת רקע ולהכיר הספרואידים בתמונה. זה גם יכול לסבול הרבה חפצים רגילים, למשל, פסולת, שמקורה בדגימה. זרימת העבודה מתוכננת כך שמשתמשים יכול לבצע contro איכותליטר במהלך או לאחר החישוב. דריסה ידנית של תוצאת הניתוח בקלות יכולה להתבצע במקום. מנצל את ארגז הכלים של המחשוב המקביל, מהירות הניתוח יכולה להיות שיפרה עוד יותר על ידי תיאום ליבות מחשוב מרובות לעבוד על החישוב בו זמנית על המחשב של משתמש. יתר על כן, SpheroidSizer פלטי התוצאות בשתי צורות שונות כדי לאפשר התממשקות קלה עם כלי ניתוח במורד הזרם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="569">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:123px;">Axiovert 200M inverted microscope</td>
			<td style="width:176px;">Carl Zeiss Microscopy, LLC</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:183px;">microscope for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:123px;">Vostro 1720</td>
			<td style="width:176px;">Dell Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:183px;">single-core regular laptop</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">HP Z820</td>
			<td style="width:176px;">HP Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:183px;">multi-core performance workstation</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:123px;">Matlab and Simulink R2013a</td>
			<td>Mathworks, Inc, Natick, MA</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:183px;">Matlab software&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput image analysis of tumor spheroids: a user-friendly software application to measure the size of spheroids automatically and accurately

מספר גדל והולך של יישומים של (3D) הספרואידים גידול תלת ממדים כמודל במבחנה לגילוי סמים דורש ההסתגלות שלהם לפורמטים הקרנה בקנה מידה גדולה בכל שלב של מסך בסמים, כוללים ניתוח תמונה בקנה מידה גדולה. נכון לעכשיו אין תוכנת ניתוח תמונה מוכנה לשימוש וחופשי לפגוש בפורמט גדול בקנה מידה זה. השיטות הקיימות ביותר כרוכות ציור האורך והרוחב של הספרואידים 3D צילמו, וזה תהליך מייגע וגוזל זמן באופן ידני. מחקר זה מציג יישום תפוקה גבוהה תוכנת ניתוח תמונה - SpheroidSizer, המודד את האורך הצירי הראשי ומשניות של הספרואידים גידול 3D צילמו באופן אוטומטי ובדייקנות; מחשב את עוצמת הקול של כל אליפטית גידול 3D פרט; ואז פלטו את התוצאות בשתי צורות שונות בגיליונות אלקטרוניים למניפולציות קלים בניתוח נתונים שלאחר מכן. היתרון העיקרי של תוכנה זו הוא היישום שלה חזק תמונת ניתוח שהואמותאם למספר גדול של תמונות. הוא מספק חישוב תפוקה גבוהה וזרימת עבודה בקרת האיכות. הזמן המשוער לעבד 1,000 תמונות הוא כ 15 דקות על מחשב נייד מוגדר מינימאלי, או סביב 1 דקות בתחנת עבודה של ביצועים מרובות ליבות. ממשק המשתמש הגרפי (GUI) נועד גם לבקרת איכות קלה, ומשתמשים יכולים לעקוף באופן ידני את תוצאות המחשב. השיטה העיקרית ששמשה בתוכנה זו מותאמת אלגוריתם הפעיל קווי המתאר, הידוע גם נחשים, שהוא מתאים במיוחד לתמונות עם תאורה לא אחידה ורקע רועש, כי לעתים קרובות המכות עיבוד הדמיה אוטומטית במסכי תפוקה גבוהה. &quot;האתחול הידני&quot; חינם וכלים &quot;צייר יד&quot; לספק את גמישות SpheroidSizer בהתמודדות עם סוגים שונים של הספרואידים ותמונות באיכות שונות. תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה זה להפליא מפחיתה עבודה ומאיצה את תהליך הניתוח. יישום תוכנה זו היא בeneficial להספרואידים גידול 3D להפכה לשגרה במודל חוץ גופית למסכי סמים בתעשייה ובאקדמיה.

SpheroidSizer נועד לייצר זיהוי אוטומטי, סימון ומדידה של הספרואידים 3D, עם עבודה מופחתת להפליא והתייעלות בחריפות לכמויות גדולות של תמונות. איור 1 א מציג את תהליך העבודה של SpheroidSizer. צעדי חישוב הליבה כוללים אתחול אוטומטי, אלגוריתם מתאר פעיל וכימות גובה. לאחר חישוב אוטומטי, תכונת בקרת האיכות משתמשת בשילוב של &quot;אתחול ידני&quot; וכלים &quot;צייר יד&quot; כדי להציל את כל פילוח מושלם. איור 1 מדגים את אלגוריתם מתאר מפורט האוטומטי הפעיל. שלב האתחול (איטרציה ה 0) מנצל את הפעולות עיבוד תמונה בסיסיות כדי ליצור גודל ומיקום משוערים של אליפטית וליצור קווי המתאר ייזום כדוריים עם גודל מוערך. קווי המתאר ייזום הזנות לתוך אלגוריתם מתאר הפעיל. בתורו סובב להתאים לפי התמונה המקומיתשיפוע ועקמומיות צורה. אלגוריתם מתאר הפעיל מסיים כאשר הגובה מתייצב (מתכנס), כלומר 477 חזרות לתמונה זו, או כאשר המספר המרבי המוגדר מראש של חזרות הוא הוצא להורג. בדוגמא זו, את קווי המתאר האתחול מוגדל במכוון, כדי להפגין את האלגוריתם טוב יותר. במציאות, האתחול הוא בדרך כלל קרוב מאוד לגבול בפועל והרבה פחות חזרות יש צורך באלגוריתם להתכנס. בהמשך לכך, האלגוריתם לוקח מדידות morphometric של הגבול אליפטית זוהה. הצירים הראשיים ומשניות של אליפטית נמדדים באמצעות ארגז הכלים MATLAB עיבוד תמונה (איור 1 ג). הציר המרכזי מוגדר כקטע הקו המחבר בין זוג אחד של הנקודות המרוחקות ביותר על קווי המתאר, הנקרא אורך (L). הציר המשני מוגדר כקו הארוך ביותר בניצב לציר המרכזי, המכונה לרוחב (W). במקרה זה, הערכים של L ו-W קרובים מאוד מאזאליפטית היא כדורית. היקף אליפטית מחושב כV = * L * 0.5 W 2. אחד המאפיינים של SpheroidSizer הוא זיהוי האוטומטי של גבול הספרואידים אפילו בתמונות עם רקע אחיד או רועש ניצול אלגוריתם מתאר הפעיל (איורים 2 ב-D). עיבוד חישוביים בתמונות שדה בהירות הוא סובל לעתים קרובות על ידי רקע אחיד, שמטעה את שיטות המבוססים על ערכי סף אדפטיבית כדי להפיק תוצאות thresholding לא רצויות. הבעיה בולטת במיוחד כאשר צלחות רב גם משמשות וקירות של הבארות עשויים ליצור אפקטי הצללה על התמונות. עם זאת, מכיוון שאלגוריתם מתאר הפעיל אינו רגיש לשינוי ההצללה ההדרגתי ברקע, הוא מסוגל לזהות פילוח אליפטית בתמונות האלה בשדה בהירות עם אתחול נכון. איור 2 מראה כמה דוגמאות של תמונות עם רקע אחיד, או רועש, כמו לא אחיד תאורה (איור 2 </strאונג&gt;), פסולת (איור 2C) או ליבת נמקים (איור 2 ד). עם אלגוריתם מתאר פעיל אוטומטי, SpheroidSizer משרטט הספרואידים אלה במדויק בכל התמונות הללו, כפי שמוצג בקווי המתאר האדומים בפנל התחתון של כל דמות. תכונת בקרת האיכות של SpheroidSizer היא מפתח לעבודת תפוקה גבוהה. &quot;האתחול הידני&quot; וכלים &quot;צייר יד&quot; הם כלים חינם בעל הערך עבור יישום זה. בין מאות או אלפי תמונות, זה בלתי נמנע כי האלגוריתם האוטומטי הוא לא מסוגל לזהות בצורה נכונה הספרואידים בכמה תמונות. כפי שמודגם באיור 3 א, כאשר זיהוי לא נכון של אליפטית נגרם עקב שלב האתחול, גודל לא תקין כלומר או מיקום של קווי המתאר הייזום בתמונה (פנל עליון), באפשרות &quot;ידני אתחול&quot; עובדת על ידי המאפשר למשתמש כראוי להגדיר את המיקום וגודל של spherOID ידני (פנל תחתון). היא מפעילה אלגוריתם מתאר הפעיל ליזום עם קווי המתאר מוגדרים באופן ידני ולבצע להתכנס על המתווה הרצויה. לתמונות קשות האלה כמו התמונה המקורית באיור 3 ב, אליפטית ממוקמת ברקע מסיח את הדעת ורועש. SpheroidSizer הוא לא הצליח לזהות את אליפטית כראוי על ידי השיטה האוטומטית (פנל עליון) או על ידי כלי &quot;ידני אתחול&quot; עם אתחול נכון (פנל באמצע). במקרה זה, באפשרות &quot;צייר יד&quot; ניתן להשתמש כדי לצייר באופן ידני את קווי המתאר של אליפטית כפי שמודגם בפנל התחתון. התכנית משתמשת בגבול מוגדר על ידי המשתמש כדי למדוד את הצירים הראשיים ומשניות של אליפטית ולחשב את עוצמת הקול. כל התוצאות מתוקנות תיכללנה מיידית &quot;טבלת תוצאות&quot; וניתן לייצא בהתאם. כדי לקבוע את הביצועים של SpheroidSizer בערכות נתונים גדולות יותר, אנו משווים את זמן פעולה לראשונה על ידיניתוח אותו הסט של 288 תמונות באמצעות מדידות 1) ידניות עם תוכנה מסופקת על ידי יצרן מיקרוסקופ; 2) SpheroidSizer עם מחשב נייד רגיל בעל ליבה אחת; ו 3) SpheroidSizer עם תחנת עבודה של ביצועי מחשוב מקבילים מרובות ליבות. המדידות ידניות לעקוב אחר הפרוטוקול הטיפוסי שלנו לפני פיתוח התוכנה: האורך והרוחב של כל אליפטית נמשכים ביד ונמדדו באמצעות תכנית הספק (כפי שניתן לראות קווים האדומים בפנל העליון של איור 4 א); לאחר מכן עותקי המשתמשים למטה את ערכיה של המדידות. SpheroidSizer מעבד כל תמונה על ידי יצירת הגבול אליפטית (כפי שמוצג קווי המתאר האדומים בפנל התחתון של איור 4 א), מדידת האורך הראשי ומשניות הצירי, ויצוא התוצאות בגיליונות אלקטרוניים. כפי שניתן לראות בטבלה 1, המבוסס על החישוב מ288 תמונות, זה לוקח בממוצע 31.67 שניות כדי למדוד אליפטית אחד לכל תמונה באופן ידני; בזמן שהוא לוקח רק פחות מ -2 שניות וSpheroidSizer<html> 160 #; בעת הפעלה על מחשב נייד רגיל בעל ליבה אחת; ושנייה פחות מ 1 כאשר פועלים על תחנת עבודה של ביצועי 12 ליבות. לכן, ניתוח תמונה הוא מעל 18x מהר יותר לכל תמונה באמצעות SpheroidSizer מאשר מדידות ידניות. זה מפחית באופן דרמטי עבודה כאשר יותר מאלף תמונות מנותחות. בשלב הבא, אנו משווים את השונות במדידות של הספרואידים 24 שמוצגים באיור 4 א בין מדידות ידניות וSpheroidSizer. 24 הספרואידים נמדדים שלוש פעמים על ידי שני השיטות; וסטיית התקן של כל אליפטית פרט מחושבת. כפי שניתן לראות באיור 4 ב &#39;, סטיית התקן מSpheroidSizer (קו ונקודות ירוקים) הוא קרוב לאפס פרט לשלושת הספרואידים שמתוקנים בשלב בקרת האיכות, שעדיין מראה סטיית תקן קטנה יותר מאלה של שיטת המדידה הידנית. כל אלה מצביעים על כך שSpheroidSizer מבצע את ניתוח תמונה בצורה יעילה יותר ובאופן מדויק. e_content &quot;&gt; ערכנו את מסך בסמים באמצעות הספרואידים BON-1 גידול 3D אנושיים כדי לגלות אילו תרכובות בשילוב עם מעכב Hsp90 הם המועמדים הפוטנציאליים לבדיקת ההשפעות אנטי גידול in vivo. הספרואידים גידול BON-1 3D אדם היו מבוגרים על צלחות 96 היטב מצופה agarose כפי שתואר במאמר הקודם 15. שמונה תרכובות שונות עם שישה דילולים סדרתי בתוספת תקשורת ורכב הוקרנו על האפקטים היחיד וקומבינטורית שלהם עם 10 ננומטר ו20 מעכב Hsp90 ננומטר בכפילויות בהתאמה. שני הספרואידים היו משמש עבור כל ריכוז של התרכובת בודדת או התרכובות המשולבות. ארבע צלחות 96 היטב עם כולל 384 הספרואידים היו בשימוש. כל הספרואידים היו הדמיה ב 0, 72, 144, 168, ו192 שעה. כולל של 1,920 תמונות יוצרו מניסוי זה. זה לקח SpheroidSizer רק 30 דקות כדי להשלים את האנליזה חישובית של 1,920 תמונות עם 50 דקות נוספות לבקרת האיכות ויצוא נתונים. spheroidSizer מאיץ את תהליך ניתוח התמונה מאוד. איור 5A תערוכות צילום מסך של הסדרי התיקייה ושמות קבצים לצורך הניסוי הזה כדוגמא לשלב פרוטוקול 3.3. איורים 5 ב-E מראה את צילומי המסך של החלונות קופצים ניתוח תמונה ותוצאות . באמצעות SpheroidSizer כאיורים לפרוטוקול שלבים 4, 5, ו -7 לוקחים את הכרכים של הספרואידים 3D מטבלת התוצאות מעוצבות מיוצאות מSpheroidSizer, עשינו גרפים - צמיחה של הספרואידים גידול 3D על טיפולי מתחם לעומת הזמן של טיפולים. שני גרפים נציג מניסוי זה מוצגים באיור 5F ו5G. 5F איור מראה כי הטיפולים המשולבים של מעכב Hsp90 וcladribine (קו ירוק) לעכב את הצמיחה של 3D spheroids יותר מהטיפול היחיד של מעכב Hsp90 (קו סגול) או cladribine (קו כתום), טוען כי הטיפולים המשולבים של מעכב Hsp90 ו cladribine יכול להיות EF אנטי הסרטניfects in vivo. איור 5G מראה כי הטיפולים המשולבים של מעכב Hsp90 ואדריאמיצין (קו ירוק) לא לעכב את הצמיחה של 3D spheroids יותר מהטיפול היחיד של אדריאמיצין (קו כתום) או מעכב Hsp90 (קו סגול), המצביע על כך טיפולים משולבים של מעכב Hsp90 ואדריאמיצין לא יכולים להיות השפעות אנטי סרטניים בגוף חי. ניסוי זה עזר לנו טוב יותר לבחור את התרכובות כדי לבדוק ההשפעות האנטי הסרטני שלהם in vivo ו SpheroidSizer הוא המפתח לניתוח נתוני ניסוי הזריז. <img alt="טבלת 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51639/51639table1.jpg" width="600" /> טבלה 1. השוואה של זמן פעולה בניתוח תמונה בין מדידות ידניות וSpheroidSizer בעת ניתוח אותה הקבוצה של 288 תמונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51639/51639table1.jpg" target="_blank">אנא ג</a><html> ללקק כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51639/51639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51639/51639fig1.jpg" /> א) איור יישום תוכנת קוד פתוח למדידת הגודל של אליפטית זרימת העבודה הליבה של היישום ב &#39;) של אלגוריתם מתאר הפעיל בשלבים שונים של איטרציה - איור 1 SpheroidSizer.... שים לב שקווי מתאר האתחול (איטרציה 0) הורחב במכוון על מנת להציג את האלגוריתם. C) מדידות האורך צירי הראשיות ומשניות וחישוב הנפח על ידי SpheroidSizer. L - ציר עיקרי: פעילות הקו המחבר בין זוג אחד של נקודות המרוחקות ביותר על קווי המתאר (המכונה אורך); W - ציר קטין: הקו הארוך ביותר בניצב לציר המרכזי (המכונה &#39;רוחב). <html> class = &quot;jove_content&quot; עבור: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51639/51639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51639/51639fig2.jpg" /> תמונות תמונות תמונות איור 2. נציג תוצאות מהפילוח האוטומטי של SpheroidSizer, מראה חוסן נגד תנאי תמונה שונים.) תמונות באיכות טובה אופיינית. ב &#39;) עם בהירות והניגודיות שונות. C) עם להסיח פסולת. ד) הספרואידים עם ליבת נמקים . תמונות בפנל העליון של כל דמות הן המקור / תמונות מקוריות; תמונות בפנל התחתון של כל דמות הן תמונות בקרת האיכות; ואת קווי המתאר האדומים הוא הפילוח אליפטית שצויר על ידי חישוב אוטומטי. &quot;Src =&quot; hres.jpg / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. איור של &quot;האתחול הידני&quot; ו &quot;יד צייר&quot; כלים.) אפשרות &quot;ידני אתחול&quot; מאפשרת הציור של צורת אליפסה מתאימה ברחבי אליפטית לאתחול, כאשר פילוח אליפטית מדויק מתרחש לאחר האתחול האוטומטי. B ) כלי &quot;יד לצייר&quot; מאפשר מדויקת יד ציור של גבול אליפטית, כאשר פילוחים אליפטית מדויקים להתרחש עם אתחול הן אוטומטי וידני. הקו הכחול סביב אליפטית מציג את קווי המתאר האתחול; את קווי המתאר האדומים הוא הגבול אליפטית המזוהה. שים לב שאליפטית ב&quot; אתחול ידני &quot;ב) ואליפטית ב&quot; צייר יד&quot; בבוקר) מוגדל במכוון, כדי להפגין טוב יותר את הכלים. <img alt="איור 4" fo:content-width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51639/51639fig4.jpg&quot; src איור 4. השוואה של ביצועי ניתוח תמונה בין SpheroidSizer ומדידות ידניות בעת ניתוח אותה הקבוצה של 24 תמונות. א) הספרואידים נציג כדי להראות עד כמה את האורך והרוחב של הספרואידים נקבעים על ידי מדידות ידניות וSpheroidSizer. 24 תמונות למעלה להכיל אורך / רוחב המצויר ביד של כל אליפטית בקווים אדומים באמצעות מדידות ידניות; נמוכות 24 תמונות (אותו 24 תמונות) מכילות גבול אליפטית מצויר במחשב בקווים אדומים באמצעות SpheroidSizer. B) סטיית התקן של אורך או רוחב של שלוש מדידות בכל אליפטית בודד. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51639/51639fig5highres.jpg" width="600" /> איור 5. דוגמא מייצגת של ניצול של אליפטיתסייזר במסך סמים - ניתוח תמונה בתמונות &#39;הספרואידים שנאספו ממסך סמים באמצעות הספרואידים גידול BON-1 3D צילום מסך של הסדרי התיקייה ושמות קבצים עבור פרויקט זה ב&#39;) צילום מסך של מתקדם).. חלון תצורות בSpheroidSizer. C) צילום מסך של חלון SpheroidSizer1.0 עם שולחן תוצאות מוצג. ד &#39;) צילום מסך של קובץ הפלט בפורמט המיוצא מSpheroidSizer. ה) צילום מסך של קובץ פלט הרשימה המיוצא מSpheroidSizer. F) צמיחה של הספרואידים גידול 3D על הטיפולים עם מעכב Hsp90 וcladribine צמיחה. G) של הספרואידים גידול 3D על הטיפולים עם מעכב Hsp90 ואדריאמיצין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51639/51639fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &lt;/ P&gt;

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately at JoVE.

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

אנו מציגים יישום תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה כדי למדוד את גודלו של הספרואידים גידול תלת ממדים צילמו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. יישום זה מספק דרך מהירה ויעילה כדי לבחון את ההשפעות של תרופות טיפוליות בהספרואידים, אשר מועיל לחוקרים המעוניינים להשתמש הספרואידים במסכים בסמים.

ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

high-throughput-image-analysis-tumor-spheroids-user-friendly-software

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Views.  Raymond and Beverly Sackler Foundation, New Jersey.  אנו מציגים יישום תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה כדי למדוד את גודלו של הספרואידים גידול תלת ממדים צילמו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. יישום זה מספק דרך מהירה ויעילה כדי לבחון את ההשפעות של תרופות טיפוליות בהספרואידים, אשר מועיל לחוקרים המעוניינים ?...

Video: High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Tomato Analyzer: A Useful Software Application to Collect Accurate and Detailed Morphological and Colorimetric Data from Two-dimensional Objects

Measuring fruit morphology and color traits of vegetable and fruit crops in an objective and reproducible way is important for detailed phenotypic analyses of these traits. Tomato Analyzer (TA) is a software program that measures 37 attributes related to two-dimensional shape in a semi-automatic and reproducible manner1,2. Many of these attributes, such as angles at the distal and proximal ends of the fruit and areas of indentation, are difficult to quantify manually. The attributes are organized in ten categories within the software: Basic Measurement, Fruit Shape Index, Blockiness, Homogeneity, Proximal Fruit End Shape, Distal Fruit End Shape, Asymmetry, Internal Eccentricity, Latitudinal Section and Morphometrics. The last category requires neither prior knowledge nor predetermined notions of the shape attributes, so morphometric analysis offers an unbiased option that may be better adapted to high-throughput analyses than attribute analysis. TA also offers the Color Test application that was designed to collect color measurements from scanned images and allow scanning devices to be calibrated using color standards3. 
TA provides several options to export and analyze shape attribute, morphometric, and color data. The data may be exported to an excel file in batch mode (more than 100 images at one time) or exported as individual images. The user can choose between output that displays the average for each attribute for the objects in each image (including standard deviation), or an output that displays the attribute values for each object on the image. TA has been a valuable and effective tool for indentifying and confirming tomato fruit shape Quantitative Trait Loci (QTL), as well as performing in-depth analyses of the effect of key fruit shape genes on plant morphology. Also, TA can be used to objectively classify fruit into various shape categories. Lastly, fruit shape and color traits in other plant species as well as other plant organs such as leaves and seeds can be evaluated with TA.

Tomato Analyzer (TA) quantifies attributes of two dimensional shapes and color in a reproducible and accurate manner. A step-by-step procedure for obtaining high quality digitalized images of tomato fruit, morphological and color analyses of these images and several applications using the data generated through this software are described.

Analyzer עגבניות: יישום תוכנה שימושיים כדי לאסוף נתונים מורפולוגיים Colorimetric מדויק ומפורט של דו ממדיים

Measuring fruit morphology and color traits of vegetable and fruit crops in an objective and reproducible way is important for detailed phenotypic ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

מדריך מקטעים, קורינג ועיבוד תמונה לרכש וניתוח מדגם עצם קליפת המוח בעל תפוקה גבוהה עבור מיקרו-CT של Synchrotron

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental inputs into stress tolerance, pathogenicity, and other key components of fitness. This manuscript describes a microscope-based assay that tracks approximately 105&#160;Saccharomyces cerevisiae microcolonies per experiment. After automated time-lapse imaging of yeast immobilized in a multiwell plate, microcolony growth rates are easily analyzed with custom image-analysis software. For each microcolony, expression and localization of fluorescent proteins and survival of acute stress can also be monitored. This assay allows precise estimation of strains&#39; average growth rates, as well as comprehensive measurement of heterogeneity in growth, gene expression, and stress tolerance within clonal populations.

Yeast growth phenotypes are precisely measured through highly parallel time-lapse imaging of immobilized cells growing into microcolonies. Simultaneously, stress tolerance, protein expression, and protein localization can be monitored, generating integrated datasets to study how environmental and genetic differences, as well as gene-expression heterogeneity among isogenic cells, modulate growth.

הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...