המעבדה שלי מתמחה במידול גידולים תלת ותלת מימדיים. מודלים ספרואידים סרטניים נמצאים בשימוש נרחב לאורך ביולוגיה וגילוי תרופות. עם זאת, הפרוטוקולים הקיימים לאיסוף נתונים מניסויים אלה הם יקרים, קשים ומוגבלים.
פרוטוקול זה דורש כימיקלים וציוד נגישים בקלות, ואינו עתיר עבודה רבה בהשוואה לשיטות הנוכחיות המספקות תוצאות דומות. פרוטוקול זה פותח כדי להיות קל יחסית ליישום למתחילים וחזק עד טעויות קטנות, שכן רבים מהצעדים הפיכים. התחילו במשקל של 0.5 גרם של אגרוז שנמס נמוך בבקבוק זכוכית.
ולהוסיף 25 מיליליטר של PBS. ממיסים את האגרוז על ידי הרתחת התמיסה במיקרוגל למשך 30 עד 60 שניות כשהמכסה סגור, ומערבולת מתמדת. שוקלים תשעה גרם של N, N, N'N'Tetrakis (2-הידרוקסיפרופיל) אתילנדיאמין, 22 גרם אוריאה, 44 גרם סוכרוז, 0.1 גרם של טריטון X-100, ו 24.9 גרם של מים deionized.
מחממים את התמיסה באמבט מים של 56 מעלות צלזיוס עם ערבוב קבוע. לאחר שהגבישים מומסים, הניחו את התמיסה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לבועות הנוצרות במהלך הערבוב, לעלות אל פני השטח. צור ספרואידים באמצעות שיטת שכבת-העל של אגרוז המתוארת בכתב היד של הטקסט.
חותכים את הקצה של קצה פיפטה של מיליליטר אחד באמצעות אזמל כדי להגדיל את הפתח. באמצעות הפיפטה, לשאוף את spheroids מן הבארות ולהעביר אותם צינור חרוטי שקוף 1.5 מיליליטר. ניתן לשלב מספר ספרואידים מאותם תנאים באותה צינור.
שטפו את הספרואידים פעמיים במיליליטר אחד של PBS, ולאחר מכן הוסיפו תמיסת פרפורמלדהיד ניטרלית של 4% שחוממה מראש והדגירה של הספרואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות, להסיר את הפתרון paraformaldehyde ולשטוף את spheroids פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן עבור מכתים, להעביר עד 15 spheroids לתוך צינור PCR 200 microliter, באמצעות פיפטה.
חלחלו לתאים באמצעות 200 מיקרוליטרים של 0.5% טריטון X-100 ב-PBS. מניחים את צינורות ה-PCR בתוך 50 מיליליטר, מברגים את צינורות המכסה ומכסים את הצינור ברדיד אלומיניום ודוגרים את הספרואידים בטמפרטורת החדר בתסיסה קלה. לאחר שעתיים, החלף את התמיסה ב-200 מיקרוליטרים של חיץ דילול נוגדנים ודגירה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
למחרת, הסר את חיץ דילול הנוגדנים לפני הוספת 75 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני ודגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים וחצי. לאחר הדגירה, הסר את הסופרנטנט ושטוף את הספרואידים פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של PBS, המכילים 0.1% טווין ו-0.1% טריטון X-100 או PBS-TT. לאחר מכן דגרו עם 200 מיקרוליטרים של PBS-TT במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להסיר PBS-TT לפני הוספת 100 microliters של הנוגדן המשני דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים וחצי. לאחר הדגירה, הסר את supernatant ולשטוף פעמיים עם PBS-TT, לפני דגירה עם 200 microliters של PBS-TT במשך ארבע שעות. להרכבה, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר, העבר ספרואידים קבועים ומוכתמים לצינורות PCR של 500 מיקרוליטר, בצינור אחד לכל מצב.
החלף את התמיסה ב-200 מיקרוליטרים של 2% ג'ל אגרוז נוזלי, וצנטריפוגה בסיבוב המהיר, במהירות המרבית הקבועה, בטמפרטורת החדר, למשך 30 שניות. שאפו את הספרואידים ב-50 מיקרוליטרים של ג'ל אגרוז נוזלי ופזרו בבאר של צלחת תחתית מזכוכית בת 24 בארות. לפני שהג'ל מתקשה, הפרידו את הספרואידים באמצעות קצה פיפטה בג'ל שמסביב, וודאו שהספרואידים מכוסים בג'ל.
לאחר מכן, טבלו את הג'ל על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של תמיסת ניקוי לכל באר, ודגרה בטמפרטורת החדר, בחושך, במשך 24 שעות לפני ההדמיה. לצורך הדמיה, בחר מטרה עם מרחק עבודה ארוך מספיק כדי להקיף את כל הספרואיד, כולל גובה ההרכבה של הספרואיד בכלי השיט. כדי לזהות את מישור קו המשווה, כוונן את המיקוד עד שתגיע לשטח הפנים הגדול ביותר במישור XY, ותמונה עם אחוז עוצמת הלייזר הנדרש, מתח הגלאי, הרווח והגדרות ההיסט.
עבור תמונות תלת-ממדיות, הגדר את ההתחלה והסוף של הספרואידים ובחר את עוצמת האות המתאימה בעומקי Z שונים, באמצעות הגדרות תיקון עוצמת Z. מחקר זה מראה השוואה של ספרואידים מלנומה אנושית של FUCCI מנוקים ולא ברורים, בהשוואה לספרואידים רכובים על PBS. פתרון הסליקה מספק תמונות בהירות גבוהות עם עיוות גודל מינימלי.
פתרון הניקוי מאפשר גם הדמיה ברזולוציה גבוהה של פרטים ברמת התא עמוק יותר לתוך הספרואידים ללא חתך היסטולוגי. בעזרת תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות, ניתן לקבל פרטים ברמת התא בעומק של 200 מיקרון. יתר על כן, מוצגת השוואה בין ספרואיד חור מוכתם ומנוקה, מוכתם עבור pimonidazole ו p27kip1, מוצג.
צביעת Pimonidazole מראה את האזור ההיפוקסי של הספרואיד, וכתם p27kip1, מסמן מעצר מחזור תא וכתם גרעיני DAPI. חדירה עמוקה יותר ופחות פיזור, מאפשרים ייצוג משופר של מבנה ספרואידי תלת-ממדי עם אובדן אור מינימלי. העיבוד התלת-ממדי של הספרואידים של FUCCI, המוכתמים ב-DRAQ7, מוצג.
לפתרון ניקוי יש השפעה מינימלית על גודל הספרואידים. קוטר הספרואיד הוגדר על סמך כדור בעל שטח חתך זהה לזה של הספרואיד. הספרואידים נצפו גדלים מעט בגודלם במהלך שש השעות הראשונות, כפי שצוין על ידי שינוי קיפול בקוטר של בין 2% ל -6% לעומת זאת, לאחר 24 עד 72 שעות, הספרואידים חזרו לגודל השווה בערך לגודל המתאים בקיבוע PBS לאחר פרפורמלדהיד.
חשוב להמתין לפחות 24 שעות לפני ההדמיה, כדי לתת לתמיסת הניקוי שיווי משקל עם הספרואידים והג'ל. פרוטוקול זה מאפשר למתרגלים לאסוף במהירות נתונים ממספר רב של ספרואידים, ומאפשר ניתוח מתמטי וסטטיסטי כמותי מפורט המספק תובנות מפורטות על הביולוגיה.
