אנו מודים לד&quot;ר דיאן Baronas-ואל לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי Charles E. מידט מכללת FAU של גרנט זרע המדע ומלגות מהזדקנות הרפואית אליסון הקרן לKJ

1. צלחות XLD (קסילוז יזין Desoxycholate) אגר אגר XLD הוא מדיום גידול סלקטיבי לסלמונלה, שמופיע כמושבות שחורות על צלחות אגר XLD. עם זאת, אם אין חשש לזיהום, ניתן להחליף צלחת LB רגילה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את אגר XLD 5.5 g ו resuspend ב 5 מיליליטר מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב עד שכל אגר הוא רטוב. הוספת 95 מיליליטר מים deionized עד שכל הגושים נעלמים והבינוני הוא resuspended לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את המדיום כדי להמס לחלוטין (לא חיטוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב הבינוני בטמפרטורת חדר כדי 50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 25 אגר מיליליטר בכל 95 x 15 מ&quot;מ צלחת (גובה x קוטר) (צלחות חתומות עם Parafilm יכולות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1). </li></ol> 2. צמיחה נמטודות בינוני (NGM) RNAi האכלת צלחות הכנת ג צלחות elegans NGM כבר תוארו בעבר 1<html> 9. הנה הליך מתואר בקצרה להוסיף אמפיצילין האנטיביוטיקה ואיזופרופיל inducer הכימי RNAi β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתקשורת NGM לעשות צלחות האכלת RNAi. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 3 גרם NaCl ו2.5 peptone גרם Bacto בליטר המים deionized 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 17 אגר Bacto גרם לכלי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי התקשורת 45 דקות ולקרר את התקשורת ל50 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הפתרונות הבאים: כולסטרול מיליליטר 1 (5 מ&quot;ג / מיליליטר ב95% אתנול), 1 מיליליטר 1 M CaCl 2, 1 מיליליטר 1 M MgSO 4, ו25 מיליליטר 1 M חיץ אשלגן זרחה (pH 6.0). מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר 1 M IPTG ו500 אמפיצילין μl (100 מ&quot;ג / מיליליטר במים סטריליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון טוב ויוצקים לתוך 60 x 15 מ&quot;מ (גובה x קוטר) צלחות פטרי באמצעות סיוע Pipet ו25 מיליליטר פיפטה סרולוגיות בעקבות הליכי סטרילי. ממלא כל צלחת עם אגר מיליליטר 12. ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. </li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 3. הכן את בעלי חיים שטופלו RNAi לזיהום גן autophagy החיוני BEC-1 משמש כדוגמא כדי לבחון את תפקודו של גן מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה. הפרוצדורות הן באיור 1 ולוח 1. הפרוטוקול להכנת חיות שטופלו ב-RNAi לזיהום הבא, עם היום של כל שלב ניסיוני שניתן בסוגריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן האכלת RNAi BEC-1 ובקרת וקטור הריק L4440 RNAi האכלת חיידקים על ידי הצבת פתית של -80 חיידקים קפואים מעלות צלזיוס ל -2 מיליליטר מדיום LB בתוספת 100 מ&quot;ג / מיליליטר אמפיצילין (יום 1). חזור על פעולה זו פעם בשבוע במהלך כל הניסוי יש חיידקי RNAi טריים. אחסן את התרבות במקרר 4 ° C, כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים של תרבות חיידקי RNAi לילה 100 מיליליטר על צלחות RNAi. הכן שלושה RNAi BEC-1 ושלוש השליטה v הריקEctor צלחות RNAi. דגירה הצלחות ב 37 ° C במשך לילה (יום 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחות RNAi מ37 מעלות צלזיוס החממה ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת חדר על הספסל. תרים הרמפרודיטים N2 סוג בר L4 ייזונו היטב, ולהעביר אותם ל-BEC 1 RNAi ולשלוט צלחות RNAi וקטור ריקות. הנח שלושה תולעים לכל צלחת, על צלחות בשלושה עותקים. באותו היום, להכין צלחות RNAi כמתואר בשלב 3.2 (יום 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות RNAi עם תולעים בחממת 20 מעלות צלזיוס במשך 36-40 תולעי שעה ומעביר לצלחות RNAi מקבילה טריות מוכנות בשלב 3.3. אחרי התולעים מועברים, דגירה הצלחות בחממת C ° 20 ל64 שעה (יום 4). </li></ol> 4. הכן סלמונלה לזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סלמונלה Streak -80 ° C מניות קפוא על צלחת אגר XLD 1 ו דגירה את הצלחת על 37 ° C במשך הלילה (יום 5 </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה סלמונלה השחורה מבודדת היטב ולחסן אותו בכ -2 מיליליטר מדיום LB על 37 מעלות צלזיוס עם רעד הלילה (יום 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות לילה זרע 80 מיליליטר סלמונלה על 1 ג elegans 60 x 15 מ&quot;מ (גובה x קוטר) צלחת אגר NGM ולהכין 6 צלחות בסך הכל. דגירה הצלחות בטמפרטורת חדר למשך 6 שעות. תרבות החיידקים צריכה להתייבש ויוצרת דשא על הצלחת (יום 7). </li></ol> 5. תולעים שטופלו ב-RNAi להדביק עם סלמונלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את BEC-1 ולשלוט הרמפרודיטים ריקים וקטור טופלו RNAi L4 N2 (צאצאים של תולעים שהוקמו בשלב 3) לצלחות סלמונלה שטופלה RNAi. הנח 40 תולעים לכל צלחת על 3 צלחות עבור כל קבוצה. דגירה צלחות התולעת ב20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (יום 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הסט אחד של צלחות RNAi טריות כמתואר בשלבי 3.1 ו3.2 (יום 7 ו <strong&gt; יום 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 זיהום שעה, להעביר תולעים הנגועים בסלמונלה לצלחות RNAi המתאימות מוכנות בשלב 5.2 ולדגור על 20 ° C (יום 9). </li></ol> 6. הישרדות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון ההישרדות של תולעים יומיים ולהעביר את תולעים לצלחות RNAi מתאימים טריות בתקופת הטלת הביצים. להכין סט של צלחות RNAi טריות לפני כל העברת תולעת כמתואר בשלבי 3.1 ו3.2. לגעת בגוף התולעת (הראש, חלק וזנב באמצע) בעדינות עם חוט פלטינה שיטח סוף. תולעת הוא הבקיע כמת אם לא תנועה של גוף התולעת הוא ציינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון ההישרדות של תולעים ביום או בכל יום אחר, ולהעביר את תולעים לצלחות RNAi מתאימים טריות פעמיים בשבוע אחרי התולעים יפסיקו להטיל ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל התולעים למות, בריכת נתוני הישרדות מצלחות בשלושה עותקים כסט נתונים אחד. קלט נתוני ההישרדות של כל קבוצה לתוך תוכנה סטטיסטית מתאימה כגון GraphPad Prism ליצור עקומות הישרדות ולבצע ניתוח הישרדות Kaplan-Meier. כל הניסוי חוזר על עצמו לפחות פעם אחת כדי לאשר את המסקנה. </li></ol>

<ol>
	<li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , (1997).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+host+for+the+study+of+host-pathogen+interactions.">Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).</li><li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+genetic+model+for+the+study+of+innate+immunity.">Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity.</a> Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).</li><li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions.">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).</li><li>Ford, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+descriptive+study+of+human+Salmonella+serotype+typhimurium+infections+reported+in+Ontario+from+1990+to+1997.">A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997.</a> Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).</li><li>Voetsch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoodNet+estimate+of+the+burden+of+illness+caused+by+nontyphoidal+Salmonella+infections+in+the+United+States.">FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States.</a> Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).</li><li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans.">Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li><li>Alegado, R. A., Tan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antimicrobial+peptides+contributes+to+persistence+of+Salmonella+typhimurium+in+the+C.+elegans+intestine.">Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine.</a> Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).</li><li>Jia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+genes+protect+against+Salmonella+typhimurium+infection+and+mediate+insulin+signaling-regulated+pathogen+resistance.">Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).</li><li>Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans-based+screen+identifies+Salmonella+virulence+factors+required+for+conserved+host-pathogen+interactions.">Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions.</a> Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole.">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2, 1-10 (2001).</li><li>Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA-mediated+interference+feeding+strategy+to+screen+for+genes+involved+in+body+size+regulation+in+the+nematode+C+elegans.">Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li><li>Fraser, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+mediated+by+ced-3+and+ced-4+protects+Caenorhabditis+elegans+from+Salmonella+typhimurium-mediated+killing.">Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).</li><li>Melendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+genes+are+essential+for+dauer+development+and+lifespan+extension+in+C.+elegans.">Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans.</a> Science. 301, 1387-1391 (2003).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל גנטי פשוט שאוכלת חיידקים כמקור התזונתי שלה. לפיכך, קל להחליף החיידקים שבמזון הרגיל שלו עם הפתוגן מעיים כדי לחקור את יחסי הגומלין בין ג elegans ופתוגן שנבחר. במסמך פרוטוקול מתואר לשלב זיהום סלמונלה ו-C elegans RNAi האכלת טיפול כדי לבחון ...

נמטודות הקרקע המתגוררות ללא Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מודל פשוט וגנטי צייתן שימוש ללמוד הרבה שאלות ביולוגיות. ג elegans דומיננטי קיים כהרמפרודיטים דישון עצמיים. זכרים שנוצרו באופן ספונטני על ידי אי - חוסר התאמה של כרומוזום X במהלך 1,2 gametogenesis. בנוכחותו של מזון בשפע, ג elegans לפתח ברציפות בארבעה שלבי זחל למבוגרים. טמפרטורה גם משפיעה ג פיתוח elegans; פיתוח מהיר יותר היא נצפתה בטמפרטורות גבוהות יותר. במעבדה, ג elegans הוא תרבית בטמפרטורה סטנדרטית של C ° 20 על צלחות אגר עם coli Escherichia זרע החיידק (זן OP50) כמזון 1,2. בעשור האחרון, ג elegans התפתחה האורגניזם חסר חוליות ללמוד אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן 3-5. בטבע, ג elegans אוכל חיידקים כnutrien1,2 המקור לא. האוכל שלה נורמלי חיידקים במעבדה, OP50, ניתן להחליף בקלות עם פתוגנים אחרים כדי לבחון את יחסי הגומלין בין ג elegans וכל פתוגן שנבחר. בתנאים אלה, המעי הוא האתר העיקרי של הזיהום. אכן, מגוון רחב של חיידקים פתוגנים הוכח להדביק קטלני ג elegans 3-5. סלמונלה חיידק גראם שלילי היא הפתוגן במערכת העיכול שגורם למחלות שמקורן במזון לבני אדם ברחבי העולם 6,7. ג elegans הוא מארח מודל טוב לסלמונלה typhimurium כחיידק הזה משכפל ותערוכות דלקות מעיים מתמשכות 8-10. ג elegans נעשה שימוש כדי לזהות גם רומן וארסיות סלמונלה ידועה קודם לכן גורמי 11. מעניין לציין, כי ג מערכת חיסונית elegans מגבילה הצלחת שכפול סלמונלה. זה כבר דווח בעבר כי inhibition של גנים autophagy הופך שכפול סלמונלה מוגבר בג elegans, וכתוצאה מכך למוות המוקדם של תולעים נגועים 10. Macroautophagy (המכונה במסמך זה כלautophagy) הוא תהליך דינמי הכולל ארגון מחדש של קרומי subcellular לעקל ציטופלסמה ואברונים למסירה הליזוזום לפירוק 12. Autophagy דווח להגביל את שכפול סלמונלה בג elegans ואצל יונקי 10,13. ג הגנום elegans היה הגנום תאיים אוקריוטים הראשון רצף; הוא מגיב לטיפול RNAi 14-16. יתר על כן, יכול להיות מנוהל ביעילות על ידי חשיפת RNAi תולעים לבלוע חיידקים המכילים פעמיים תקועים RNA של גן המטרה, המכונה RNAi האכלת 16,17. ספריות האכלת הגנום כולו RNAi כבר נוצרו עבור RNAi הגנום הקרנת 16,18. בזאת, הפרו זיהום סלמונלהtocol בשילוב עם RNAi האכלה כדי לאפשר ג הבדיקה גנים elegans של עניין ביכולתם על מנת להגן מפני זיהום סלמונלה.

<table><tbody><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD agar</td><td>EMD Chemicals</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella typhimurium&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 95 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 x 15 mm&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Serological pipet</td><td>Fisher</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Express Pipet-Aid</td><td>Fisher</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 shaking incubator&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol to infect caenorhabditis elegans with salmonella typhimurium

בעשור האחרון, ג elegans התפתחה האורגניזם חסר חוליות ללמוד אינטראקציות בין מארחים ופתוגנים, כולל ההגנה המארחת נגד סלמונלה typhimurium חיידק גראם שלילי. סלמונלה קובעת זיהום מתמשך במעי של ג elegans ותוצאות במוות המוקדם של בעלי חיים נגועים. מספר מנגנוני חסינות זוהה בג elegans כדי להתגונן מפני זיהומי סלמונלה. Autophagy, מסלול השפלה lysosomal אבולוציונית שימור, הוכח להגביל את שכפול סלמונלה בג elegans וביונקים. הנה, בפרוטוקול מתואר להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה, שבו התולעים נחשפים לסלמונלה לזמן מוגבל, בדומה לזיהום סלמונלה בבני אדם. זיהום סלמונלה מקצר את תוחלת החיים של ג באופן משמעותי elegans &lt;/ Em&gt;. שימוש בגן autophagy החיוני BEC-1 כדוגמא, אנחנו בשילוב שיטת זיהום זה עם ג elegans RNAi האכלת גישה והראה פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את תפקידו של ג גנים מארח elegans בהגנה מפני זיהום סלמונלה. מאז ג elegans ספריות RNAi הגנום כולו זמינות, פרוטוקול זה מאפשר למסך באופן מקיף לג גנים elegans כי להגן מפני סלמונלה ופתוגנים מעיים אחרים באמצעות ספריות RNAi הגנום כולו.

ב 20 ° C, תוחלת החיים הממוצעת של תולעי N2 סוג בר היא 17 ימים (איור 2 א וטבלה 2). זיהום סלמונלה מקטין באופן משמעותי את תוחלת החיים הממוצעת של תולעי N2 ל10.5 ימים (p = 0.0002, בדיקת יומן דרגה) (איור 2A ). אם ג גן elegans ממל...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium at JoVE.com

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

סי אלגנס התפתחה כמודל גנטי חדש כדי לחקור אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה בשילוב עם טכניקת התערבות RNAi גדיל פעמיים כדי לבחון את התפקיד של גנים מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה.

פרוטוקול להדביק<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; עם<em&gt; Typhimurium סלמונלה</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

a-protocol-to-infect-caenorhabditis-elegans-with-salmonella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

11.5K Views.  Florida Atlantic University.  סי אלגנס התפתחה כמודל גנטי חדש כדי לחקור אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה בשילוב עם טכניקת התערבות RNAi גדיל פעמיים כדי לבחון את התפקיד של גנים מארח בהגנה מפני זיהום סלמונ...

Video: A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genetics

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

באמצעות את Protozoan סנדלית caudatum כמו רכב עבור זיהומים שמקורם במזון הזחלים דג זברה

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Biology

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

פרוטוקול להדביק

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video