פיברוזיס רקמה היא הדרך העיקרית כי איברים להיכשל לאורך זמן, בתגובה דלקת כרונית או הזדקנות. ולמעשה, אני טוען שאם לא תמות מסוכן זיהומיות או מסרטן, סביר להניח שתמות מביברוזיס איברים ככל שתזדקן. למרבה הצער, אין הרבה מודלים עכבר גדול לחקות פיברוזיס רקמה אנושית.
אז מה שפיתחנו הוא מודל עכבר של מחלת קרוהן, זו מחלה בבני אדם שגורמת לפיברוזיס של המעיים והיא במידה רבה בלתי ניתנת לזיהוי. למעשה, הדרך היחידה שאתה יכול לטפל בו היא באמצעות הסרה כירורגית של הרקמה הפיברוטית ו קשירה מחדש של המעיים. היתרון של המודל שלנו הוא שהוא חודר באופן מלא בכל זני העכברים והוא מחקה מקרוב את מחלת הקרוהן האנושית והפיברוזיס נמשך יותר מחודש, שהוא באמת מודל חזק.
החלק המאתגר ביותר של הליך זה הוא הטיפול בעכברים ובמיוחד gavage אוראלי שכן זה דורש הרבה תרגול הסמכה מיוחדת. בעת ביצוע הליך זה בפעם הראשונה, יש להיות מודעים לכך שעבודה עם סלמונלה דורשת אמצעי זהירות נאותים וטכניקה סטרילית. סילוק פסולת וחיידקים צריך להיות מתוכנן לפני הניסוי.
ההדגמה החזותית של הליך זה חשובה מאוד משום שהיא כרוכה בטיפול בסלמונלה הדורשת אמצעי זהירות מיוחדים כמו גם טכניקה סטרילית נכונה. כדי להתחיל בהליך זה, להגדיר צלחת עם אגר LB המכיל סטרפטומיצין בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר. באמצעות לולאת תוסנה סטרילית, פס הצלחת עם מלאי גליצרול קפוא של חץ דלתא S טיפימוריום a.
דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לוחות פס ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. יום אחד לפני ההדבקה, להמיס 0.5 גרם של סטרפטומיצין ב 2.5 מיליליטר של מים כדי להכין את האנטיביוטיקה.
מסנן לעקר את הפתרון סטרפטומיצין. לאחר מכן, השתמש במחט gavage 22 מד הנורה עם מזרק מיליליטר אחד כדי gavage דרך הפה את העכברים עם 100 microliters של פתרון סטרפטומיצין. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של מרק LB המכיל סטרפטומיצין בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר לצינור תרבות.
באמצעות לולאת חיסון, לחסן את מרק LB עם מושבה אחת. הדגירה את התרבות באופן אירובי לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 200 סל"ד. ביום של זיהום, לבצע שני רצופים אחד עד 10 דילול של תרבויות סלמונלה לילה עם PBS סטרילי להכין את מינון הזיהום הסופי.
התוצאה היא אינקולום של 100 מיקרוליטר המכיל כשלושה מיליון יחידות יוצרות מושבה. לאחר מכן, השתמש במחט gavage 22 מד הנורה עם מזרק מיליליטר כדי gavage כל עכבר עם 100 microliters של סלמונלה מוכן. ראשית, להגדיר שני מיליליטר בטוח לנעול צינורות תחתון עגול, להוסיף מיליליטר אחד של PBS סטרילי וחרוז נירוסטה autoclaved לכל צינור.
יש לשקול מראש את הצינורות לפני איסוף הרקמות. לאחר המתת דם של עכברים, צמצם את רקמות הססנון והטחול שלהם, ודאג לאסוף רקמות מבעלי חיים בודדים לצינורות נפרדים. לשקול כל צינור כדי לקבוע את משקולות הרקמה.
השתמש במנגנוני טחנת מיקסר כדי הומוגניזציה של הרקמות ב 30 הרץ במשך 15 דקות. לאחר מכן, להעביר 900 microliters של PBS לתוך כל באר של 96-well שני מיליליטר מגה בלוק. פיפטה 100 microliters של רקמות homogenates לתוך הטוב הראשון, ומערבבים היטב.
בצע דילול סדרתי על ידי הוספת 100 microliters ל בארות הבאות, עד 10 כדי דילול השישי שלילי מתקבל. צלחת 10 מיקרוליטרים של כל דילול ב triplicates על אגר LB המכיל סטרפטומיצין. לאחר מכן, לספור את המושבה הממוצעת להרכיב יחידות ולקבוע את המושבה להרכיב יחידות לכל גרם של רקמה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
פתח את פיג'י, שהיא תוכנת דימות בקוד פתוח וגרור ושחרר את קובץ התמונה tif על סרגל הכלים. שורת התפריטים, בחרו 'תמונה', 'כתב', 'מחסנית RGB' כדי לפצל את התמונה לערוצים אדומים, ירוקים וכחולים. החלק את הפס האופקי בתחתית החלונית כדי להגדיר את הערוץ לירוק.
פתחו את הכלי תמונה, כוונון, סף. התאם מגבלות מינימליות ומקסימום כדי למנוע אותות רקע. לאחר הגדרת הסף הרצוי, סגור את כלי הסף ולעבור אל נתח, הגדר מידות, סמן את שטח, שבר שטח, הגבל לסף ותווית תצוגה.
קבל את בחירת הרקמות באמצעות הכלי בחירות ביד חופשית או מצולע ולמדוד את האזור אחוז חיובי עבור קולגן על ידי לחיצה על נתח, מדידה. לאחר מכן, לנרמל את האזור המוחלט חיובי עבור כתמי קולגן לאזור הרקמה. טיפול סטרפטומיצין ואחריו זיהום אוראלי עם חץ דלתא טיפימוריום S מוביל דלקת מעיים חזקה פיברוזיס, במיוחד ב cecum.
נטל פתוגן טיפוסי של 100 מיליון עד מיליארד יחידות להרכיב מושבה ניתן לשחזר לכל גרם של cecum מבעלי חיים נגועים, בעוד 10,000 יחידות להרכיב מושבה בדרך כלל ניתן לשחזר לכל גרם של טחול. הערכה של פיברוזיס בסעיפים cecal מוכתם אדום picrosirius מציין פיברוזיס שיא 21 ימים לאחר ההדבקה, בעוד רוב הפתולוגיה נפתרת על ידי יום 42 לאחר ההדבקה. הכנה יסודית של חומרים היא חיונית כמו ניסוי זה דורש מספר ימים כדי להגדיר.
הכנת צלחות LB וסלמונלה וסטרפטומיצין צריך להיעשות כל באופן בלתי מתאים. לפני הניסוי, ודא כי הניסוי מכיר את פרוטוקול בעלי החיים, כמו גם מפגעי בטיחות. לאחר הערכת נטל הקולגן, הנסיינית עשויה לבחור לבצע בדיקות ביולוגיות אחרות, כגון רצף RNA להערכת פרופילי ביטוי גנים או ציטומטריית זרימה כדי להעריך תת-קבוצות של תאי חיסון או ELISA של רקמות כדי להעריך פרופילי ציטוקינים.
אז המודל שלנו טוב במיוחד בחיקוי מחלה אנושית הנקראת מחלת קרוהן שבה אתה מקבל פיברוזיס של המעיים, שהוא במידה רבה בלתי ניתן לטיפול והדרך היחידה שאתה יכול לטפל בו היא להסיר חלק מהמעיים ולתפור אותו בחזרה יחד ולקוות שזה לא יחזור. המודל שלנו חזק מאוד וכבר הראינו כי מיקוד תאים לימפואידיים innate סוג שלוש, גורם שעתוק הנקרא אלפא גלם, או interleukin 17 ameliorates המחלה ומונע את פיברוזיס. המודל שלנו טוב במיוחד בזיהוי הגורמים לשחק בפתוגנזה של מחלת קרוהן ופיברוזיס במעיים ואנחנו כבר בדרך לזיהוי מספר מטרות שניתן לטפל בהם טיפולית כדי להקל על מחלות מעי דלקתיות.
המודל שלנו כבר נכנס לאותה גישה ILC3 או אלפא NIL17 עשוי להיות במשחק במחלה פיברוטית אחרת ואלה כוללים דברים כמו פסוריאזיס, טרשת נפוצה, פיברוזיס ריאתי אידיופטית. אז זה אפשרי כי מיקוד אותם גורמים עשוי להקל על פיברוזיס במחלות אלה גם כן. למרות שזרם הסלמונלה המוטנטי אינו ארסי, חשוב לפעול בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות הביו-האזרדים הסטנדרטיים שניתנו על ידי המתקן.
כמו כן, מאז אדי פורמלדהיד ידועים להיות מסרטנים, חשוב לעבוד מאחורי מכסה המנוע אדים במהלך שלב הקיבוע.
