The authors thank members of the Renee Reijo Pera laboratory for help during development of this protocol and during preparation of this manuscript. This work is supported by California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) shared laboratory (CL-00518).

.1 הכנת תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פיברובלסטים עובריים בינוני עכבר (MEF) על ידי שילוב הבא: 445 מ&quot;ל DMEM, פתרון מניות 5 מ&quot;ל 100x פניצילין / אמפיצילין 50 מ&quot;ל סרום שור העובר (FBS), ו. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות hPSC על ידי שילוב הבא סרום המכיל: 385 מ&quot;ל / F12, 5 מ&quot;ל 100x פתרון פתרון מניות חומצת אמינו, 5 מ&quot;ל 100x פניצילין / מניית אמפיצילין, 5 מ&quot;ל 100x החלפת סרום נוקאאוט 100 מ&quot;ל (KSR), DMEM שאינו חיוני -mercaptoethanol פתרון מניות, ו10 ng / ml bFGF. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום סרום ללא mTeSR1 על ידי שילוב הבא: 400 בינוני מ&quot;ל mTeSR1 בסיסי, 100 מ&quot;ל 5x תוספת, ו5 מ&quot;ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות IV 10x collagenase: לשקול את כוח IV collagenase 0.5 גרם, ולפזר אותו עם 50 מ&quot;ל DMEM / F12 ולעקר מסנן. הפוך aliquots ומלאת אותם ב-20 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1% פתרון ג&#39;לטין: לשקול את 0.5 ג&#39;לטין g (מעור שור, מהסוג B) כוח ולפזר אותו במים ללא יונים. שמור פתרון מעוקר החיטוי בטמפרטורת חדר למשך שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום בידול KSR ידי שילוב הבא: 410 מ&quot;ל DMEM, 75 מ&quot;ל KSR, 5 מ&quot;ל 100x פתרון שאינו חיוני מניית חומצת אמינו, 5 מ&quot;ל 100x פניצילין / פתרון מניות אמפיצילין, 5 מ&quot;ל 100X -mercaptoethanol פתרון מניות. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים. הערה: KSR משתנה ממגרש למגרש, אשר עשוי להשפיע על יעילות הבידול. לכן זה טוב יותר כדי לבחון כמה קבוצות של KSR למצוא את הטוב ביותר עבור בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום בידול N2 על ידי שילוב הבא: 98 מ&quot;ל DMEM, תוספת 1 מ&quot;ל 100x N2 ו1 מ&quot;ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4° C עבור לא יותר מ 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום בידול B27 על ידי שילוב הבא: בינוני neurobasal 480 מ&quot;ל, 10 מ&quot;ל 50x B27 תוספת, 5 מ&quot;ל 100X GlutaMAX פתרון מניות, ו5 מ&quot;ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים. </li></ol> 2 תרבות של hESCs וhiPSCs על תאי מזין MEF HESCs H9 התקבל מWiCell מכון המחקר וhiPSCs הוקמו במעבדה Reijo Pera דרך התמרה בתיווך רטרווירוס של יאמאנאקה גורמי OCT3 / 4, Sox2, KLF4, וג-MYC 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות יום אחד לפני מעבר תא, להכין כמה צלחות ג&#39;לטין על ידי הוספת ג&#39;לטין 1 מ&quot;ל 0.1% לגם 1 של 6 גם צלחות, ודגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות לפחות 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, ג&#39;לטין לשאוב מצלחות, וזרע הקרנה מומת תאי MEF לצלחות בצפיפות של 1.6 x 10 5 תאים/ גם במדיום MEF באמצעות hemocytometer לספור את התאים. הערה: לחלופין להכין מתקני האכלת MEF מוקדם ככל 3 ימים לפני מעבר תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר יום אחד לאחר ציפוי ניזונים MEF: בינוני לשאוב מhPSCs, להוסיף 1 מ&quot;ג / IV collagenase מ&quot;ל לתאים במ&quot;ל 1 / טוב, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך דגירה זה, לשטוף את מתקני האכלת MEF פעם עם PBS, ולאחר מכן להוסיף בינוני חם (37 ° C) המכיל סרום hPSC תרבות ב1.5 מ&quot;ל / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, הקש על צלחת התרבות כמה פעמים, כך שרוב המושבות לא עברו התמיינות תנתק מהצלחות, ואילו המושבות מובחנות להישאר מחובר. לאסוף בזהירות את המושבות הצפות, ולהעביר אותם לתוך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את הצלחת פעם אחת עם חם (37 ° C) DMEM / F12 ולהעביר DMEM / F12 לתוך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב179 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב מהצינורות, נזהר שלא להפריע את הכדור. הוספת מלחמהמדיום התרבות מ &#39;hPSC, פיפטה התאים מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור אותם בצבירים קטנים ומערבבים אותם היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התאים על גבי מתקני האכלת MEF חדשים ב1: 3-1: 6 יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום כל יום והמעבר התאים כל 5-6 ימים. </li></ol> .3 הכנת התאים לדיפרנציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום אחד לפחות לפני ההכנה של תאים, להכין כמה צלחות Matrigel (3 בארות בדרך הכלל של צלחת 6 היטב). לדלל את Matrigel עם קר (4 ° C) DMEM / F12 ב1:40 ולהוסיף 1 מ&quot;ל Matrigel לכל טוב של 6 גם צלחות. דגירה צלחות Matrigel בלילה 4 ° C.. הערה: אפשר לאטום צלחות Matrigel עם Parafilm ומלאה אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל אחד בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתאים (ראה שלב 2) 4 ימים לאחר המעבר. הסר את כל המושבות מובחנות מהצלחות. בינוניים לשאוב מצלחת התרבות, להוסיף 1 מ&quot;ל Accutase לכל טוב, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין כמה ג&#39;לatin צלחות על ידי הוספת 1 מ&quot;ל ג&#39;לטין ל1 גם של 6 גם צלחות. הנח צלחות אלה וMatrigel-הצלחות שהוכנו יום לפני בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של 5 דק &#39;, או כאשר תאים הפכו חצי צף, תאי פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להפוך אותם לתאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים בודדים לתוך 15 צינורות מ&quot;ל, ו צנטריפוגות ב XG 258 במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend עם כמות מתאימה של סרום המכיל מדיום תרבות hPSC, ולהוסיף Thiazovivin לריכוז הסופי של 2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לצלחות ג&#39;לטין מצופה ב1: 1, ותאי דגירה ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להסיר מתקני האכלת MEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מ&quot;ל, להוסיף סרום מתאים המכיל בינוני hPSC ולספור את התאים עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב258 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגות, להוסיף Thiazovivin לנכס בינוני mTeSR1 לעשות ריכוז של 2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה,spirate הבינוני ומוסיף בינוני mTeSR1 מתאים עם Thiazovivin כך שיש 1.8 x 10 5 תאים / בינוני מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחות Matrigel מן החממה, לשאוב Matrigel ולהוסיף 2 מ&quot;ל של התאים המעורבים על גם 1 של 6 גם הצלחות. הערה: צפיפות התאים צריכה להיות 3.6 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר של שטח פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הצלחות בחזרה לחממה, ולתת לתאים לצרף ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר ציפוי התאים, לשאוב מדיום ישן ולהוסיף 2 מ&quot;ל בינוני mTeSR1 חדש לכל טוב ולתת תאים לגדול במשך שעה 24 אחרת לפני שמתחיל את הבידול. </li></ol> התמיינות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל בידול 48 שעות לאחר replating התאים על גבי צלחות Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום התרבות לשאוב מן הצלחת, לשטוף תאי פעם עם PBS, ולהוסיף 2 מ&quot;ל של מדיום הבידול הבא בכל טוב: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542 ו100 ננומטר LDN-193189. מארק היום הזה כD0 של בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית בכל יום מD0 לD20. הערה: אפשר להכין מדיום לשימוש לא יותר מ 2 ימים בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לD1 וD2: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, 2 purmorphamine מיקרומטר, ו50 ng / ml FGF8b. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לD3 וD4: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, 2 purmorphamine מיקרומטר, 50 ng / ml FGF8b, ו3 CHIR99021 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במדיום לD5 וD6 הבא: 75% בינוניים KSR בידול תוספת 25% בינוניים בידול N2 בתוספת 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, purmorphamine 2 מיקרומטר, 50 ng / ml FGF8b, ו3 מיקרומטר CHIR99021. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במדיום לD7 וD8 הבא: 50% בינוניים KSR בידול תוספת 50% בינוניים בידול N2 בתוספת 100 ננומטר LDN-193,189 ו3 מיקרומטר CHIR99021.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לD9 וD10: 25% בינוני בידול KSR תוספת 75% בינוני בידול N2 בתוספת 100 LDN-193,189 ו3 CHIR99021 מיקרומטר ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לD11 וD12: בינוני בידול B27 בתוספת 3 מיקרומטר CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ננוגרם / מ&quot;ל ​​TGF3, חומצה אסקורבית 0.2 מ&quot;מ ו0.1 מ&quot;מ cAMP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לשאר בידול: בינוני בידול B27 בתוספת 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ננוגרם / מ&quot;ל ​​TGF3, חומצה אסקורבית 0.2 מ&quot;מ ו0.1 מ&quot;מ cAMP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבות D16 של בידול, להכין כמה / צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine. לדלל פולי-L-ornithine פתרון מניות עם (4 ° C) הקר PBS ל15 מיקרוגרם / מ&quot;ל, להוסיף 1 מ&quot;ל ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון פולי-L-ornithine, לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מים סטריליים ולאחר מכן אוויר יבש הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל סול מניית lamininution עם קר (4 ° C) PBS עד 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, להוסיף 1 מ&quot;ל לגם אחד 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון laminin, לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מים סטריליים ולאחר מכן אוויר יבש הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון מניות פיברונקטין עם קר (4 ° C) PBS ל2 מיקרוגרם / מ&quot;ל, להוסיף 1 מ&quot;ל ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חותם עם Parafilm ומניח אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 ימים של בידול, replate תאים ל/ צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine. בינוני בידול לשאוב, להוסיף 1 מ&quot;ל Accutase החם (37 ° C) ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, למקם את / צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של 5 דק &#39;, או כאשר תאים הפכו חצי צף, בעדינות תאי פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדילהפוך אותם לתאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בודדים לתוך צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל, ולהוסיף את הכמות המתאימה של מדיום neurobasal לספירת תאים, אשר תשתנה בהתאם להרחבה (לאחר 11 ימים של בידול, תאים עשויים להרחיב 15-20 קיפול). ספירת התאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב258 XG במשך 3 דקות. לשאוב supernatant, וresuspend תאים עם מדיום בידול B27, כך שריכוז התא הוא 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיברונקטין לשאוב מהצלחות, לשטוף פעמיים עם PBS, ולהוסיף 2 מ&quot;ל תאים גם 1 של 6 גם צלחות. הערה: צפיפות התאים לreplating צריכה להיות 2 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר של שטח פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית 24 שעות מאוחר יותר כדי להסיר את כל תאים מתים שאינם מחוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית בכל יום אחר עד נקודות הזמן הרצויות לניסוי נתון. </li></ol>

<ol>
	<li>Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Will+embryonic+stem+cells+be+a+useful+source+of+dopamine+neurons+for+transplant+into+patients+with+Parkinson's+disease.">Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Park, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+analyses+of+human+embryonic+stem+cell-derived+dopamine+neurons.">In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).</li><li>Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tyrosine+hydroxylase+positive+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+after+coculture+with+cellular+substrates+and+exposure+to+GDNF.">Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF.</a> Stem Cells. 22, 669-674 (2004).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 925-940 (2004).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li><li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+dopaminergic+neurons+in+serum-free+suspension+culture.">Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture.</a> Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopaminergic+neurons+in+vitro+from+human+embryonic+stem+cells+treated+with+neurotrophic+factors.">Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors.</a> Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).</li><li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).</li><li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+ES+and+Parkinson's+disease+iPS+cells+into+ventral+midbrain+dopaminergic+neurons+requires+a+high+activity+form+of+SHH,+FGF8a+and+specific+regionalization+by+retinoic+acid.">Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).</li><li>Sanchez-Danes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+A9+midbrain+dopaminergic+neurons+by+lentiviral+delivery+of+LMX1A+in+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).</li><li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li><li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+midbrain+dopamine+neurons+from+primate+pluripotent+stem+cells.">Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).</li><li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions.">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1, 703-714 (2012).</li><li>Mendez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+analysis+of+functional+fetal+dopamine+cell+suspension+transplants+in+the+striatum+and+substantia+nigra+of+patients+with+Parkinson's+disease.">Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease.</a> Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Nishimura, K., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+application+of+stem+cell+technology+toward+the+treatment+of+Parkinson's+disease.">Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).</li><li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron.">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+and+bFGF+cooperate+to+maintain+the+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells+in+the+absence+of+feeder+layers.">Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

תאי גזע pluripotent אדם (כולל שני hESCs וhiPSCs) יכולים להיות מובחנים במבחנה כדי לייצר רוב, אם לא כולם, סוגי תאים של הגוף שלנו, כולל תאי עצב DA, שהודגם במחקרים קודמים 19. כאן, המבוסס על ידע מפיתוח נוירון דופאמין העוברי 20 ופרוטוקולים שפורסמו ממעבדות אחרות 14,15, אנ...

ניתן למצוא נוירונים דופאמין (DA) במספר אזורים במוח, כולל המוח התיכון, ההיפותלמוס, רשתית, ונורות חוש הריח. נוירונים A9 DA בסעיפי nigra substantia compacta (SNpc) שליטת ההתנהגות ותנועה על ידי הקרנה לסטריאטום במוח הקדמי ולהרכיב את המערכת המוטורית אקסטרה. ניוון של תאי עצב A9 DA מוביל למחלת פרקינסון (PD), המהווה את ההפרעה השנייה בשכיחותה האנושית ניווניות וחשוכות מרפא כיום. טיפול בתחליפי תא הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר לטיפול במחלת פרקינסון 1, ולכן, חלה התעניינות רבה בנובעים נוירונים A9 DA מתאי גזע pluripotent אנושיים (hPSCs), כולל שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ו התאים אחרונים אנושיים מושרה גזע pluripotent (hiPSCs). מחקרים רבים ניסו להפיק תאי עצב A9 DA מhPSCs תוך שימוש בשיטות שונות. דיווחים המוקדמים כל הנוירונים DA שנוצרו באמצעות עצבישלב אב שושנה. על ידי שיתוף culturing עם MS5 2 או PA6 3-5 תאי סטרומה, עם או בלי גורמי גדילה חיצוניים ל2-4 שבועות, ל &#39;Studer ועמיתים ושלוש קבוצות אחרות מושרה בהצלחה hESCs לייצר רוזטות העצבית. לאחר מכן הם העשירו את רוזטות אלה על ידי נתיחה מכאנית או עיכול אנזימטי להבחנה נוספת. בדיווחים אחרים, חוקרים שנוצרו רוזטות העצבית דרך גוף embryoid (EB) צף בידול תרבות 6-9. מאוחר יותר, חוקרים שהוקמו בשיטת monolayer מבוססת בידול 10,11, שבו הם מצופים hESCs וhiPSCs על מטריצה ​​סלולרית נוספת, הוסיפו גורמי גדילה שונים בתרבות כדי לגרום להתמיינות של hPSCs לתאי עצב DA, אשר מחקה בפיתוח נוירון DA העוברי vivo . למרות שכל המחקרים הללו הושגו hydroxylase טירוזין (TH) תאי -expressing עם כמה מאפיינים של תאי עצב DA, תהליך ההתמיינות כל הוא זמן רב ועבודה,בדרך כלל לא יעיל, ויותר מכך, זהות A9 של נוירונים אלה לא באו לידי ביטוי במרבית המחקרים מלבד אחד עם ביטוי אקטופי LMX1a 12. לאחרונה, צלחת רצפה חדשה (FP) פרוטוקול מבוסס פותחה 13-16, שבו מבשרי FP עם פוטנציאל נוירון DA נוצרו לראשונה על ידי הפעלה של הקיפוד הקולי ומסלולי Wnt הקנונית איתות בשלב המוקדם של בידול, ולאחר מכן תאי FP אלה שצוינו בהמשך לתאי עצב DA. למרות שפרוטוקול זה הוא יעיל יותר, יש עדיין כמה בעיות; למשל, תהליך ההתמיינות השלם לוקח זמן רב (לפחות 35 ימים), והוא תא המזין תלוי 15, או היא EB תלויה 16 או זהות A9 לא הפגינה 14. כאן, המבוססים על הידע מפיתוח in vivo עוברי תא עצב DA והתוצאות שפורסמו של חוקרים אחרים, יש לנו מותאם לתנאי התרבות לeffדור icient של נוירונים DA משני hESCs וhiPSCs. אנחנו שנוצרנו ראשון תאי מבשר FP על ידי הפעלה של האיתות של Wnt הקנונית עם המולקולה קטנה CHIR99021 וסוניק קיפוד איתות עם מולקולות קטנות SAG וpurmorphamine. תאי FP אלה מבטאים FOXA2, LMX1a, קורין, OTX2 וNestin. לאחר מכן, אנו שצוינו תאי FP אלה לתאי עצב DA עם גורמי צמיחה כולל BDNF, GDNF, וכו &#39;. נוירונים DA שנוצרו הם מסוג תא A9 כפי שהם חיוביים לGIRK2 תוך שלילי לCalbindin 17. פרוטוקול זה הוא תא מזין או עצמאי EB, יעיל ומאוד לשחזור. שימוש בפרוטוקול זה, אחד יכול להפיק תאי עצב DA בפחות מ -4 שבועות מhESCs או hiPSCs של אנשים רגילים למחקר השתלת תאים, או מhiPSCs של חולי פרקינסון לדוגמנות במבחנה של PD או בדיקת סוכנים טיפוליים פוטנציאליים עבור PD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="778">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:184px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">DMEM</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10569-010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">FBS</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">penicillin/ampicillin</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10565-018</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">KSR</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Non-essential amino acid</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:184px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ES-007-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">bFGF</td>
			<td style="width:184px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">233-FB-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">mTesR1</td>
			<td style="width:184px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17104-019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Gelatin</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9391</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Glutamax</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-061</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">PBS</td>
			<td style="width:184px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Growth factor reduced matrigel</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">Accutase</td>
			<td style="width:184px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">1000449</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Thiazovivin</td>
			<td style="width:184px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-361380</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">SB431542</td>
			<td style="width:184px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1614</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">LDN-193189</td>
			<td style="width:184px;">Stemgent</td>
			<td style="width:119px;">04-0074</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">SAG</td>
			<td style="width:184px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">566660-1MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Purmorphamine</td>
			<td style="width:184px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-202785</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">FGF8b</td>
			<td style="width:184px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">423-F8-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:184px;">Cellagen Technology</td>
			<td style="width:119px;">C2447-2s</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">BDNF</td>
			<td style="width:184px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">248-BD-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">GDNF</td>
			<td style="width:184px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">212-GD-010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">TGF-beta3</td>
			<td style="width:184px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">243-B3-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">cAMP</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D0627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Mouse anti human NESTIN antibody</td>
			<td style="width:184px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-23927</td>
			<td style="width:167px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Rabbit anti human OTX2 antibody</td>
			<td style="width:184px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB9566</td>
			<td style="width:167px;">1/2000 dilutiion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Goat anti human FOXA2 antibody</td>
			<td style="width:184px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF2400</td>
			<td style="width:167px;">1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">rabbit anti human LMX1a antibody</td>
			<td style="width:184px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB10533</td>
			<td style="width:167px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Rabbit anti human TH antibody</td>
			<td style="width:184px;">Pel Freez</td>
			<td style="width:119px;">P40101</td>
			<td style="width:167px;">1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Chicken anti human TH antibody</td>
			<td style="width:184px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB9702</td>
			<td style="width:167px;">1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mouse anti human TUJ1 antibody</td>
			<td style="width:184px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">MMS-435P</td>
			<td style="width:167px;">1/2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Rabbit anti human GIRK2 antibody</td>
			<td style="width:184px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab30738</td>
			<td style="width:167px;">1/300 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Rabbit anti human Calbindin antibody</td>
			<td style="width:184px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab25085</td>
			<td style="width:167px;">1/400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:184px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5804</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed dopaminergic neuron differentiation from human pluripotent stem cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

סקירה כללית של פרוטוקול הבידול מוצגת באיור 1. היעילות של פרוטוקול הבידול מוצג כאן מסתמכת על מעמדם של התאים מתחילים. לכן, זה קריטי לוודא כי, ראשון מסיר את כל המושבות מובחנות לפני מתנער hPSCs לתוך תאים בודדים לבידול, ושנייה, אחד מכלה את רוב, אם לא כולם, תאים מזינים ME...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

directed-dopaminergic-neuron-differentiation-from-human-pluripotent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.4K Views.  Stanford University School of Medicine. We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.

Video: Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model system to explore disease mechanisms and carry out high content screening (HCS) to interrogate compound libraries or identify gene mutation phenotypes. However, with human cells the transition from NPC to functional, mature neuron requires several weeks. Synapses typically start to form after 3 weeks of differentiation in monolayer culture, and several neuron-specific proteins, for example the later expressing pan-neuronal marker NeuN, or the layer 5/6 cerebral cortical neuron marker CTIP2, begin to express around 4-5 weeks post-differentiation. This lengthy differentiation time can be incompatible with optimal culture conditions used for small volume, multi-well HCS platforms. Among the many challenges are the need for well-adhered, uniformly distributed cells with minimal cell clustering, and culture procedures that foster long-term viability and functional synapse maturation. One approach is to differentiate neurons in a large volume format, then replate them at a later time point in HCS-compatible multi-wells. Some main challenges when using this replating approach concern reproducibility and cell viability, due to the stressful disruption of the dendritic and axonal network. Here we demonstrate a detailed and reliable procedure for enzymatically resuspending human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons after their differentiation for 4-8 weeks in a large-volume format, transferring them to 384-well microtiter plates, and culturing them for a further 1-3 weeks with excellent cell survival. This replating of human neurons not only allows the study of synapse assembly and maturation within two weeks from replating, but also enables studies of neurite regeneration and growth cone characteristics. We provide examples of scalable assays for neuritogenesis and synaptogenesis using a 384-well platform.

This protocol describes a detailed procedure for resuspending and culturing human stem cell derived neurons that were previously differentiated from neural progenitors in vitro for multiple weeks. The procedure facilitates imaging-based assays of neurites, synapses, and late-expressing neuronal markers in a format compatible with light microscopy and high-content screening.

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...