עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31501099) ואת בגיל העמידה וצעיר של מחלקת החינוך של מחוז חוביי, סין (לא. רבעון 20191104). כמו כן, אנו מודים לפרופסור וונשנג דנג מאוניברסיטת ווהאן למדע וטכנולוגיה על שסיפק את קווי תאי הגזע העובריים של העכבר A2lox.

1. תרבות תאי גזע עובריים של עכבר
<ol><li>הכינו 0.1% מנות או צלחות של תרביות תאים מצופות ג'לטין.<ol>
<li>הוסיפו 2 מ"ל של ג'לטין מעוקר 0.1% (0.1% w/v במים) למנות תרבית תאים 60 מ"מ. רוק בעדינות כדי להבטיח אפילו ציפוי של מנות תרבות התא.</li>
		<li>שים את הכלים לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר ציפוי במשך 1 שעה.</li>
		<li>הסר את תמיסת הג'לטין 0.1% לפני זריעת התאים. הערה: לאחר הסרת הג'לטין, אין צורך לייבש או לשטוף את הכלים המצופה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תאי גזע עובריים של עכבר (A2lox ו-129) תרבות<ol>
<li>דגירה mESCs (A2lox ו 129) תאים ב 0.1% ג'לטין מצופה 60 מ"מ כלי תרבות התא במדיום צמיחה mESC ב 37 °C (79 °F) ב 5% CO2 חממה, בהתאמה. מדיום הצמיחה mESC מורכב 85% נוקאאוט DMEM/F12, 15% החלפת סרום נוקאאוט (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 1000 U/mL גורם מעכב לוקמיה (LIF), 10 nM CHIR-99021 (מעכב GSK-3) ו 0.33 ננומטר PD0325901 (מעכב MEK). התראה: β-מרקפטותנול הוא דליק ויש לו רעילות שאיפה. יש להרחיק ממקורות אש ולחבוש מסכה כדי למנוע שאיפה בעת השימוש.</li>
		<li>שנה את מדיום הצמיחה mESC מדי יום לצמיחה טובה יותר של A2lox ו 129.</li>
		<li>כאשר התאים מגיעים 80% מפגש, להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של 0.1% טריפסין למנה. בעדינות רוק במשך 30 s כדי להבטיח אפילו כיסוי של טריפסין על כל התאים.</li>
		<li>השאר את התאים במשך כ 1 דקות כדי לנסותize ולאחר מכן להסיר את טריפסין באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
		<li>הוסף 2 מ"ל של מדיום צמיחה mESC למנה, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להפוך את השעיית תא יחיד.</li>
		<li>לספור את הצפיפות של התאים בהשעיה במדויק ככל האפשר באמצעות hemocytometer.</li>
		<li>חלק את התאים ל- 7 קבוצות ו לגרום לבידול באמצעות פרוטוקולים שונים המוצגים בטבלה 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. בידול מ- MESCs ל- NPCs (שלב I)
<ol><li>מכינים 0.1% צלחות תרבית תאים מצופות ג'לטין או כיסויים.<ol>
<li>לפני השימוש, להכין 0.1% ג'לטין מצופה 6-well צלחות או coverslips כמו בשלב 1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 1 (טבלה 1)<ol>
<li>זרעים על 2 x 104 mESCs ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל באר 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ.</li>
		<li>דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 אינקובטור עבור 6 שעות כדי לאפשר התקשרות.</li>
		<li>לאחר ההחזקה, להוציא את התאים מן האינקובטור, ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.</li>
		<li>מוסיפים 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I(טבלה 1)לכל באר ומחזירים את התאים לאינקובטור.</li>
		<li>השאירו את התאים לבידול במשך 8 ימים. החלף את מדיום הבידול הבסיסי אני כל יומיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 2 (טבלה 1)<ol>
<li>הוסף 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית nonadhesive ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי ב 37 °C (79 °F) באינקובטור 5% CO2.</li>
		<li>לאחר יומיים, להעביר אגרגטים תא לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.</li>
		<li>הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend הגופים העובריים. לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים.</li>
		<li>בדקו את היווצרות הגופים העובריים מתחת למיקרוסקופ (איור 2A).</li>
		<li>לאסוף גופים עובריים כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3. זרעים על 50 גופים עובריים ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.</li>
		<li>הכינו מלאי RA כל-טרנס של 1 מ"מ (ב-DMSO) וחסנו הרחק מהאור במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחר אריזת משנה. הערה: RA אינו יציב, ויש להקדיש תשומת לב כדי להרחיק אותו מאור ולצמצם מגע אוויר במהלך הכנת מלאי RA.</li>
		<li>עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.</li>
		<li>מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 4 ימים.</li>
		<li>לשנות את כל 2 מ"ל של בינוני בידול בסיסי I (עם 1 μM RA) כל 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (טבלה 1)<ol>
<li>צמח 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I. להשאיר במשך 2 ימים להיווצרות גוף עוברי ב 37 °C (69 °F) באינקובטור 5% CO2.</li>
		<li>בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ (איור 2B).</li>
		<li>להעביר צבירות תאים לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.</li>
		<li>הסר את supernatant בזהירות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend אותם.</li>
		<li>זרעים על 50 גופים עובריים לתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.</li>
		<li>עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.</li>
		<li>מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 6 ימים. שנה את כל מדיום הבידול הבסיסי I (עם 1 מיקרומטר RA) כל 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 4 (טבלה 1)<ol>
<li>זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.</li>
		<li>לאחר הקובץ המצורף, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 4 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר (ריכוז העבודה הוא 1 מיקרומטר) כדי לגרום לבידול עוד 4 ימים.</li>
		<li>בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 5 (טבלה 1)<ol>
<li>זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.</li>
		<li>לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 2 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>עבור אינדוקציה RA הבאים, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של μM 1. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס כדי לגרום לבידול עוד 6 ימים.</li>
		<li>בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 6 (טבלה 1)<ol>
<li>צמח 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של N2B27 בינוני II (טבלה 1) כדי לאפשר היווצרות גופים עובריים.</li>
		<li>ביוםהשני, לאסוף את צבירות התא כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3 ולהזרים מחדש את הגופים העובריים באמצעות 10 מ"ל של N2B27 בינוני II טרי.</li>
		<li>לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F). בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ.</li>
		<li>ביום הרביעי, לאסוף גופות עובריות. זרעים על 50 גופים עובריים לכל באר על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות עם 2 מ"ל של N2B27 בינוני II.</li>
		<li>הוסף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר ולגרום בידול עוד 4 ימים. החלף את המדיום כולו (N2B27 בינוני II עם 1 μM RA) כל יומיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 7 (טבלה 1)<ol>
<li>זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.</li>
		<li>לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של N2B27 בינוני II לכל באר ולאפשר בידול במשך 8 ימים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 חממה.</li>
		<li>שנה את כל המדיום II של N2B27 כל יומיים.</li>
	</ol></li>
</ol>3. התבוננות במורפולוגיה של התא
<ol><li>בדוק את מצב הבידול של 7 הקבוצות שהוזכרו לעיל מדי יום תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוך.</li>
	<li>בחר באופן אקראי לפחות 12 שדות וצלם תמונות כדי לתעד את השינויים המורפולוגיים של כל קבוצה ב- D8.</li>
</ol>4. כתמי כשל חיסוני
<ol><li>הכנה לדוגמה: זרעי mESCs על 0.1% כריכות מצופות ג'לטין ולאפשר בידול במשך 8 ימים באמצעות הפרוטוקולים שהוזכרו בשלב 2.</li>
	<li>לשטוף: ביום8, לקחת את הדגימות מן האינקובטור ולהסיר את מדיום הבידול על ידי שאיפה. יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת ב-1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.</li>
	<li>קיבוע: להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde לכל מדגם ולתקן את התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לשטוף: לאחר קיבעון, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>חדירה: להוסיף 1 מ"ל של 0.2% TritonX-100 ב PBS לכל מדגם ולהשאיר במשך 8 דקות ב RT.</li>
	<li>לשטוף: לאחר חדירה, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>חסימה: הוסף 1 מ"ל של סרום עזים 10% ב- PBS לכל מדגם ודגירה ב- RT למשך שעה אחת כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן ראשוני<ol>
<li>לדלל את הנוגדן אנטי נסטין ביחס של 1:100 באמצעות 5% סרום עזים ב PBS.</li>
		<li>החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף: להסיר את הנוגדן ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן משני<ol>
<li>לדלל את אלקסה פלואור 488-שכותרתו עז נגד עכבר IgG ביחס של 1:500 באמצעות 5% סרום עזים ב- PBS.</li>
		<li>החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה בחושך במשך 2 שעות ב RT. הערה: לאחר החלת נוגדן משני פלואורסצנטי, בצע את כל השלבים הבאים בחושך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף: להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.</li>
	<li>כתמים גרעיניים והרכבה<ol>
<li>הנח טיפה אחת של מדיום הרכבה DAPI על המיקרו-מפולת הנקייה.</li>
		<li>בזהירות להוציא את הדגימות מן הצלחות ומניחים את המדגם על גבי המדיום הרכבה DAPI עם התא עם הפנים כלפי מטה. השאירו בחושך במשך 5 דקות ב- RT.</li>
		<li>הסר מדיום הרכבה עודף של DAPI עם נייר סופג.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית<ol>
<li>מניחים את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולזהות את האות עבור DAPI ואלכסה פלואור 488 באמצעות מסננים נאותים.</li>
		<li>בחר באופן שווה ואקראי 10-15 שדות חזותיים שונים עבור כל דגימה והקלט את התמונות במצלמת CCD.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. בידול מ- NPCs לנוירונים (שלב II)
<ol><li>הכן נגזרות mESC תחת בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (8 ימים, טבלה 1) כמפורט בשלב 2.4, בעל יעילות הבידול הגבוהה ביותר (ראה איור 3). הערה: לאחר שלב I בידול, בקרת איכות צריכה להתבצע באמצעות תצפית מורפולוגיה התא ו immunofluorescence הבדיקה שהוזכרו לעיל, כדי להבטיח NPCs בריא ותשואה גבוהה.</li>
	<li>זרעים על 5 x 105 נגזרות mESC בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. חלק באופן אקראי את נגזרות mESC ל- 3 קבוצות, כפרוטוקול שלב II 1, פרוטוקול 2 ופרוטוקול 3, בהתאמה.</li>
	<li>מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות. לשטוף אותם פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני I, N2B27 בינוני I ו N2B27 בינוני II(טבלה 2),בהתאמה, לכל באר של הקבוצות לעיל.</li>
	<li>מניחים את הצלחות לתוך האינקובטור ולאפשר להבדיל עוד 10 ימים. שנה את המדיום המתאים כל יומיים.</li>
	<li>בדוק את מצב הבידול ותעד את השינויים המורפולוגיים כאמור בשלב 3.</li>
	<li>ביום 18, להעריך את הדור של נוירונים (β-Tubulin השלישי חיובי) ולקבוע את יעילות הבידול של 3 פרוטוקולים באמצעות בשלב 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons:+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications.">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li><li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson's+disease+therapy.">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li><li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+an+in+vitro+tool+for+the+study+of+the+expression+patterns+of+the+neuronal+cytoskeleton+during+neurogenesis.">Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).</li><li>Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+modified+by+the+Neural+Growth+Factor+(NGF)+gene.">Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene.</a> Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).</li><li>Yoshimatsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+efficacy+of+small+molecules+for+neural+differentiation+of+common+marmoset+ESCs+and+iPSCs.">Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs.</a> Neuroscience research. , (2019).</li><li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages.">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).</li><li>Gazina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+derivation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+generating+synchronous+neuronal+networks.">Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).</li><li>Ohnuki, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hanging+drop+culture+conditions+on+embryoid+body+formation+and+neuronal+cell+differentiation+using+mouse+embryonic+stem+cells:+Optimization+of+culture+conditions+for+the+formation+of+well-controlled+embryoid+bodies.">Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).</li><li>Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+serum-free+monolayer+culture.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture.</a> Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro.">An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+optimal+suspension+culture+time+for+the+osteoblastic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+the+embryoid+body+method.">Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).</li><li>Lu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans+retinoic+acid+promotes+neural+lineage+entry+by+pluripotent+embryonic+stem+cells+via+multiple+pathways.">All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways.</a> BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).</li><li>Kanungo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+P19+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).</li><li>Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+and+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation:+Cross+talk+between+genomic+and+non-genomic+effects+of+RA.">Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+maintains+self-renewal+of+murine+embryonic+stem+cells+via+a+feedback+mechanism.">Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism.</a> Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).</li><li>Wu, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+upregulation+of+miR-219+promotes+the+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+cells.">Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells.</a> Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+germ+cell+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+through+a+Smad-dependent+pathway.">Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+neuronal+induction+of+the+P19+embryonic+carcinoma+cell+line.">A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).</li><li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage.">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li><li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons.">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקר הנוכחי, הקמנו שיטה פשוטה ויעילה עבור בידול עצבי מ mESCs, עם עלות נמוכה וחומרים שהושגו בקלות. בשיטה זו, 2 ימים של היווצרות הגוף העוברי ואחריו 6 ימים של אינדוקציה RA יכול לקדם ביעילות את הבידול של mESCs לתוך NPCs (שלב I-פרוטוקול 3). עבור הבידול שלב II, N2B27 בינוני II (שלב II-פרוטוקול 3) ביעילות רבה לגרום את...

תאי גזע עובריים (ESCs) הם פלוריפוטנטיים ויכולים להבדיל לתאי מבשר עצביים (NPCs) ולאחר מכן לנוירונים בתנאים מסוימים1. נוירוגנזה מבוססת ESC מספקת את הפלטפורמה הטובה ביותר לחקות נוירוגנזה, ובכך לשמש כלי שימושי למחקרים ביולוגיים התפתחותיים וסיוע פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית2,3. בעשורים האחרונים, אסטרטגיות רבות דווחו על גרימת נוירוגנזה עוברית, כגון השיטה הטרנסגנית4, באמצעות מולקולות קטנות5, באמצעות microenvironment מטריצה 3D6, ואת טכניקת תרבות משותפת7. עם זאת, רוב הפרוטוקולים האלה הם גם תנאי מוגבל או קשה לתפעול, ולכן הם אינם מתאימים לשימוש ברוב המעבדות.
כדי למצוא שיטה קלה לתפעול ועלות נמוכה להשגת בידול עצבי יעיל מ- mESCs, נעשה כאן שימוש באסטרטגיית סינון קומבינטורית. כפי שמתואר באיור 1, כל התהליך של נוירוגנזה עוברית חולק לשני שלבים. שלב I מתייחס לתהליך הבידול מ- mESCs ל- NPCs, והשלב השני מתייחס להבחנה הבאה מ- NPCs לנוירונים. בהתבסס על עקרונות הפעולה הקלה, עלות נמוכה, חומרים זמינים בקלות ויעילות בידול גבוהה, שבעה פרוטוקולים בשלב I ושלושה פרוטוקולים בשלב II נבחרו על סמך מערכת התרבות המונולאייה המסורתית או מערכת היווצרות הגוף העוברי8,9. יעילות הבידול של פרוטוקולים בשני השלבים הוערכה באמצעות תצפית מורפולוגיה של התא ומבחן כשל חיסוני. באמצעות שילוב הפרוטוקול היעיל ביותר של כל שלב, הקמנו את השיטה האופטימלית לבידול עצבי מ- mESCs.

<table><tbody><tr><td>Anti-Nestin antibody [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-Tubulin III antibody produced in rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, and protect from light</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>stored at room temperature</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor human</td><td>Sigma</td><td>L5283</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nonadhesive bacterial dish</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin Solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>stored at -80 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>Maintained in feeder-free culture system</td></tr><tr><td>Stem-Cellbanker (DMSO free)</td><td>ZENOAQ</td><td>stem cellbanker DMSO free</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>6 - well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro

הבידול העצבי של תאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) הוא כלי פוטנציאלי להבהיר את מנגנוני המפתח המעורבים נוירוגנזה ופוטנציאל לסייע ברפואה רגנרטיבית. כאן, הקמנו שיטה יעילה בעלות נמוכה עבור בידול עצבי מ mESCs במבחנה, באמצעות האסטרטגיה של הקרנה קומבינטורית. בתנאים המוגדרים כאן, היווצרות הגוף העוברי בן היומיים + פרוטוקול אינדוקציה של חומצה רטינואית למשך 6 ימים מאפשרת בידול מהיר ויעיל של MESCs לתאי מבשר עצביים (NPCs), כפי שניתן לראות על ידי היווצרות של A2lox מוערמים היטב דמויי נויריט ו -129 נגזרות שהן חיוביות של נסטין. המצב הבריא של גופים עובריים ואת נקודת הזמן שבה חומצה רטינואית (RA) מוחל, כמו גם ריכוזי RA, הם קריטיים בתהליך. בהבחנה הבאה מ NPCs לתוך נוירונים, N2B27 בינוני II (בתוספת מדיום Neurobasal) יכול לתמוך טוב יותר תחזוקה לטווח ארוך והתבגרות של תאים עצביים. השיטה המוצגת היא יעילה מאוד, בעלות נמוכה וקלה לתפעול, ויכולה להיות כלי רב עוצמה למחקר נוירוביולוגי וביולוגיה התפתחותית.

היווצרות גוף עוברי של יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים פועלת בצורה הטובה ביותר על בימוי הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I). כדי לקבוע את הפרוטוקול האופטימלי המקדם בצורה הטובה ביותר את הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I), 7 פרוטוקולים נבדקו הן על A2lox ו 129 mESCs (טבלה 1) ואת מצב הבידול של כל קבוצה היה במעקב בא...

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro at JoVE.com

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Wuhan Center for Disease Control and Prevention. כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

Video: Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Developmental Biology

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biology

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

טכניקה ליצירת תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.