מיקרוגליה שמקורה ב-iPS מהווה מקור רלוונטי ביולוגית של מיקרוגליה אנושית לניסויים במבחנה, ומהווה כלי חשוב לחקר הביולוגיה של המיקרוגליה בבריאות ובמחלות. אנו מציגים פרוטוקול בידול מיקרוגליה פשוט הדורש שימוש מינימלי בגורמי גדילה ומשיג טוהר ותפוקה גבוהים. כמו כן, אנו מדגימים בדיקת פאגוציטוזה אנושית לחלוטין.
תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם ב-iPSC רגישים מאוד לאידוי מדיה. כדאי להימנע משימוש בבארות שבפינת צלחת תרבית התאים, ולמלא את כל הבארות הריקות במים כדי לשפר את ההישרדות. לאחר המושרה תאי גזע פלוריפוטנטיים, או iPSCs, הגיעו למפגש של 80%, מנתקים את המושבות על ידי שטיפה עם מיליליטר אחד של DPBS, והוספת מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
נתקו את המושבות באמצעות מרים תאים על ידי גירוד מספר פעמים כדי ליצור תרחיף של תא בודד. לאסוף את ההשעיה, ולהעביר אותם צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של DPBS. לאחר מכן צנטריפוגה של התאים ב 500 פעמים גרם במשך דקה אחת, להסיר את supernatant, ו ressuse במיליליטר אחד של גוף העובר, או EB, בינוני.
קח 10 microliters של תאים, לדלל אחד עד שניים עם כחול טריפאן. לספור את התאים על hemocytometer, ובהתבסס על ספירת התאים, לדלל את מלאי התא לדילול סופי של 10, 000 תאים לכל 100 microliters. עבור ציפוי תאים, הוסף 100 מיקרוליטרים של התאים המדוללים לכל באר לצלחת 96 באר עגולה עם דבקות נמוכה.
צנטריפוגה את הצלחת ב 125 פעמים גרם במשך שלוש דקות, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים. ביום השני, באמצעות פיפטה רב ערוצית, החלף את מדיום חצי EB הישן במדיום טרי. כדי ליצור מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים, או PMPs, מצפים את הבארות של צלחת בת שש בארות על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת ציפוי מטריגל קרה כקרח.
לאחר מכן לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שעתיים, או לילה. ביום הרביעי של התמיינות EB, באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד, מעבירים את ה- EBs לבארות המצופות במטריגל. פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק את ה- EBs מהבאר.
לאחר מכן החזיקו את הצלחת מוטה כדי לאפשר ל-EBs להתיישב בקצה הבאר. לאחר שכל ה- EBs התיישבו, פיפטה עדינה והחלף את המדיום הישן, תוך שמירה על ה- EB בקצה הבאר עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם של PMP מוכן טרי. פזרו באופן שווה את התאים בבארות על ידי ערבוב ידני של הצלחת מצד לצד ובחזרה לחזית.
לאחר מכן דגירה של הצלחת במשך שבעה ימים כדי לאפשר ל- EBs להתחבר לתחתית הבאר. לאחר שבעה ימים, בדקו את ה-EBs תחת מיקרוסקופ שדה אור בהגדלה של פי ארבעה כדי לוודא שהם מחוברים לתחתית הבארות. בצע שינוי חצי בינוני, וביום 21, החלף את המדיום השלם בשלושה מיליליטר של מדיום שלם PMP.
ביום ה-28, חפשו תאים עגולים המכונים PMPs בסופר-נטנט. לאחר מכן אסוף את המדיום המכיל את ה- PMPs באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר ופיפטר אוטומטי מבלי להפריע ל- EBs. מעבירים את ה- PMPs בתווך לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
צנטריפוגה של PMPs שנאספו ב 200 פעמים g במשך ארבע דקות ולשאוף את supernatant לפני השעיה מחדש אותם אחד עד שני מיליליטר של תאים דמויי מיקרוגליה, או מדיום בסיסי IMG. לאחר מכן לספור את התאים על hemocytometer כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה של שאר התאים, ולדלל את PMPs לריכוז הרצוי.
לאחר מכן צלחת את התאים בצפיפות של 10 עד 5 תאים לסנטימטר מרובע על צלחות שטופלו בתרבית תאים באמצעות מדיום IMG שלם שהוכן זה עתה. עבור בדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים, צלחת 20 עד 30 פעמים 10 עד PMPs הרביעי לתוך צלחת 96 באר ו 100 microliters של IMG להשלים בינוני ולעקוב אחר תהליך ההתמיינות במשך 10 ימים. ביום הבדיקה, להסיר 40 microliters של בינוני לכל באר, ולהוסיף 10 microliters של פתרון צביעה גרעינית.
לדגור את הצלחת במשך שעתיים. הפשירו את הסינפטוזומים המסומנים על הקרח, וסוניקו בעדינות באמצעות סוניק מים למשך דקה אחת. שוב, מיד להניח את הסינפטוזומים על קרח.
לדלל את הסינפטוזומים המסומנים במדיום שלם IMG במיקרוליטר אחד של סינפטוזומים לכל 50 מיקרוליטרים של בינוני. לשליטה שלילית, הכינו 60 מיקרומולר ציטוכלסין D במדיום שלם IMG כדי לעכב פילמור אקטין, ובכך פאגוציטוזה. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של פתרון זה לכל באר עבור ריכוז סופי של 10 micromolar, ולדגור במשך 30 דקות.
מוציאים את הצלחת מהאינקובטור, ודוגרים ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שמרו על הצלחת על קרח, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום המכיל סינפטוזומים. צנטריפוגה של הצלחת 270 פעמים גרם במשך שלוש דקות ב 10 מעלות צלזיוס, ולשמור את הצלחת על קרח עד רכישת הדמיה.
הכנס את הלוח לקורא הדמיית תאים חי, ובחר את הבארות לניתוח. לאחר מכן בחרו עדשת מטרה של 20X. לאחר מכן, כוונן את המיקוד, הדיודה פולטת האור או ה-LED, העוצמה, זמן האינטגרציה והרווח של ערוצי השדה הבהיר והכחול.
הפלואורסצנציה הסינפטוזומית צריכה להיות זניחה בנקודת הזמן הראשונית. בחר את מספר האריחים הבודדים שיש לרכוש במונטאז' לכל באר. רכשו 16 אריחים במרכז הבאר, תוך הדמיה של כ-5% משטח הבאר הכולל.
הגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס, ואת מרווח הזמן הרצוי להדמיה. לאחר מכן, פתח את תוכנת הניתוח. לאחר מכן פתח את הניסוי המכיל את התמונות ולחץ על סמל הפחתת הנתונים.
בתפריט, בחר תפירת הדמיה תחת עיבוד הדמיה כדי ליצור תמונה מלאה מתוך ארבעת האריחים הנפרדים במונטאז' עם הפרמטרים המתוארים בכתב היד של הטקסט. הגדר סף עוצמה באמצעות ערוצי DAPI ו- RFP עבור תמונות אלה. פתח תמונה ולחץ על נתח.
תחת ניתוח, בחר ניתוח סלולארי, ותחת ערוץ זיהוי, בחר תמונה תפורה בערוצי DAPI או RFP. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסייה מסיכה ראשית וספירה, וקבע ערך סף וערכי גודל אובייקט שבוחרים כראוי את גרעיני התא בערוץ DAPI, או את אות הסינפטוזום בערוץ RFP. כדי לספור את מספר הגרעינים, עבור אל תפריט הפחתת נתונים, ותחת ניתוח תמונה, בחר ניתוח סלולארי.
שוב, עבור אל הכרטיסיה מסיכה ראשית וספירה, ותחת ערוץ, בחר את התמונות התפורות של DAPI והשתמש בפרמטרים המתוארים בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסייה מדדים מחושבים ובחר ספירת תאים. לאחר מכן כדי לקבל את האזור של אות הסינפטוזום, עבור אל תפריט הפחתת נתונים, ותחת ניתוח, בחר ניתוח סלולרי.
שוב, עבור אל הכרטיסייה מסיכה ראשית וספירה, ותחת ערוץ, בחר תמונות תפורות RFP והשתמש בפרמטרים המפורטים בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסייה מדדים מחושבים ובחר שטח סכום אובייקט. בכרטיסייה הפחתת נתונים, לחץ על אישור כדי לאפשר לתוכנה לנתח את כל התמונות שנרכשו.
לאחר ניתוח התמונות, יצאו את הערכים 'אזור סכום עצם' ו'ספירת תאים' לכל נקודת זמן. לאחר מכן חלק את האזור 'סכום אובייקט' בספירת התאים כדי לחשב את האזור המנורמל לכל נקודת זמן. אם משווים מספר טיפולים, או גנוטיפים, חשבו את מדד הפאגוציטוזה באמצעות המשוואה הנתונה.
iPSCs לא מובחנים מראים מורפולוגיה קומפקטית של מושבות עם קצוות מוגדרים היטב. תאי גזע פלוריפוטנטיים מנותקים יצרו אגרגטים כדוריים המכונים EBs, וגדלים עד ליום הרביעי של ההבחנה. כאשר ה-EBs מצופים ליצירת PMP, הם מתחברים ללוחות המצופים במטריגל, ושכבת תאים מתפשטת ומקיפה את האגרגטים הכדוריים.
ביום 28, תאים עגולים עם יחס ציטופלסמה גדול לגרעין מופיעים בהשעיה. מומלץ מאוד לתרבת iPSCs בלוחות מצופים למינין 521 במקום Matrigel, בגלל תפוקת PMP גבוהה יותר בלוחות מצופים למינין 521. לאחר החשיפה של PMPs למדיום IMG, תאים לרכוש מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה עם ציטופלסמה קטנה בנוכחות תהליכים מוארכים.
יתר על כן, זהות המיקרוגליה אומתה על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית. בדרך כלל, יותר מ-95% מהתאים מבטאים IB1 וכ-90% מהתאים מבטאים P2RY12 ו-TMEM119. ניתוח כתמים מערבי אישר כי iPSC יצר נוירונים מוטוריים נמוכים יותר עבור סמנים סינפטיים המבוטאים על ידי סינפטוזומים אנושיים, סינפטופיזין וחלבון צפיפות פוסט-סינפטית 95.
בבקרה בהשוואה לנקודת הזמן הראשונית, ב-10 שעות, האות הפלואורסצנטי האדום היה חזק, שכן רוב הסינפטוזומים נבלעו, והיו ממוקמים בתאים תוך-תאיים חומציים. ב- IMGs שטופלו ב- Cytochalasin D, הפחתה חזקה של האות האדום למשך אפס ו -10 שעות הצביעה על כך שהאות שזוהה נובע מאירועים פאגוציטיים. שטח הסינפטוזומים הנבלעים גדל עם הזמן עד 16 שעות.
עם זאת, אזור האות האדום מתאים שטופלו ב- Cytochalasin D לא גדל עם הזמן. תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם ב-iPS יכולים לשמש ליישומים שונים, כולל פאגוציטוזה ותגובה דלקתית בחקר מחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות.
