This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

.1 הכנת לשכות הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי פרפין / נפט (1: 1) לערבב וחום עד לקבלת התערובת נמס. שימוש במכחולים ולצייר 2-3 שכבות של ריבת פרפין / הנפט (1: 1) מערבב באמצע שקופית הזכוכית בהתאם לדמויות 1B-1D. הערה: אנו משתמשים בשקופיות זכוכית נפוצות (76 x 26 x 1.0-1.5 מ&quot;מ (W / D / H)) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תערובת ג&#39;לי פרפין / נפט נמסה במהירות בשקופית הזכוכית, כדי למנוע התמצקות תוך כדי ציור. להבטיח את שכבת ג&#39;לי פרפין / נפט היא על 2-2.5 סנטימטר באורך ו0.3-0.5 סנטימטר ברוחב. עובי שכבת ג&#39;לי פרפין / הנפט צריך להיות על .1-0.15 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverslip לפרפין הקרושה / תערובת וזלין ולאטום אותו עם שניים עד שלוש שכבות (1E דמויות, 1F) פרפין תערובת ג&#39;לי שעווה / נפט. השתמש 4-8 תאי הגירה לניסוי נדידת תאים נפוצים. תאי הגירת מקום in תנוחה זקופה במעמד. </li></ol> 2 הכנת Mix תא ההשעיה קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר (לדוגמא, עם 0.25% טריפסין / EDTA) ולספור תאים של עניין. Resuspend תאי תקשורת מלאה המכילה עוברי עגל בסרום (FCS), אנטיביוטיקה ומומלצת תוספים. הכן 4-8 1.5 מ&quot;ל צינורות תגובה ו20 השעיה תא μl המכילה 4-6 x 10 4 תאים (המספר הכולל של תאים תלוי בסוג התא להיות מנותח) ולמלא עד 50 μl עם תקשורת מלאה. הערה: תרכובות נוספות (לדוגמא, גורמי גדילה, כמוקינים, מעכבים, וכו &#39;) מתווספות להשעית התא. השתמש בפתרוני המלאי מתאימים כך שהנפח הסופי של השעיה תא אינו עולה על 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סכום כולל של 452 השעיה קולגן הסופית μl לארבעה ניסויי נדידת תאים. הוסף 50 μl 10x MEM (pH 5.1-5.5) ו27 μl של .7.5% פתרון סודיום ביקרבונט (pH 9.0-9.5) לצינור תגובה 1.5 מ&quot;ל ומערבבים היטב. שים לב לתורו בצבע פתרון מצהוב כתומה לסגול העז (pH 9.0-9.5). הוסף השעיה קולגן 375 μl נוזל ל10x ממ / פתרון סודיום ביקרבונט ומערבבים היטב. PH של ההשעיה קולגן הסופית צריך להיות על 7.5 (מסומן בצבע סגול בהיר). הערה: בדוק את pH של תמיסת סודיום ביקרבונט 7.5%. אם pH הוא כ 7.5 מקום פתרון סודיום ביקרבונט עם מכסה פתוח בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) להיות רווי עם CO 2 ולהגדיל את רמת החומציות (כ 9.0-9.5). PH של תערובת תא ההשעיה קולגן הוא חיוני ליציבות של רשת קולגן. אם זה נמוך מדי סריג קולגן יקרוס במהלך ניסוי נדידת תאים. הערה: לקבלת פרוטוקול זה, להשתמש בקולגן הנוזלי (pH 1.9-2.2) מאחורי שור (2.9-3.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קולגן, 95% קולגן סוג I, 5% IV סוג קולגן). דוגמאות לפרוטוקולי הכנת סריג קולגן נוסף באמצעותסוג אני קולגן ממקורות אחרים, כגון חזירי או עכברוש, ניתנים ב32,33. אין לשנות את הכרכים של הפתרונות המשמשים כזה ישנה את ריכוז קולגן האולטימטיבי של 1.67 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של הסריג. יש ריכוז קולגן גבוה יותר או נמוך יותר השפעה על הצפיפות של סיבי קולגן והמרחק ביניהם הממוצע במקביל לתאי התנהגות 34 נודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של ההשעיה קולגן הסופית להשעיה תא 50 μl 100 μl ולערבב thoroughly.The השעיה סופית קולגן (1.67 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קולגן) היא מעט צמיגה. כדי להעביר את הסכום הנכון (100 μl), פיפטה פתרון קולגן הסופי פעם אחת למעלה ולמטה לפני העברתה להשעית התא. הערה: ברגע שתערובת תא ההשעיה קולגן בשילוב עם פתרון 10x ממ / סודיום ביקרבונט וערך pH השתנה ל7.5 סיבי קולגן מייד להתחיל לפלמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תערובת תא הסופית ההשעיה קולגן מהצינורות תגובת דואר לתאי ההגירה. לטפוח בעדינות את תא ההגירה לחלק באופן שווה את תערובת תא ההשעיה קולגן בחלק התחתון של חדר ההגירה (איור 1H). מניחים את תאי ההגירה בתנוחה זקופה במעמד ודגירה על 30 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר פילמור של סיבי קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שסריג קולגן polymerized הוא מעט עכור, אבל עדיין להיות בצבע סגול בהיר. למלא את תאי הגירה עם מדיום מלא או בינוני מלא עם תוספים של עניין ולאטום את חדר ההגירה עם תערובת ג&#39;לי פרפין / נפט (איורים 1 ט, י 1). </li></ol> .3 הקלטה וניתוח של נדידת תאים סעיף זה מתאר את ההקלטה של ​​נדידת תאים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות וידאו וניתוח של נדידת תאים על ידי מעקב סלולארי מדריך ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על המיקרוסקופ וחימום הבמה מיקרוסקופter. כוון את הטמפרטורה ל37 C °. השתמש אובייקטיבי 10X. הנח תא הגירה תחת מיקרוסקופ ולהתמקד 50 כ תאים או יותר בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירה רשומה תא במצב הזמן לשגות באמצעות תוכנת מעקב וידאו מרובה מצלמה. לשמור סרטי נדידת תאים בפורמט מתאים, למשל, &quot;* אבי&quot; או &quot;.mov *&quot;. קישור קבצי סרט נדידת תאים למאגר מידע המכיל מידע תומך, כגון סוג תא ותנאי ניסוי. הערה: אנו מקליטים לימפוציטים וHSPCs עד שעה 2 באמצעות גורם הזמן לשגות של 1:80, מה שאומר ש0.75 שניות בזמן לשגות שווה ל1 דקות בזמן אמת. תאי גידול הם תאים שנעו לאט ולכן נרשמו לפחות 16 שעות באמצעות גורם הזמן לשגות של 1: 1,800 (0.5 שניות בזמן לשגות שווה ל15 דקות בזמן אמת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח סרטי נדידת תאים באמצעות יישום מתאים מעקב תא תוכנה, כמו תוספי תוכנת ImageJ(סקירה כללית ניתן ב18). לניתוח בלתי מוטה זה הוא בעל חשיבות מכרעת כי תאים ייבחרו באופן אקראי ללא הידיעה אם תאים פעילים נודדים או לא. הערה: אנו משתמשים ביישום תוכנה מפיתוח עצמי כדי לעקוב באופן ידני את הנתיבים של לפחות 30 תאים לכל ניסוי על ידי ביצוע התאים נעו בצורה מדויקת עם סמן העכבר (שממוקם לגרעין). תוך מעקב, xy-הקואורדינטות של התאים עליהם המעקב באופן אוטומטי שנקבעו בהתאם למצב בזמן לשגות בשימוש. לימפוציטים מסוג xy-קואורדינטות / HSPCs נקבעות כל שניה 0.75 (שווה בזמן אמת 1 דקות), ואילו לתאי גידול xy-הקואורדינטות נקבעות כל שניה 0.5 (שווה לזמן אמת 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כולל של 60 xy-קואורדינטות לכל תא לניסוי נדידת תאים טיפוסי. זה שווה לשעה 1 בזמן אמת לימפוציטים / HSPCs ו15 שעה בזמן אמת לתאים סרטניים. &quot;,&quot; מצביע על כך שתא לא זז בין two נקודות זמן, ואילו &quot;ערך מספרי&quot; מציין את המרחק ב&quot; פיקסלים &quot;תא עבר בין 2 נקודות זמן (איור 2 א). הערה: מעקב תא ידני דורש ניסיון. במיוחד תאים מהירים נודדים קשים לעקוב וכל תערוכת סוג תא התנהגות נדידה שונה שעשויים להיות מופעלת על ידי גורמים בתוספת. במקרה של חלוקת תא תוך מעקב, באופן אקראי לבחור תא בת אחת להמשך מעקב. תאים שנודדים אל מחוץ לשדה הראייה או למות תוך מעקב אינו מוזנח, אך נחשבים לניתוח. </li></ol> ניתוח .4 נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתוני מעקב תא באמצעות יישום מתאים תוכנה, למשל, תוכנת גיליונות אלקטרוניים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתוני מעקב תא על ידי העתקת תא מעקב נתונים גולמיים (איור 2 א), לתבנית של גיליון אלקטרוני בעיצוב עצמי. להכפיל סכום של &quot;הערכים המספריים&quot;, המייצג אתהמרחק הכולל של תאים שנדדו עם גורם תיקון להמיר &quot;פיקסל&quot; לתוך &quot;מיקרומטר&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע שני פרמטרים נדידת תאים: פעילות locomotory (שהוא שווה ערך לשיעור הגירה) ושעה של תנועה אקטיבית (2C דמויות, 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את התאים שהגרו פחותים מאשר 25 מיקרומטר (רמת סף כדי לצמצם את מספרם של תאים חיוביים שגויים) כתאים שאינם זז. החלף את &quot;ערכים מספריים&quot; של תאים אלה עם &quot;,&quot;. הערה: הפרמטר (או שיעור הגירה) &quot;פעילות locomotory&quot; מייצגת את אחוז התאים של אוכלוסיית תאי מעקב שנעו בין שתי נקודות זמן (איור 2 ד). &quot;ערך מספרי&quot; מוגדר כתא מרגש, ואילו &quot;,&quot; מוגדר כתא שאינו זז. הפרמטר &quot;הזמן של תנועה פעילה&quot; (זמן פעיל) מייצג את אחוז הזמן הכולל תא הגר מחדשויסות למסגרת של תקופת התצפית (איור 2 ג) הזמן. &quot;ערך מספרי&quot; מצביע על כך שתא עבר, ואילו &quot;,&quot; מצביע על כך שתא לא זז. פרמטר זה נמצא בשימוש נוסף כדי לקבוע את מספר התאים שלא עברו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב מובהקות סטטיסטיות ונתונים נדידת תאי תצוגה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב מובהקות סטטיסטיות של פעילות locomotory הממוצעת של התאים (שיעור ההגירה) באמצעות מבחן Mann-Whitney U. שקול p-value &lt;0.05 משמעותיים כ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את פעילות locomotory הממוצעת של תאים כxy-תרשים, תרשים BoxPlot, או כתרשים תרשים בר. להציג נתונים יחידים המבוסס על תאים, כגון זמן של תנועה או מהירות פעילה, כתרשים תרשים בר או כמו היסטוגרמה. הערה: אם יישום תוכנת גיליון אלקטרוני שנבחר אינו מכיל כלי תרשים או תרשים היסטוגרמה BoxPlot חיפוש מקוון יש לבצע למחפש tu המתאיםtorials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

היכולת להעביר היא סימן היכר של תאים סרטניים 4. ללא היכולת להתנתק מהגידול הראשוני ולנדוד דרך תאי גידול רקמות חיבור שמסביב לא תוכל זרע נגעים משניים, המהווים את הגורם העיקרי למותם של כמעט כל חולי הסרטן. בגלל הקשר הזה מחקרים רבים מתמקדים בנדידת תאי הסרטן. המטרה של מח...

<html> כמו איחוי תאים (לסקירה לראות 1,2) נדידת תאים היא תופעה ביולוגית אחרת, כי הוא מעורב בשפע של תהליכים פיסיולוגיים כוללים התפתחות עוברית, לריפוי פצעים ותגובה חיסונית (לסקירה ראה 3). עם זאת, היכולת להעביר גם תנאי מוקדם לתאים סרטניים לשלוח גרורות (לסקירה ראה 3,4). נדידת תאים היא מורכבת, עדיין לא הבין באופן מלא תהליך שמנוהל על ידי יחסי הגומלין של מספר מסלולי העברת אותות ביוזמת יגנד השונים (למשל, ציטוקינים, כמוקינים, גורמי גדילה, הורמונים, רכיבי מטריצה ​​תאיים) קולטן (למשל, טירוזין קינאז רצפטור, קולטנים chemokine, integrins) אינטראקציות 5 סופו של דבר גורמים לארגון מחדש של שלד התא במקביל אקטין עם דה והרכבה מחדש של מתחמי הידבקות מוקד וintegrin בתיווך איתות 6. = &quot;Jove_content&quot; של&gt; כדי לנתח תא הגירה כמה במבחנה ובמבחני נדידת תאי vivo פותחו בעשורים האחרונים, ובכלל זה assay התא / transwell בוידן 7, assay / פצע שריטה ריפוי assay 8-10, תלת ממדים ( 3D) assay מטריצת הקולגן הגירת 11 כמו גם הדמיה / מיקרוסקופיה intravital (לסקירה ראה 12). לכל אחד ממבחני נדידת תאים אלה יתרונות וחסרונות, לדוגמא, עלויות הנוגעות וצורך של ציוד, טיפול או לאמינות של הנתונים שהתקבלו. שתי קאמרי / assay transwell בוידן וassay השריטה / assay ריפוי הפצע הם, בעלות נמוכה קלה ומבחנים מפותחים למדוד נדידת תאים במבחנה 7-10. בתא בוידן / transwell תאי assay הם זורעים על גבי נקבוביות להכניס מכילים (כ 8 מיקרומטר קוטר) - העליון התא שנקרא 7. אופציונאלי, להוסיף יכול להיות מצופה עם מ תאירכיבי Atrix, למשל, פיברונקטין, קולגן, וכו &#39;, כדי לחקות את הסביבה פיזיולוגית יותר. כמו כן, תאי האנדותל ניתן יהיו לגדל על גבי העלון, ובכך מחקה את מחסום תא האנדותל 13. תאים אלה שעברו את הנקבוביות במרווח זמן שהוגדר לתא התחתון מחסה תקשורת ותוספים, כגון גורמי גדילה וכמוקינים, משמשים כקריאה החוצה לכמת נדידת תאים (או extravasation). בassay השריטה / פצע תאי assay ריפוי הם זורעים בצלחות וגדלים לconfluency 10. בתלות של צלחות הגדרה הניסיוניות ניתן מראש מצופה עם רכיבי מטריצה ​​תאיים, כגון פיברונקטין. לאחר יצירת שריטה / פצע על ידי גירוד התאים בודדים monolayer תא מכל צד של השריטה / פצע יכול לנדוד לתוך הפער, ובכך ממלא / ריפוי זה 10. המרחק בין שני הצדדים של השריטה / פצעים נקבעבתלות של זמן ומשמש כקריאה החוצה לפעילות הנדידה של התאים 10. עם זאת, להבחין בין התפשטות תאים (שגם עלולה לגרום למילוי / ריפוי של השריטה / פצע) ונדידת תאים מומלץ לשלב את assay עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו ותא בודד מעקב 10. עם זאת, שניהם קאמרי בוידן / assay transwell וassay / פצע שריטה ריפוי assay, הוא די מושלמים הנוגע לסביבה סלולרית פיזיולוגית דמוית. בתא בוידן / תאי assay transwell צריכים להעביר דרך נקבובית פלסטיק, ואילו בשריטת assay / ריפוי פצע תאי assay הם זורעים על צלחת פלסטיק מצופה מראש דו ממדים. כמו כן, הוא מוכר היטב שהתנהגות הנדידה שונה במידה ניכרת בין סביבה דו ממדית ו3D 3. למשל, הידבקויות תלת ממדי מטריצה ​​של fibroblasts שונים מהידבקויות מוקד ופיברילציה מאופיינות בשנימצעי -dimensional בתוכנם של α5β1 וintegrins αvβ3, paxillin, רכיבי cytoskeletal אחרים, וזרחון טירוזין קינאז של הידבקות מוקד 14. כמו כן, תאים המוטבעים בתוך סביבת 3D מוצגים גם התנהגות נדידה שינה 15. כך לנתח נדידת תאים בצורה מדויקת יותר assay הגירה מומלץ מאפשר למדוד את ההגירה של תאים בודדים בתוך סביבה פיזיולוגית או דמוית פיזיולוגית 3D. ההדמיה / מיקרוסקופיה Intravital היא הזהב סטנדרטי למדידת נדידת תאים בהקשר פיסיולוגי 3D. זה רק שאינו שייך לאינטראקציות מטריצת תאים תאיים, אלא גם ליחסי הגומלין בין סוגי תאים שונים, כגון תאים סרטניים ותאי האנדותל במהלך extravasation 16 או סחר הלימפוציטים בתוך הבלוטה לימפה 17, אשר, למועד, הוא אפשרי בשל טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי משופרות, כגון 2-פוטוןמיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר, השימוש בצבעים חיוניים ניאון וזני עכבר מהונדסים מבטא נגזרי חלבוני ניאון 12,16,17. בנוסף, הדמיה / מיקרוסקופיה intravital יכולה להיות משולבת עם תא ידני ואוטומטי מעקב 18. עם זאת, בשל הצורך של מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal 2 פוטונים, כמו גם בעלי החיים (ומודלים של בעלי חיים מהונדסים מתאימים) הדמיה / מיקרוסקופיה intravital היא טכניקה ולא עלות אינטנסיבית. כדי להתגבר על המגבלות של החדר / assay transwell בוידן וassay ריפוי assay / פצע שריטה ולנתח את ההגירה של סוגי תאים שונים בתוך סביבת 3D assay הגירת מטריצת קולגן 3D פותח 11,19. ובכך, תאים נודדים מוטבעים בתוך רשת קולגן סיבי 3D, אשר מזכיר יותר לin vivo מצב. בצמדים, בשל נדידת תאים אמיתיים מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו נמדד מאפשר determiאומה של מספר פרמטרים הגירה, כמו גם שינוייהם בתגובה לגורמים או מעכבים בעד נודדים. סוגי תאים שונים יכולים להיות מנותחים באמצעות טכניקה זו, ובכלל זה לימפוציטים ולויקוציטים 11,20, גזע hematopoietic / תאי אב 21-24, ותאי גידול 5,25-29. בנוסף לתאים בודדים גם תא אשכולות או spheroids יכול להיות מוטבע בתוך נלווה מטריצת הקולגן עם ניתוח של ההגירה של תאים בודדים מאשכול התא / אליפטית לקולגן סריג 30,31. פרוטוקול זה מציג סקירה על טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה כדי לנתח את התנהגות נדידת תאים מסוגים שונים של בסביבת 3D - שיטה במבחנה מניב בתוצאות שאינן קרובים למצב in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

היכולת להעביר היא סימן היכר של תאים מסוגים שונים וממלא תפקיד מכריע במספר תהליכים פיסיולוגיים, הכוללים התפתחות עוברית, ריפוי פצעים, ואת תגובה חיסונית. עם זאת, נדידת תאים היא גם מנגנון מפתח בסרטן מאפשר לתאי הסרטן אלה להתנתק מהגידול הראשוני להתחיל גרורתי מתפשט. בתוך השנים האחרונות מבחני נדידת תאים שונים פותחו כדי לנתח את התנהגות נדידת תאים מסוגים שונים של. בגלל התנהגות locomotory של תאים שונים במידה ניכרת בין שני ממדים (2D) וזה הסביבה תלת ממדי (3D) ניתן להניח כי הניתוח של ההגירה של תאים המוטבעים בתוך סביבת 3D יניב בנדידת תאים משמעותית יותר נתונים. היתרון של assay ההגירה תאר 3D מטריקס קולגן הוא שתאים מוטבעים בתוך רשת 3D פיזיולוגית של סיבי קולגן המייצגים את המרכיב העיקרי של מטריקס. בשלנדידת תאים אמיתיים מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו נמדדת מאפשרת הקביעה של מספר פרמטרים הגירה, כמו גם שינוייהם בתגובה לגורמים או מעכבים בעד נודדים. סוגי תאים שונים יכולים להיות מנותחים באמצעות טכניקה זו, ובכלל זה לימפוציטים / לויקוציטים, תאי גזע, ותאים סרטניים. כמו כן, גם צבירי תאים או spheroids יכולים להיות מוטבע בתוך נלווה מטריצת הקולגן עם ניתוח של ההגירה של תאים בודדים מאשכול התא / אליפטית לסריג קולגן. אנו מסיקים כי assay הגירת מטריצת קולגן 3D הוא שיטה תכליתית כדי לנתח את ההגירה של תאים בתוך סביבת 3D פיזיולוגית דמוית.

Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן המשמש בשילוב עם הזמן לשגות וידאו מיקרוסקופיה ומעקב תא בעזרת מחשב מאפשר לקביעת פרמטרים שונים נדידת תאים כוללים גם פרמטר המבוסס על האוכלוסייה (למשל, אומר שפעילות locomotory) ופרמטרים המבוסס על תא בודדים (לדוגמא, זמן של פעיל תנועה, מהירות, מר...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית 3D.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

analysis-of-cell-migration-within-a-three-dimensional-collagen-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.6K Views.  Witten/Herdecke University.  נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית...

Video: Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper composition, targeted modulus, and well-defined architectural features. Biomaterials that recapitulate the intrinsic architecture of in vivo tissue are vital for studying diseases as well as to facilitate the regeneration of lost and malformed soft tissue. A novel biofabrication technique was developed which combines state of the art imaging, three-dimensional (3D) printing, and selective enzymatic activity to create a new generation of biomaterials for research and clinical application. The developed material, Bovine Serum Albumin rubber, is reaction injected into a mold that upholds specific geometrical features. This sacrificial material allows the adequate transfer of architectural features to a natural scaffold material. The prototype consists of a 3D collagen scaffold with 4 and 3 mm channels that represent a branched architecture. This paper emphasizes the use of this biofabrication technique for the generation of natural constructs. This protocol utilizes a computer-aided software (CAD) to manufacture a solid mold which will be reaction injected with BSA rubber followed by the enzymatic digestion of the rubber, leaving its architectural features within the scaffold material.

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

תלת ממדי טכנולוגיה Biomimetic: רומן Biorubber יוצר מוגדרת מיקרו מאקרו בקנה מידה ארכיטקטורות ב הידרוג קולגן

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.