We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

הערה: כל הניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת האתיקה הטיפול בבעלי חיים של אוטווה, הקפדה על ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. הכנה וחומרים 1. טרום ניתוחיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פלסמידים באמצעות MegaPrep Qiagen פי הפרוטוקול של היצרן. Innoculate לפחות 400 מיליליטר של מרק LB עם חיידקים הפכו להבטחת תשואת DNA גבוהה ודגירת הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד הגלול ב100-200 μl TE לריכוז סופי של לפחות 5 מיקרוגרם / μl. DNA Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. אם הריכוז נמוך מדי, לא לזרז וresuspend כמו זה יכול להוסיף זיהומים. להתחיל מחדש עם הכנה חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניתוח, לדלל פלסמיד בודד (Cre-GFP למשל) עד ​​2 מיקרוגרם / μl במים סטריליים עם 1 μl של 0.1% (w / v) צבע ירוק מהיר לכל 10 או 20 μl של פתרון פלסמיד מדולל. אם GFPואת הגן של ריבית ללהיות שותף electroporated בפלסמידים נפרדים, להזריק פלסמיד GFP ופלסמיד הנושא את הגן של ריבית בשיעור של 1: 4 למקסם את הסיכוי שכל התאים מסומנים עם GFP הם שיתוף electroporated עם שני פלסמידים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך צינורות microcapillary הזכוכית (קוטר חיצוני 1 מ&quot;מ - להלן כפי מחטים) על חולץ מחט סטנדרטי, באמצעות משיכה צעד אחד בגיל 62 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי חבילה כירורגית המכילה את הדברים הבאים: מחזיקי המחט, מפשק פצע, מלקחיים, מספריים לניתוח, מספריים למחטים, סיכות, סיכות, גזה, כיסויי פצע, וילונות כירורגי (איור 1 א &#39;, ב&#39;; לוח חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כלים אחרים הנדרשים: electroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 או 7 מ&quot;מ), מלח, תפר, מזרק 5 מיליליטר (לוח חומרים). </li></ol> 2. הכן העכבר לכירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניהול כאב, להזריק מתוזמן-p<html> עכבר regnant עם עצירות (0.05 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) שעה אחת לפני הניתוח. החל פרוטוקול זה לעכברים מתוזמן בכל מקום בין עוברי היום 12.5 (E12.5) לE17.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעצות פיפטה microloader לגבות עומס משך מחטים עם פתרון פלסמיד. אין למלא את כל הדרך לקצה המחט עדיין כמו זה יגרום המחט ללהיות סתומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש עכבר באמצעות 2-5% גז isoflurane עם L 1 O / 2 דקות. ברגע הנייח, למקם במסיכת פנים ולהחיל משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות. הזרק עם 1 מיליליטר תמיסת מלח (0.9% NaCl) תת עורי בגב. הערה: כאשר עובד עם גז isoflurane, להשתמש נבלות גז לשחזר גז עודף ולמנוע ממנו לברוח לחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן. לשטוף בטן עם לשפשף Chlorohexadine, לשטוף עם מים, ולהחיל פתרון הכנה סופי של chlorohexadine ו -70% אתנול. עכבר כיסוי עם וילון או גזה סטרילית כדי לכסות פרווה אבל להשאיר חשוף בטן (איור 1 ג, ד). </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. ברחם electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בעור מעל הבטן בין השדיים נמוכים יותר. למשוך את העור משכבת ​​השריר הבסיסית על ידי קריעת רקמות חיבור, ואז לחתוך דרך הצפק לתוך חלל הבטן לאורך alba המנחה. הכנס את מפשק הפצע למשוך את הקצוות של הפצע בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם מחלל הבטן ולהוציא אותו כפי שמוצגים (1E איור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גורים שונים להיות מוזרקים עם פלסמידים שונים (כגון GFP לעומת GFP עם הגן של עניין), לספור את הגורים בכל צד ולהחליט אילו וכמה להזריק עם כל פלסמיד. להחליף צד אחד של הרחם בחזרה לתוך הבטן כדי לשמור על העוברים חמים ומשומנים. מייד להרטיב את הרחם החשוף עם מי מלח (רצוי חימם לטמפרטורת גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הזרקת כל הגורים באותה פלסמיד (למשל, כאשר הזרקת Cre-GFP לעוברי מהונדסים) only להסיר קרן אחת של הרחם בזמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מחט טעונה בראש האחיזה של שרביט ההזרקה ובזהירות לחתוך את הקצה עם מספריים כירורגיות קטנים או מלקחיים בסדר. חותך את הקצה כך שהמחט נשארת זמן רב ככל האפשר בזמן שעדיין מאפשר נוזל לעבור (איור 1Ji-ד &#39;). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם אורך של הזרקה (בשניות) והזרקה בלחץ על microinjector כך שאגל עדיין נראה בקלות קטנה של 0.1-0.2 μl מופיע בקצה המחט, כאשר ההנעה הרגל נלחץ. לשמור על הנפח של טיפה זו עקבית ככל האפשר בין מחטים שונות. הערה: שלב זה הוא חיוני להישרדות עובר (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפרמטרים הבאים להזרקת Femtojet: הזרקה בלחץ (pi) = 250-300 hPa; זמן הזרקה (ti) = .8-1.2 שניות; לחץ פיצוי = 10-50 hPa. במידת הצורך, להתאים את הפרמטרים אלה כדי להתאים וריאציה בין מחטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sלבחור עובר ובעדינות למקם אותה על הגב שלה, ראשו המוטה כלפי מעלה (איור 1F). הערה: זה עשויה לדרוש הפיכה או הסטת העובר; היזהר שלא להפעיל לחץ רב מדי ולהימנע מקרע של השק השפיר ואילו מניפולציה העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהעובר נמצא במקום, לאתר את החדר, המציג כמקביל צל בצורה חצי סהר לסינוס sagittal. לגעת בקצה המחט אל הרחם מעל החדר בזווית קלה ולהנחות את המחט דרך דופן הרחם. כמות הלחץ הנדרש תלויה בחדות של המחט. לדחוף את המחט דרך הקליפה לתוך החדר. הערה: למרות שיש רק לעתים נדירות כל התנגדות לגילוי נוספת, ראשו של העובר הוא דחף לעתים קרובות משם מעט ואז נרתע כמחט עוברת דרך הקליפה לתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את ההנעה הרגל להזריק פתרון פלסמיד. תמשיך לשאוב עד אזור ירוק גלוי ועומד בצורת קשת של החדר (איור 1G). בעוברים צעירים (E12.5 לE14.5) הצבע לעתים קרובות מפוזר לתוך החדר הנגדי. הערה: מספר המשאבות תלוי בקוטר של קצה המחט, גיל העובר (והגודל של החדר וכתוצאה מכך) והרצוי נפח ההזרקה. שמרו נפח מוזרק עקבי ככל האפשר בין עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק שלושה או ארבעה עוברים. שמור את כל העוברים שנחשפו לחים עם מי מלח בכל הליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לעוברים הראשונים הזריקו ולמקם את המשוטים כך שהאלקטרודה החיובית תמשוך את הפלסמיד לאזור הרצוי של המוח (איור 1H). זווית האלקטרודה השלילית, כך שהמסלול הקצר בין האלקטרודות מעבירה ישירות דרך המבנה הממוקד עבור electroporation (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמשוטים נמצאים במקום, להחיל את ההלם. בהתאם לגיל והגודל של העוברים, להשתמש 5 פולסים של 35-50 V (ראה T1 מסוגל). השתמש בפרמטרי electroporation הבאים: אורך הפולס של 5 אלפיות שניים עם מרווח דופק של 950 אלפיות שניים. חזור עם כל העוברים המוזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קצה המחט טעונה מראש חדשה כמו בשלב 3.3 כמחט האחרונה סביר מיובשת וסתום במהלך שלב 3.9. להזריק את הסדרה הבאה של שלושה או ארבעה עוברים עם או אותו פלסמיד או פלסמיד שונה ולאחר מכן להחיל את ההלם כמו בשלב 3.9. כאשר כל הגורים בצד אחד של הרחם מוזרקים, להסיר את הצד השני של הרחם מהבטן של הנקבה ולאחר מכן להחליף את הצד המוכן ללשמור אותו חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור שני הצדדים של הרחם לנזהר לשמור המשטח לח עם מי מלח ולא להפעיל לחץ רב מדי על מנת למנוע טראומה לצ&#39;קים מי השפיר הנשי. לתפור את שכבת השריר נסגרה באמצעות תפר רציף פשוט. סיכות העור סגור. אם סיכות אינן זמינות, לתפור את העור עם תפר שהופסק פשוט. (איור 1 ט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד suturing, בהדרגה להנמיך את isoflurane לאפשר ההרדמה של הנקבה בהריון כדי להבהיר. הערה: זה יזרז עוררות של הסכר לאחר הניתוח הוא מוחלט; שמירה על הנקבה הרדים לזמן קצר ביותר אפשרי ישפר הישרדות עובר. זמן ניתוח כולל, החל מכאשר הנקבה היא מורדמת ראשון, צריך להיות כ 30 דקות. </li></ol> 4. טפול עוקב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הנקבה נתפרה בחממה או על כרית חימום להתאושש מהרדמה. מיטתה במצעים נקיים ומניח את הג&#39;ל התאוששות סטנדרטי בכלוב לשמור על לחות. לניהול כאב לאחר ניתוח, לתת שלוש מנות הנשיות של עצירות (0.05 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) בשעה 8 במרווחי שעות לאחר ניתוח, ולאחר מכן ארבע מנות נוספות במרווחים של 12 שעות. </li></ol> 5. מוח קציר ניתן לקצור מוח בכל גיל עד בגרות: הערה. הבא חללאיסוף מוח לפני הלידה. שים לב שברגע שהגורים נולדים, כדי בתוך הרחם הולכים לאיבוד, אז או שכל גור בהמלטה חייב להיות מוזרק עם אותו פלסמיד, או שיטה אחרת של הבחנה בין שליטה וחיות ניסוי חייבת להיות המציאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן (4 ° C) הקר, מסונן paraformaldehyde 4% (PFA) לפני הרדמת החסד נשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הנקבה באמצעות זריקת intraperitoneal של מנה קטלנית של pentobarbital נתרן (100 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) ולחתוך בטן פתוחה. משוך את שני הצדדים של הרחם ולהוציא ככאשר גורים היו בתחילה הזריקו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה שבו כל הגורים קיבלו את אותו פלסמיד, כגון כאשר הזרקת Cre להמלטה מהונדס, כדי עובר הוא לא חשוב, לכן לחתוך את הרחם מתוך הנקבה והמקום בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גורים הוזרקו עם פלסמידים שונים, להיות בטוח כדי לאתר כל גור, וציינו כל גורים מתים, ולקבוע אילו הוזרקו שליטה וexperimenפלסמידים טל לפני הסרת הרחם מהמין הנקבה. להיות זהיר כדי לעקוב אחר שהגור שייך לאיזו קבוצה לאחר הרחם הוא בPBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל גור בנפרד, לערוף עם מספריים חדים או סכין גילוח ולמקם את הראש בPBS. במקרה של עכברים הטרנסגניים, לאסוף דגימות רקמה לgenotyping ולשמור על כל ראש נפרד, כגון בצלחת 12 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בהיקף לנתח, להסיר את המוח מהגולגולת, נזהר שלא ניק הקליפה או לקרוע את קו האמצע. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לבדוק אם יש לי המוח GFP + תיקון, מצביע על כך שהם electroporated בהצלחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המוח על ידי טבילה בPFA ב 4 ° C למשך לילה. הערה: בדוק את המוח לביטוי של GFP לפני הקיבוע מאז PFA לעתים קרובות מרווה את האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח Cryoprotect באמצעות טבילה בסוכרוז 20% לפחות שלושה ימים לפני ההקפאה. השתמש בשיפוע סוכרוז 10%, 15% ו -20% (24 שעות בכל פתרון) to למנוע נזק לרקמות כתוצאה מלחץ האוסמוטי. אחסן את המוח קפוא ב -80 ° C ולגזור על cryostat ב10-14 מיקרומטר חלקים עבים. </li></ol> 6. Co-צביעה עם אנטי-GFP הערה: אם אחזור אנטיגן הוא הכרחי על מנת לשתף את כתם עם אנטי-GFP, חשוב להשתמש בפרוטוקול אחזור אנטיגן עדין שאינו פוגע באות ה- GFP. פרוטוקולים אחזור אנטיגן חלקם קשים מדי לשימוש בשילוב עם צביעת GFP (אפילו עם נוגדן כנגד GFP). חומצת לימון בסיסית טיפול מראש לפני היישום של הנוגדן הראשוני הוא מוצלח ביותר לepitopes 24. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 0.01 מ &#39;של חומצת הלימון בDDH 2 O. pH 6 באמצעות מד pH מכויל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצת לימון חום בחדר צביעה במיקרוגל או אמבט מים עד חומצות לימון מגיעה 75-80 מעלות צלזיוס. שים שקופיות בתא מכתים במשך 10-15 דקות. לשמור על טמפרטורה יציבה כככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בPBS3x עבור 3 דקות בטמפרטורת חדר. החל הנוגדן הראשוני ולהמשיך עם immunostaining לפי פרוטוקול סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת כריתת תיווך Cre על ידי שיתוף תיוג לGFP והגן של עניין כדי לאשר להפיל (איור 3 א). </li></ol>

<ol>
	<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration.">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain.">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+neuronal+migration.">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li><li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+requirement+for+Rb/E2F3+in+neuronal+migration:+evidence+for+cell+cycle-independent+functions.">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li><li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li><li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis.">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li><li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex.">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse.">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors.">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li><li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2.">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li><li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression.">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation.">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li><li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro.">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons.">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells.">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 .</li><li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express.">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeting+in+mice:+a+review.">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li><li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein,+Rb,+in+neuronal+migration.">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li><li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis.">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li><li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons.">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li><li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression.">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 .</li><li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

שניים מהאתגרים העיקריים בביצוע בelectroporations ברחם הם 1) מניעה קטלני עובר ו 2) הפחתת שונות בין electroporations. אחד הגורמים החשובים ביותר במניעה קטלנית הוא איכות מחט, כמחטים קהות לגרום יותר נזק לעובר. בעת חיתוך המחט, לשמור על קצה זמן רב ככל האפשר בזמן שעדיין מאפשר אגל גלוי של 0....

הגירת רדיאלי היא תהליך מרכזי בהתפתחות קליפת המוח מוקדמת. זה תלוי במגוון גורמים אוטונומיים תא, כגון יציאה נכונה mitotic והבחנה עצבית, קוטביות תא, רגולציה של דינמיקת cytoskeletal וביטוי של קולטנים הטרנסממברני, כמו גם גורמים אוטונומיים שאינו תא, כגון היווצרות פיגום גליה רדיאלי ו הפרשת ההדרכה נודדת מולקולות 1-3. מאז שיבוש של כל אחד ממנגנונים אלה יכולים לפגוע בהעברה עצבית במודל של עכברים מהונדס 4-8, קביעת הסיבה הבסיסית של פגם בהגירה יכולה להיות תהליך מורכב וקשה. ברחם electroporation (IUE) ניתן להשתמש כדי להשלים ולפשט פרשנות של הפנוטיפ של מודל נוק-אאוט גנטי ובכך להבהיר מנגנונים חשובים הנדרשים להגירת רדיאלי 7,9-11. Electroporation ברחם (IUE) הוא התהליך שבו carryi פלסמיד<html> ng שני גן של עניין וכתב מוזרק לתוך החדר במוח של עובר עכבר או חולדה ולאחר מכן נשאב לתוך התאים המצפים את החדר באמצעות שימוש 12-14 זרם חשמלי. הדבר זה מאפשר לחוקר לנתח את ההשפעה של למעלה או למטה רגולציה של גן של עניין בפיתוח או פונקציה של נוירונים electroporated. בעקבות IUE, יכול להיות מעובד מוח אימונוהיסטוכימיה 7,9-11, תרבות אלקטרופיזיולוגיה 15 או תא 16,17. היתרון העיקרי של IUE הוא שהוא מאפשר למניפולציה מאוד ספציפית של ביטוי גנים. יתר על כן, IUE ניתן להשתמש כדי למקד לאזור מסוים של המוח המתפתח דרך נוכחי (איור 2) בבימויו. גם IUE יכול לשמש יעד סוג תא ספציפי באמצעות הזרקה של פלסמידים שנשאו גנים תחת שליטת יזמים שונים או מערכות הפעלת פלסמיד (ביטוי טטרציקלין מושרה גן הוא דוגמא) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE יכול לשמש בשילוב עם מערכת כריתת גן תיווך Cre-לקס 7-9,11,22. פלסמיד המכיל גן המקודד את ההודעה לחלבון Cre ניתן electroporated להומוזיגוטים עובר לאלל floxed ( שבאזורי הגן או DNA ספציפי מוקף שני אתרי loxP לרקומבינציה DNA בתיווך Cre). לאחר מכן Cre יגרום רקומבינציה של הגן של עניין במיוחד במבשרים עצביים electroporated, שהניבו בנוק-אאוט של floxed allele.The ההשפעה אז יכול להיות למד חלבון מציאה על הגירה ופיתוח בתוך נוירונים בודדים עצביים. Electroporation של Cre גורמת רקומבינציה באוכלוסייה קטנה של תאים שנפגעו, עוזבת את הסביבה תומכת בשלמותה. בניגוד לכך, ביטוי רקמות הספציפיות של Cre תחת שליטה של ​​סוג תא מסוים אמרגן, מתרחש לאורך כל הרקמה, כך ששניהם neuroblasts הנודד והסביבה עלולים להיות מושפעים. כך, juxtaposition של שתי גישות אלה יכול לקבוע אם פגם הגירה ניתנה בשל תא מנגנונים שאינם אוטונומיים אוטונומיים או תא. הגירה פגומה בשתי מערכות הניסיוניות עולה כי תוצאות הפנוטיפ שנצפו ממנגנון אוטונומי תא; הגירה נורמלית הבא electroporation של Cre עם הגירה פגומה במודל Cre רקמות ספציפי מצביעה על כך שהגן של העניין פועל באמצעות מנגנון אוטונומי שאינו תא. גם IUE ניתן להשתמש כדי לבצע ניסויי הצלה על ידי electroporating גני אינטראקציה פוטנציאליים לבעלי חיים לדפוק את 7,9,10. לדוגמא, חוקר יכול לנסות להציל את הפנוטיפ הגירה במודל מהונדס על ידי electroporating יעד במורד הזרם וקביעה אם פגם ההגירה זו תוקן בנוירונים electroporated. זה יש יתרון נוסף שחילוץ מוצלח מצביע על כך שהגירה רגילה ניתן לשחזר על ידי המניפולציה ביטוי חלבון בSPEנוירון cific, למרות שהסביבה היא עדיין חסרה לגן הממוקד. שוב, גישה זו היא יותר זמן ועלות אפקטיבי מאשר חצייה או יצירת קווים מהונדסים, עם היתרון הנוסף של קביעה אם המנגנון הפגום הוא תא אוטונומי. IUE ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר נדידת נוירונים דרך electroporation של פלסמיד כתב לעוברי לדפוק את (איור 4C). כמו שרק תאי העצב המרפדים את החדר בזמן הניתוח הם electroporated 17, IUE יכול לשמש למעקב נוירונים נולדו בזמן מסוים עם היתרון של הדמיה של המורפולוגיה שלהם in vivo. לבסוף, ניתן להשתמש IUE למקד אזורים במוח כגון telencephalon המדיאלי או גב, היפוקמפוס או רוממות ganglionic (איור 2). זה נותן לי חוקרי הכח לחקור את תפקוד גן בעצמאי אזור מסוים של סיבוכי תוצאה רצוייםing מחלבון מציאה במבנים שכנים. חלבון רטינובלסטומה (PRB), p107 וp130 מרכיבים את משפחת חלבון כיס ומבוסס היטב רגולטורים של יציאת מחזור התא. עם זאת, יש ראיות גוברת שחלבונים אלה גם להסדיר היבטים עצמאיים מחזור התא של התפתחות עצבית. כפי שהראינו בעבר, גדוד המשטרה וp107 לשחק תפקיד מכריע בשני 4,23 המשיקים וההגירה רדיאלי 6. הנה, אנחנו מדגימים את התפקיד של גדוד משטרת בני משפחת חלבון הכיס וp107 על הגירה עצבית 6 כדי להדגים את השימוש בelectroporation ברחם של Cre במודל מהונדס. לסיכום, IUE מספק דרך רבת עוצמה של ניתוח השפעות אוטונומיות תא של מחיקת גן (או ביטוי יתר). בשילוב עם רקמה ספציפית לדפוק את מודלים, IUE יכול לספק מידע נוסף בנוגע למנגנוני השליטה הגירה עצבית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

מחיקה גנטית באמצעות מערכת Cre-לקס בקווי עכבר מהונדסים היא כלי רב עוצמה המשמש ללמוד תפקוד חלבון. עם זאת, למעט בדגמי Cre ספציפיים מאוד, מחיקה של חלבון בכל אוכלוסיית רקמה או תא מוביל לעתים קרובות לפנוטיפים מורכבים הנובעים ממנגנוני אינטראקציה מרובים. קביעה אם תוצאות פנוטיפ משיבוש מנגנון אוטונומי תא, שהוא מהותי לתא בשאלה, או ממנגנון אוטונומי שאינו תא, אשר יביא מירידת הערך של הסביבה של התא ש, יכולות להיות קשות להבחין. כדי לקבל תובנה תפקוד חלבון בהקשר in vivo, electroporation ברחם (IUE) מחיקת גן מאפשר בתת-קבוצה קטנה של תאים בקליפת המוח מתפתח או אזור במוח שנבחר אחר. IUE יכול לשמש כדי להתמקד באזורים מסוימים במוח, כולל telencephalon הגב, telencephalon המדיאלי, היפוקמפוס, או רוממות ganglionic. זה מקל על o תצפיתf ההשלכות של מחיקת גן אוטונומית תא בהקשר של סביבה בריאה. המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד IUE ניתן להשתמש כדי לנתח פגם בהגירה הרדיאלי בקו עכבר מהונדס floxed, עם דגש על הבחנה בין ההשפעות האוטונומיות אוטונומיות ולא-תא התא של מחיקת חלבון. על ידי השוואת פנוטיפ כתוצאה ממחיקת הגן בתוך כל הקליפה לעומת מחיקת גן תיווך IUE באוכלוסיית תא מוגבלת, להבין טוב יותר את תפקוד חלבון בהתפתחות המוח ניתן להשיג יותר מאשר באמצעות אחת טכניקה בבידוד.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

אינדוקציה של חלבונים באמצעות מחיקה<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation להגדיר גירעונות בעצביים הגירה במודלים מהונדסים

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.1K Views.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Video: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...