We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

הערה: כל הניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת האתיקה הטיפול בבעלי חיים של אוטווה, הקפדה על ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. הכנה וחומרים 1. טרום ניתוחיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פלסמידים באמצעות MegaPrep Qiagen פי הפרוטוקול של היצרן. Innoculate לפחות 400 מיליליטר של מרק LB עם חיידקים הפכו להבטחת תשואת DNA גבוהה ודגירת הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד הגלול ב100-200 μl TE לריכוז סופי של לפחות 5 מיקרוגרם / μl. DNA Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. אם הריכוז נמוך מדי, לא לזרז וresuspend כמו זה יכול להוסיף זיהומים. להתחיל מחדש עם הכנה חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניתוח, לדלל פלסמיד בודד (Cre-GFP למשל) עד ​​2 מיקרוגרם / μl במים סטריליים עם 1 μl של 0.1% (w / v) צבע ירוק מהיר לכל 10 או 20 μl של פתרון פלסמיד מדולל. אם GFPואת הגן של ריבית ללהיות שותף electroporated בפלסמידים נפרדים, להזריק פלסמיד GFP ופלסמיד הנושא את הגן של ריבית בשיעור של 1: 4 למקסם את הסיכוי שכל התאים מסומנים עם GFP הם שיתוף electroporated עם שני פלסמידים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך צינורות microcapillary הזכוכית (קוטר חיצוני 1 מ&quot;מ - להלן כפי מחטים) על חולץ מחט סטנדרטי, באמצעות משיכה צעד אחד בגיל 62 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי חבילה כירורגית המכילה את הדברים הבאים: מחזיקי המחט, מפשק פצע, מלקחיים, מספריים לניתוח, מספריים למחטים, סיכות, סיכות, גזה, כיסויי פצע, וילונות כירורגי (איור 1 א &#39;, ב&#39;; לוח חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כלים אחרים הנדרשים: electroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 או 7 מ&quot;מ), מלח, תפר, מזרק 5 מיליליטר (לוח חומרים). </li></ol> 2. הכן העכבר לכירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניהול כאב, להזריק מתוזמן-p<html> עכבר regnant עם עצירות (0.05 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) שעה אחת לפני הניתוח. החל פרוטוקול זה לעכברים מתוזמן בכל מקום בין עוברי היום 12.5 (E12.5) לE17.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעצות פיפטה microloader לגבות עומס משך מחטים עם פתרון פלסמיד. אין למלא את כל הדרך לקצה המחט עדיין כמו זה יגרום המחט ללהיות סתומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש עכבר באמצעות 2-5% גז isoflurane עם L 1 O / 2 דקות. ברגע הנייח, למקם במסיכת פנים ולהחיל משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות. הזרק עם 1 מיליליטר תמיסת מלח (0.9% NaCl) תת עורי בגב. הערה: כאשר עובד עם גז isoflurane, להשתמש נבלות גז לשחזר גז עודף ולמנוע ממנו לברוח לחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן. לשטוף בטן עם לשפשף Chlorohexadine, לשטוף עם מים, ולהחיל פתרון הכנה סופי של chlorohexadine ו -70% אתנול. עכבר כיסוי עם וילון או גזה סטרילית כדי לכסות פרווה אבל להשאיר חשוף בטן (איור 1 ג, ד). </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. ברחם electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בעור מעל הבטן בין השדיים נמוכים יותר. למשוך את העור משכבת ​​השריר הבסיסית על ידי קריעת רקמות חיבור, ואז לחתוך דרך הצפק לתוך חלל הבטן לאורך alba המנחה. הכנס את מפשק הפצע למשוך את הקצוות של הפצע בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם מחלל הבטן ולהוציא אותו כפי שמוצגים (1E איור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גורים שונים להיות מוזרקים עם פלסמידים שונים (כגון GFP לעומת GFP עם הגן של עניין), לספור את הגורים בכל צד ולהחליט אילו וכמה להזריק עם כל פלסמיד. להחליף צד אחד של הרחם בחזרה לתוך הבטן כדי לשמור על העוברים חמים ומשומנים. מייד להרטיב את הרחם החשוף עם מי מלח (רצוי חימם לטמפרטורת גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הזרקת כל הגורים באותה פלסמיד (למשל, כאשר הזרקת Cre-GFP לעוברי מהונדסים) only להסיר קרן אחת של הרחם בזמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מחט טעונה בראש האחיזה של שרביט ההזרקה ובזהירות לחתוך את הקצה עם מספריים כירורגיות קטנים או מלקחיים בסדר. חותך את הקצה כך שהמחט נשארת זמן רב ככל האפשר בזמן שעדיין מאפשר נוזל לעבור (איור 1Ji-ד &#39;). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם אורך של הזרקה (בשניות) והזרקה בלחץ על microinjector כך שאגל עדיין נראה בקלות קטנה של 0.1-0.2 μl מופיע בקצה המחט, כאשר ההנעה הרגל נלחץ. לשמור על הנפח של טיפה זו עקבית ככל האפשר בין מחטים שונות. הערה: שלב זה הוא חיוני להישרדות עובר (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפרמטרים הבאים להזרקת Femtojet: הזרקה בלחץ (pi) = 250-300 hPa; זמן הזרקה (ti) = .8-1.2 שניות; לחץ פיצוי = 10-50 hPa. במידת הצורך, להתאים את הפרמטרים אלה כדי להתאים וריאציה בין מחטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sלבחור עובר ובעדינות למקם אותה על הגב שלה, ראשו המוטה כלפי מעלה (איור 1F). הערה: זה עשויה לדרוש הפיכה או הסטת העובר; היזהר שלא להפעיל לחץ רב מדי ולהימנע מקרע של השק השפיר ואילו מניפולציה העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהעובר נמצא במקום, לאתר את החדר, המציג כמקביל צל בצורה חצי סהר לסינוס sagittal. לגעת בקצה המחט אל הרחם מעל החדר בזווית קלה ולהנחות את המחט דרך דופן הרחם. כמות הלחץ הנדרש תלויה בחדות של המחט. לדחוף את המחט דרך הקליפה לתוך החדר. הערה: למרות שיש רק לעתים נדירות כל התנגדות לגילוי נוספת, ראשו של העובר הוא דחף לעתים קרובות משם מעט ואז נרתע כמחט עוברת דרך הקליפה לתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את ההנעה הרגל להזריק פתרון פלסמיד. תמשיך לשאוב עד אזור ירוק גלוי ועומד בצורת קשת של החדר (איור 1G). בעוברים צעירים (E12.5 לE14.5) הצבע לעתים קרובות מפוזר לתוך החדר הנגדי. הערה: מספר המשאבות תלוי בקוטר של קצה המחט, גיל העובר (והגודל של החדר וכתוצאה מכך) והרצוי נפח ההזרקה. שמרו נפח מוזרק עקבי ככל האפשר בין עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק שלושה או ארבעה עוברים. שמור את כל העוברים שנחשפו לחים עם מי מלח בכל הליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לעוברים הראשונים הזריקו ולמקם את המשוטים כך שהאלקטרודה החיובית תמשוך את הפלסמיד לאזור הרצוי של המוח (איור 1H). זווית האלקטרודה השלילית, כך שהמסלול הקצר בין האלקטרודות מעבירה ישירות דרך המבנה הממוקד עבור electroporation (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמשוטים נמצאים במקום, להחיל את ההלם. בהתאם לגיל והגודל של העוברים, להשתמש 5 פולסים של 35-50 V (ראה T1 מסוגל). השתמש בפרמטרי electroporation הבאים: אורך הפולס של 5 אלפיות שניים עם מרווח דופק של 950 אלפיות שניים. חזור עם כל העוברים המוזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קצה המחט טעונה מראש חדשה כמו בשלב 3.3 כמחט האחרונה סביר מיובשת וסתום במהלך שלב 3.9. להזריק את הסדרה הבאה של שלושה או ארבעה עוברים עם או אותו פלסמיד או פלסמיד שונה ולאחר מכן להחיל את ההלם כמו בשלב 3.9. כאשר כל הגורים בצד אחד של הרחם מוזרקים, להסיר את הצד השני של הרחם מהבטן של הנקבה ולאחר מכן להחליף את הצד המוכן ללשמור אותו חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור שני הצדדים של הרחם לנזהר לשמור המשטח לח עם מי מלח ולא להפעיל לחץ רב מדי על מנת למנוע טראומה לצ&#39;קים מי השפיר הנשי. לתפור את שכבת השריר נסגרה באמצעות תפר רציף פשוט. סיכות העור סגור. אם סיכות אינן זמינות, לתפור את העור עם תפר שהופסק פשוט. (איור 1 ט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד suturing, בהדרגה להנמיך את isoflurane לאפשר ההרדמה של הנקבה בהריון כדי להבהיר. הערה: זה יזרז עוררות של הסכר לאחר הניתוח הוא מוחלט; שמירה על הנקבה הרדים לזמן קצר ביותר אפשרי ישפר הישרדות עובר. זמן ניתוח כולל, החל מכאשר הנקבה היא מורדמת ראשון, צריך להיות כ 30 דקות. </li></ol> 4. טפול עוקב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הנקבה נתפרה בחממה או על כרית חימום להתאושש מהרדמה. מיטתה במצעים נקיים ומניח את הג&#39;ל התאוששות סטנדרטי בכלוב לשמור על לחות. לניהול כאב לאחר ניתוח, לתת שלוש מנות הנשיות של עצירות (0.05 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) בשעה 8 במרווחי שעות לאחר ניתוח, ולאחר מכן ארבע מנות נוספות במרווחים של 12 שעות. </li></ol> 5. מוח קציר ניתן לקצור מוח בכל גיל עד בגרות: הערה. הבא חללאיסוף מוח לפני הלידה. שים לב שברגע שהגורים נולדים, כדי בתוך הרחם הולכים לאיבוד, אז או שכל גור בהמלטה חייב להיות מוזרק עם אותו פלסמיד, או שיטה אחרת של הבחנה בין שליטה וחיות ניסוי חייבת להיות המציאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן (4 ° C) הקר, מסונן paraformaldehyde 4% (PFA) לפני הרדמת החסד נשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הנקבה באמצעות זריקת intraperitoneal של מנה קטלנית של pentobarbital נתרן (100 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) ולחתוך בטן פתוחה. משוך את שני הצדדים של הרחם ולהוציא ככאשר גורים היו בתחילה הזריקו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה שבו כל הגורים קיבלו את אותו פלסמיד, כגון כאשר הזרקת Cre להמלטה מהונדס, כדי עובר הוא לא חשוב, לכן לחתוך את הרחם מתוך הנקבה והמקום בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גורים הוזרקו עם פלסמידים שונים, להיות בטוח כדי לאתר כל גור, וציינו כל גורים מתים, ולקבוע אילו הוזרקו שליטה וexperimenפלסמידים טל לפני הסרת הרחם מהמין הנקבה. להיות זהיר כדי לעקוב אחר שהגור שייך לאיזו קבוצה לאחר הרחם הוא בPBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל גור בנפרד, לערוף עם מספריים חדים או סכין גילוח ולמקם את הראש בPBS. במקרה של עכברים הטרנסגניים, לאסוף דגימות רקמה לgenotyping ולשמור על כל ראש נפרד, כגון בצלחת 12 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בהיקף לנתח, להסיר את המוח מהגולגולת, נזהר שלא ניק הקליפה או לקרוע את קו האמצע. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לבדוק אם יש לי המוח GFP + תיקון, מצביע על כך שהם electroporated בהצלחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המוח על ידי טבילה בPFA ב 4 ° C למשך לילה. הערה: בדוק את המוח לביטוי של GFP לפני הקיבוע מאז PFA לעתים קרובות מרווה את האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח Cryoprotect באמצעות טבילה בסוכרוז 20% לפחות שלושה ימים לפני ההקפאה. השתמש בשיפוע סוכרוז 10%, 15% ו -20% (24 שעות בכל פתרון) to למנוע נזק לרקמות כתוצאה מלחץ האוסמוטי. אחסן את המוח קפוא ב -80 ° C ולגזור על cryostat ב10-14 מיקרומטר חלקים עבים. </li></ol> 6. Co-צביעה עם אנטי-GFP הערה: אם אחזור אנטיגן הוא הכרחי על מנת לשתף את כתם עם אנטי-GFP, חשוב להשתמש בפרוטוקול אחזור אנטיגן עדין שאינו פוגע באות ה- GFP. פרוטוקולים אחזור אנטיגן חלקם קשים מדי לשימוש בשילוב עם צביעת GFP (אפילו עם נוגדן כנגד GFP). חומצת לימון בסיסית טיפול מראש לפני היישום של הנוגדן הראשוני הוא מוצלח ביותר לepitopes 24. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 0.01 מ &#39;של חומצת הלימון בDDH 2 O. pH 6 באמצעות מד pH מכויל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצת לימון חום בחדר צביעה במיקרוגל או אמבט מים עד חומצות לימון מגיעה 75-80 מעלות צלזיוס. שים שקופיות בתא מכתים במשך 10-15 דקות. לשמור על טמפרטורה יציבה כככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בPBS3x עבור 3 דקות בטמפרטורת חדר. החל הנוגדן הראשוני ולהמשיך עם immunostaining לפי פרוטוקול סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת כריתת תיווך Cre על ידי שיתוף תיוג לGFP והגן של עניין כדי לאשר להפיל (איור 3 א). </li></ol>

<ol>
	<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration.">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain.">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+neuronal+migration.">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li><li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+requirement+for+Rb/E2F3+in+neuronal+migration:+evidence+for+cell+cycle-independent+functions.">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li><li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li><li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis.">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li><li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex.">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse.">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors.">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li><li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2.">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li><li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression.">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation.">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li><li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro.">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons.">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells.">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 .</li><li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express.">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeting+in+mice:+a+review.">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li><li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein,+Rb,+in+neuronal+migration.">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li><li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis.">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li><li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons.">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li><li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression.">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 .</li><li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

שניים מהאתגרים העיקריים בביצוע בelectroporations ברחם הם 1) מניעה קטלני עובר ו 2) הפחתת שונות בין electroporations. אחד הגורמים החשובים ביותר במניעה קטלנית הוא איכות מחט, כמחטים קהות לגרום יותר נזק לעובר. בעת חיתוך המחט, לשמור על קצה זמן רב ככל האפשר בזמן שעדיין מאפשר אגל גלוי של 0....

הגירת רדיאלי היא תהליך מרכזי בהתפתחות קליפת המוח מוקדמת. זה תלוי במגוון גורמים אוטונומיים תא, כגון יציאה נכונה mitotic והבחנה עצבית, קוטביות תא, רגולציה של דינמיקת cytoskeletal וביטוי של קולטנים הטרנסממברני, כמו גם גורמים אוטונומיים שאינו תא, כגון היווצרות פיגום גליה רדיאלי ו הפרשת ההדרכה נודדת מולקולות 1-3. מאז שיבוש של כל אחד ממנגנונים אלה יכולים לפגוע בהעברה עצבית במודל של עכברים מהונדס 4-8, קביעת הסיבה הבסיסית של פגם בהגירה יכולה להיות תהליך מורכב וקשה. ברחם electroporation (IUE) ניתן להשתמש כדי להשלים ולפשט פרשנות של הפנוטיפ של מודל נוק-אאוט גנטי ובכך להבהיר מנגנונים חשובים הנדרשים להגירת רדיאלי 7,9-11. Electroporation ברחם (IUE) הוא התהליך שבו carryi פלסמיד<html> ng שני גן של עניין וכתב מוזרק לתוך החדר במוח של עובר עכבר או חולדה ולאחר מכן נשאב לתוך התאים המצפים את החדר באמצעות שימוש 12-14 זרם חשמלי. הדבר זה מאפשר לחוקר לנתח את ההשפעה של למעלה או למטה רגולציה של גן של עניין בפיתוח או פונקציה של נוירונים electroporated. בעקבות IUE, יכול להיות מעובד מוח אימונוהיסטוכימיה 7,9-11, תרבות אלקטרופיזיולוגיה 15 או תא 16,17. היתרון העיקרי של IUE הוא שהוא מאפשר למניפולציה מאוד ספציפית של ביטוי גנים. יתר על כן, IUE ניתן להשתמש כדי למקד לאזור מסוים של המוח המתפתח דרך נוכחי (איור 2) בבימויו. גם IUE יכול לשמש יעד סוג תא ספציפי באמצעות הזרקה של פלסמידים שנשאו גנים תחת שליטת יזמים שונים או מערכות הפעלת פלסמיד (ביטוי טטרציקלין מושרה גן הוא דוגמא) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE יכול לשמש בשילוב עם מערכת כריתת גן תיווך Cre-לקס 7-9,11,22. פלסמיד המכיל גן המקודד את ההודעה לחלבון Cre ניתן electroporated להומוזיגוטים עובר לאלל floxed ( שבאזורי הגן או DNA ספציפי מוקף שני אתרי loxP לרקומבינציה DNA בתיווך Cre). לאחר מכן Cre יגרום רקומבינציה של הגן של עניין במיוחד במבשרים עצביים electroporated, שהניבו בנוק-אאוט של floxed allele.The ההשפעה אז יכול להיות למד חלבון מציאה על הגירה ופיתוח בתוך נוירונים בודדים עצביים. Electroporation של Cre גורמת רקומבינציה באוכלוסייה קטנה של תאים שנפגעו, עוזבת את הסביבה תומכת בשלמותה. בניגוד לכך, ביטוי רקמות הספציפיות של Cre תחת שליטה של ​​סוג תא מסוים אמרגן, מתרחש לאורך כל הרקמה, כך ששניהם neuroblasts הנודד והסביבה עלולים להיות מושפעים. כך, juxtaposition של שתי גישות אלה יכול לקבוע אם פגם הגירה ניתנה בשל תא מנגנונים שאינם אוטונומיים אוטונומיים או תא. הגירה פגומה בשתי מערכות הניסיוניות עולה כי תוצאות הפנוטיפ שנצפו ממנגנון אוטונומי תא; הגירה נורמלית הבא electroporation של Cre עם הגירה פגומה במודל Cre רקמות ספציפי מצביעה על כך שהגן של העניין פועל באמצעות מנגנון אוטונומי שאינו תא. גם IUE ניתן להשתמש כדי לבצע ניסויי הצלה על ידי electroporating גני אינטראקציה פוטנציאליים לבעלי חיים לדפוק את 7,9,10. לדוגמא, חוקר יכול לנסות להציל את הפנוטיפ הגירה במודל מהונדס על ידי electroporating יעד במורד הזרם וקביעה אם פגם ההגירה זו תוקן בנוירונים electroporated. זה יש יתרון נוסף שחילוץ מוצלח מצביע על כך שהגירה רגילה ניתן לשחזר על ידי המניפולציה ביטוי חלבון בSPEנוירון cific, למרות שהסביבה היא עדיין חסרה לגן הממוקד. שוב, גישה זו היא יותר זמן ועלות אפקטיבי מאשר חצייה או יצירת קווים מהונדסים, עם היתרון הנוסף של קביעה אם המנגנון הפגום הוא תא אוטונומי. IUE ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר נדידת נוירונים דרך electroporation של פלסמיד כתב לעוברי לדפוק את (איור 4C). כמו שרק תאי העצב המרפדים את החדר בזמן הניתוח הם electroporated 17, IUE יכול לשמש למעקב נוירונים נולדו בזמן מסוים עם היתרון של הדמיה של המורפולוגיה שלהם in vivo. לבסוף, ניתן להשתמש IUE למקד אזורים במוח כגון telencephalon המדיאלי או גב, היפוקמפוס או רוממות ganglionic (איור 2). זה נותן לי חוקרי הכח לחקור את תפקוד גן בעצמאי אזור מסוים של סיבוכי תוצאה רצוייםing מחלבון מציאה במבנים שכנים. חלבון רטינובלסטומה (PRB), p107 וp130 מרכיבים את משפחת חלבון כיס ומבוסס היטב רגולטורים של יציאת מחזור התא. עם זאת, יש ראיות גוברת שחלבונים אלה גם להסדיר היבטים עצמאיים מחזור התא של התפתחות עצבית. כפי שהראינו בעבר, גדוד המשטרה וp107 לשחק תפקיד מכריע בשני 4,23 המשיקים וההגירה רדיאלי 6. הנה, אנחנו מדגימים את התפקיד של גדוד משטרת בני משפחת חלבון הכיס וp107 על הגירה עצבית 6 כדי להדגים את השימוש בelectroporation ברחם של Cre במודל מהונדס. לסיכום, IUE מספק דרך רבת עוצמה של ניתוח השפעות אוטונומיות תא של מחיקת גן (או ביטוי יתר). בשילוב עם רקמה ספציפית לדפוק את מודלים, IUE יכול לספק מידע נוסף בנוגע למנגנוני השליטה הגירה עצבית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

מחיקה גנטית באמצעות מערכת Cre-לקס בקווי עכבר מהונדסים היא כלי רב עוצמה המשמש ללמוד תפקוד חלבון. עם זאת, למעט בדגמי Cre ספציפיים מאוד, מחיקה של חלבון בכל אוכלוסיית רקמה או תא מוביל לעתים קרובות לפנוטיפים מורכבים הנובעים ממנגנוני אינטראקציה מרובים. קביעה אם תוצאות פנוטיפ משיבוש מנגנון אוטונומי תא, שהוא מהותי לתא בשאלה, או ממנגנון אוטונומי שאינו תא, אשר יביא מירידת הערך של הסביבה של התא ש, יכולות להיות קשות להבחין. כדי לקבל תובנה תפקוד חלבון בהקשר in vivo, electroporation ברחם (IUE) מחיקת גן מאפשר בתת-קבוצה קטנה של תאים בקליפת המוח מתפתח או אזור במוח שנבחר אחר. IUE יכול לשמש כדי להתמקד באזורים מסוימים במוח, כולל telencephalon הגב, telencephalon המדיאלי, היפוקמפוס, או רוממות ganglionic. זה מקל על o תצפיתf ההשלכות של מחיקת גן אוטונומית תא בהקשר של סביבה בריאה. המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד IUE ניתן להשתמש כדי לנתח פגם בהגירה הרדיאלי בקו עכבר מהונדס floxed, עם דגש על הבחנה בין ההשפעות האוטונומיות אוטונומיות ולא-תא התא של מחיקת חלבון. על ידי השוואת פנוטיפ כתוצאה ממחיקת הגן בתוך כל הקליפה לעומת מחיקת גן תיווך IUE באוכלוסיית תא מוגבלת, להבין טוב יותר את תפקוד חלבון בהתפתחות המוח ניתן להשיג יותר מאשר באמצעות אחת טכניקה בבידוד.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

אינדוקציה של חלבונים באמצעות מחיקה<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation להגדיר גירעונות בעצביים הגירה במודלים מהונדסים

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.2K Views.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Video: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...