We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla University of Animal Care comitato etico di Ottawa, aderendo alle linee guida del Consiglio canadese Animal Care. Preparazione 1. Pre-chirurgici e materiali <ol><li> Plasmidi Preparazione: <ol><li> Preparare plasmidi usano il Qiagen MegaPrep secondo il protocollo del produttore. Inoculare almeno 400 ml di brodo LB con batteri trasformati per garantire una resa elevata DNA e incubare durante la notte. </li><li> Risospendere plasmide in 100-200 microlitri TE ad una concentrazione finale di almeno 5 mg / mL. Aliquota DNA e conservare a -20 ° C. Se la concentrazione è troppo bassa, non precipitare e risospendere come questo può aggiungere impurità. Iniziare con una nuova preparazione. </li><li> Prima della chirurgia, diluire un singolo plasmide (Cre-GFP per esempio) per 2 mg / mL in acqua sterile con 1 ml di 0,1% (w / v) colorante Fast verde per 10 o 20 ml di soluzione diluita plasmide. Se GFPe il gene di interesse sono da co-elettroporate su plasmidi separati, iniettare il plasmide GFP e il plasmide che porta il gene di interesse ad un rapporto di 1: 4 per massimizzare la probabilità che tutte le celle contrassegnate con GFP sono co-elettroporate con entrambi plasmidi. </li></ol></li><li> Tirare i tubi microcapillari di vetro (diametro esterno 1 mm - di seguito denominati aghi) su un estrattore standard di ago, utilizzando un unico tiro passo a 62 ° C. </li><li> Autoclave una confezione chirurgica contenente i seguenti: porta-aghi, divaricatore ferita, pinze, forbici per la chirurgia, forbici per aghi, cucitrice, graffette, garza, le coperture della ferita, teli chirurgici (Figura 1A, B; Materials Table). </li><li> Raccogliere altri strumenti necessari: elettroporatore, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 o 7 mm), saline, sutura, siringa da 5 ml (Materials Table). </li></ol> 2. Preparare Mouse for Surgery <ol><li> Per la gestione del dolore, iniettare un-p temporizzatoMouse regnant con buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) un&#39;ora prima dell&#39;intervento. Applicare questo protocollo per topi a tempo ovunque da embrionale giorno 12,5 (E12.5) a E17.5. </li><li> Utilizzare microloader puntali delle pipette per eseguire il carico tirato aghi con la soluzione plasmide. Non riempire fino in fondo la punta dell&#39;ago ma ciò causerebbe l&#39;ago ad occludersi. </li><li> Anaesthetize mouse usando 2-5% gas isoflurano con 1 L / min O 2. Una volta immobile, posto in maschera e applicare una pomata per gli occhi per evitare l&#39;essiccazione. Iniettare con 1 ml di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) per via sottocutanea in indietro. NOTA: Quando si lavora con gas isoflurano, utilizzare un scavenger gas di riconquistare gas in eccesso ed evitare la fuoriuscita nella stanza. </li><li> Shave addome. Lavare addome con Chlorohexadine scrub, risciacquare con acqua, e applicare una soluzione di preparazione finale del chlorohexadine e il 70% di etanolo. Mouse copertura con telo sterile o garza per coprire la pelliccia, ma lasciare l&#39;addome esposto (Figura 1C, D). </li></ol>In utero elettroporazione <ol><li> Fare un&#39;incisione nella pelle sopra l&#39;addome tra i capezzoli inferiori. Tirare la pelle lontano dallo strato muscolare sottostante strappando il tessuto connettivo, poi tagliare attraverso il peritoneo nella cavità addominale lungo la linea alba. Inserire il riavvolgitore ferita per tirare i bordi della ferita parte. </li><li> Rimuovere l&#39;utero dalla cavità addominale e stenderlo come mostrato (Figura 1E). <ol><li> Se diversi cuccioli deve essere iniettato con differenti plasmidi (come GFP vs GFP con il gene di interesse), contare i cuccioli su ogni lato e decidere quali e quanti iniettare con ciascun plasmide. Sostituire un lato dell&#39;utero posteriore nell&#39;addome per mantenere gli embrioni caldo e lubrificati. Inumidire Subito dell&#39;utero esposta con soluzione salina (preferibilmente riscaldato alla temperatura corporea). </li><li> Se iniettando tutti cuccioli con lo stesso plasmide (come quando l&#39;iniezione Cre-GFP in embrioni transgenici) only rimuovere un corno dell&#39;utero alla volta. </li></ol></li><li> Mettere un ago caricata nella testa di presa della bacchetta di iniezione e con attenzione tagliare la punta con un paio di piccole forbici chirurgiche o pinza sottile. Tagliare la punta in modo che l&#39;ago rimane più a lungo possibile, pur consentendo al fluido di passare attraverso (Figura 1Ji-iv). <ol><li> Regolare la lunghezza di iniezione (in secondi) e la pressione di iniezione sul microinjector modo che una piccola goccia e facilmente visibile di 0,1-0,2 microlitri appare sulla punta dell&#39;ago quando viene premuto il pedale paddle. Tenere il volume di questa goccia più coerente possibile tra gli aghi diversi. NOTA: questo passaggio è cruciale per la sopravvivenza degli embrioni (vedi la discussione). </li><li> Utilizzare i seguenti parametri di iniezione per la FemtoJet: iniezione di pressione (pi) = 250-300 hPa; tempo di iniezione (ti) = 0,8-1,2 sec; Pressione compensazione = 10-50 hPa. Se necessario, modificare questi parametri per accogliere variazione tra gli aghi. </li></ol></li><li> Seleggere un embrione e posizionarla delicatamente sulla schiena, la testa inclinata verso l&#39;alto (Figura 1F). NOTA: Questo può richiedere ruotando o spostando l&#39;embrione; fare attenzione a non applicare troppa pressione ed evitare la rottura del sacco amniotico durante la manipolazione dell&#39;embrione. </li><li> Una volta che l&#39;embrione è a posto, individuare il ventricolo, che presenta una forma di mezzaluna ombra parallelo al seno sagittale. Premere la punta dell&#39;ago verso l&#39;utero sopra il ventricolo con una leggera angolazione e guidare l&#39;ago attraverso la parete uterina. La quantità di pressione richiesta dipende dalla nitidezza dell&#39;ago. Spingere l&#39;ago attraverso la corteccia nel ventricolo. NOTA: Anche se vi è raramente qualsiasi ulteriore resistenza rilevabile, la testa del embrione è spesso spinto via un po &#39;e poi si ritrae, come l&#39;ago passa attraverso la corteccia nel ventricolo. </li><li> Pompare il paddle piede per iniettare la soluzione plasmide. Continuare a pompare fino a una zona verde è visibile ed è conforme alfigura dell&#39;arco del ventricolo (Figura 1G). Nei giovani embrioni (E12.5 a E14.5) il colorante spesso diffondere nel ventricolo controlaterale. NOTA: Il numero di pompe dipende dal diametro della punta dell&#39;ago, l&#39;età dell&#39;embrione (e conseguente dimensioni del ventricolo) e il volume di iniezione desiderato. Mantenere il volume iniettato più coerente possibile tra embrioni. </li><li> Iniettare tre o quattro embrioni. Tenere tutti gli embrioni esposti umide con soluzione salina durante procedura. </li><li> Ritornare alla primi embrioni iniettati e posizionare le pale in modo che l&#39;elettrodo positivo disegnare il plasmide nella regione desiderata del cervello (Figura 1H). Angle l&#39;elettrodo negativo in modo che il percorso più breve tra gli elettrodi passa direttamente attraverso la struttura mirato per elettroporazione (Figura 2). </li><li> Una volta che le pale sono a posto, applicare lo shock. A seconda dell&#39;età e delle dimensioni degli embrioni, utilizzare 5 impulsi di 35-50 V (vedi T1 grado). Utilizzare i seguenti parametri di elettroporazione: lunghezza di impulso di 5 msec, con un intervallo di impulso di 950 msec. Ripetere con tutti gli embrioni iniettati. </li><li> Tagliare la punta di nuovo ago pre-caricato come al punto 3.3, come l&#39;ultimo ago probabile secca e ostruita durante la fase 3.9. Iniettare la prossima serie di tre o quattro embrioni sia con lo stesso plasmide o un plasmide diverso e quindi applicare la scossa come al punto 3.9. Quando tutti i cuccioli in un lato dell&#39;utero vengono iniettati, rimuovere il secondo lato dell&#39;utero dall&#39;addome della femmina e quindi sostituire la parte completata per mantenerlo caldo. </li><li> Ritorno entrambi i lati dell&#39;utero alla femmina facendo attenzione a mantenere la superficie umida con soluzione fisiologica e non applicare troppa pressione per evitare traumi alle cavità amniotiche. Suturare lo strato muscolare chiusa con un semplice punto continuo. Staple la pelle chiusa. Se i punti non sono disponibili, suturare la pelle con un semplice punto interrotto. (Figura 1I) </li><li> Mentre suturing, progressivamente abbassare il isoflurano per consentire l&#39;anestesia della femmina incinta per alleggerire. NOTA: Questo accelerare l&#39;eccitazione della diga dopo l&#39;intervento chirurgico è completo; mantenendo la femmina anestetizzato per il più breve tempo possibile migliorare la sopravvivenza dell&#39;embrione. Tempo chirurgico totale, a partire da quando la femmina viene prima anestetizzato, deve essere di circa 30 min. </li></ol> 4. Aftercare <ol><li> Posizionare la femmina suturato in un incubatore o su una piastra elettrica per recuperare da anestesia. Il suo letto in biancheria pulita e posizionare un gel ripresa standard nella gabbia mantenere l&#39;idratazione. Per la gestione del dolore dopo un intervento chirurgico, dare le donne tre dosi di buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) a 8 intervalli hr dopo l&#39;intervento, poi quattro dosi supplementari a intervalli di 12 h. </li></ol> 5. Brains raccolta NOTA: Brains possono essere raccolte a qualsiasi età fino all&#39;età adulta. Si applica la seguenteper la raccolta di cervelli prima della nascita. Si noti che una volta che i cuccioli sono nati, l&#39;ordine all&#39;interno dell&#39;utero è perso, quindi o ogni pup nella lettiera deve essere iniettata con lo stesso plasmide, o un altro metodo di distinguere tra controllo e animali da esperimento deve essere messo a punto. <ol><li> Preparare a freddo (4 ° C), filtrato 4% paraformaldeide (PFA) prima eutanasia femmina. </li><li> Euthanize femmina con una iniezione intraperitoneale di una dose letale di pentobarbital sodio (100 mg / kg di peso corporeo) e tagliare addome aperto. Estrarre entrambi i lati dell&#39;utero e lay out come quando cuccioli stati inizialmente iniettati. <ol><li> Nel caso in cui tutti i cuccioli ricevuto lo stesso plasmide, ad esempio quando si inietta Cre in una lettiera transgenico, ordine embrione non è importante, quindi tagliato l&#39;utero fuori della femmina e posto in PBS. </li><li> Se cuccioli sono stati iniettati con diversi plasmidi, assicurarsi di individuare ogni cucciolo, rilevando eventuali cuccioli morti, e determinare quali sono stati iniettati con controllo e speriplasmidi Tal prima di rimuovere l&#39;utero dalla femmina. Fare attenzione a tenere traccia di quali pup appartiene a quale gruppo dopo l&#39;utero è in PBS. </li></ol></li><li> Rimuovere ogni cucciolo individualmente, decapitarlo con forbici affilate o una lametta e mettere la testa in PBS. In caso di topi transgenici, raccogliere campioni di tessuto per la genotipizzazione e mantenere ogni testa separata, ad esempio in una piastra 12 pozzetti. </li><li> Sotto un ambito dissezione, rimuovere il cervello dal cranio, facendo attenzione a non intaccare la corteccia o strappare la linea mediana. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, controllare per vedere se il cervello hanno un GFP + patch, che indica che sono stati elettroporate con successo. </li><li> Fissare cervelli di immersione in PFA a 4 ° C durante la notte. NOTA: Controllare il cervello per l&#39;espressione di GFP prima della fissazione da quando PFA spesso spegne il segnale. </li><li> Cervelli Cryoprotect attraverso l&#39;immersione nel 20% di saccarosio per almeno tre giorni prima del congelamento. Utilizzare un gradiente di saccarosio del 10%, 15% e 20% (24 ore in ciascuna soluzione) to prevenire danni ai tessuti a causa della pressione osmotica. Conservare il cervello congelato a -80 ° C e tagliare su un criostato a 10-14 micron sezioni spesse. </li></ol> 6. Co-colorazione con anti-GFP NOTA: Se il recupero dell&#39;antigene è necessario per co-macchia con anti-GFP, è importante usare un antigene protocollo di recupero delicata che non compromette il segnale GFP. Alcuni protocolli di recupero antigene sono troppo dure da utilizzare in combinazione con GFP colorazione (anche con un anticorpo contro GFP). Un acido citrico base pre-trattamento prima dell&#39;applicazione dell&#39;anticorpo primario è efficace per la maggior parte epitopi 24. <ol><li> Fare una soluzione 0,01 M di acido citrico in DDH 2 O. pH a 6 con un pH metro calibrato. </li><li> Calore acido citrico in camera di colorazione in forno a microonde o bagnomaria fino citrico raggiunge 75-80 ° C. Mettere i vetrini in camera di colorazione per 10-15 minuti. Mantenere la temperatura più stabile possibile. </li><li> Lavare i vetrini in PBS3x per 3 minuti a temperatura ambiente. Applicare l&#39;anticorpo primario e procedere con immunocolorazione secondo un protocollo standard. </li><li> Convalidare Cre escissione mediata da co-etichettatura per GFP e il gene di interesse per confermare abbattere (Figura 3A). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

Due delle principali sfide in svolgimento in electroporations utero sono 1) la prevenzione embrione letalità e 2) riduzione della variabilità tra electroporations. Uno dei fattori più importanti nella prevenzione letalità è la qualità ago, come aghi smussati infliggere più danni per l&#39;embrione. Quando si taglia l&#39;ago, mantenere la punta più a lungo possibile, pur consentendo una gocciolina visibile di 0,1-0,2 ml di fluido apparire dopo una pompa del paddle piede (Figura 1J).</st...

Migrazione Radial è un processo fondamentale per primo sviluppo corticale. Essa dipende da una varietà di fattori cellulari autonomi, come uscita corretta mitosi e la differenziazione neuronale, polarità cellulare, regolazione della dinamica del citoscheletro e l&#39;espressione dei recettori transmembrana, così come non-cellulari fattori autonomi, come la formazione del ponteggio gliali radiali e secrezione di orientamento migratorio molecole 1-3. Poiché rottura di uno di questi meccanismi può compromettere migrazione neuronale in un modello di topo transgenico 4-8, determinare la causa di fondo di un difetto di migrazione può essere un processo complesso e difficile. In utero elettroporazione (IUE) può essere utilizzato per integrare e semplificare interpretazione del fenotipo di un modello knock-out genetico e quindi chiarire i meccanismi importanti necessari per la migrazione radiale 7,9-11. In utero elettroporazione (IUE) è il processo mediante il quale un carryi plasmide<html> ng sia un gene di interesse e un reporter viene iniettato nel ventricolo nel cervello di un topo o ratto embrionale e quindi trascinato nelle cellule che rivestono il ventricolo attraverso l&#39;uso di una corrente elettrica 12-14. Questo permette al ricercatore di analizzare l&#39;effetto di alto o in basso regolazione di un gene di interesse per lo sviluppo o la funzione dei neuroni elettroporate. Dopo IUE, il cervello possono essere trattati per immunoistochimica 7,9-11, elettrofisiologia 15 o coltura cellulare 16,17. Il principale vantaggio di IUE è che si permette la manipolazione altamente specifica dell&#39;espressione genica. Inoltre, IUE può essere utilizzato per mirare ad una regione specifica del cervello sviluppo attraverso una corrente diretta (Figura 2). IUE può anche essere utilizzato per mirare ad un tipo di cellula specifico mediante iniezione di plasmidi che trasportano geni sotto il controllo di vari promotori o sistemi di attivazione plasmide (tetraciclina indotta l&#39;espressione del gene è un esempio) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE può essere utilizzato in combinazione con il sistema di escissione gene mediato Cre-Lox 7-9,11,22. Un plasmide contenente un gene che codifica il messaggio per la proteina Cre può essere elettroporate in un embrione omozigote per l&#39;allele floxed ( in cui le regioni del gene o DNA specifico sono fiancheggiate da due siti loxP per Cre mediata ricombinazione DNA). Cre quindi indurrà ricombinazione del gene di interesse specifico dei precursori neuronali elettroporate, generando un knock-out della floxed allele.The effetto proteine ​​atterramento sulla migrazione neuronale e lo sviluppo all&#39;interno dei singoli neuroni può essere studiata. elettroporazione di Cre induce ricombinazione in solo una piccola popolazione di cellule colpite, lasciando intatto l&#39;ambiente di supporto. Al contrario, l&#39;espressione tessuto specifico di Cre sotto il controllo di un tipo di cellula specifico promotore, si verifica durante tutto il tessuto in modo che entrambi neuroblasti migrano e l&#39;ambiente circostante potrebbero essere influenzate. Pertanto, juxtaposition di questi due approcci può determinare se una data difetto di migrazione è dovuta alla cella meccanismi non autonomi autonomi o cellulari. Migrazione difettoso in entrambi i sistemi sperimentali suggeriscono che i risultati fenotipo osservati da un meccanismo autonomo di cellule; migrazione normale dopo elettroporazione di Cre migrazione difettoso in un modello specifico Cre tessuto indica che il gene di interesse agisce attraverso un meccanismo autonomo non-cellula. IUE può anche essere usato per eseguire esperimenti di soccorso da electroporating potenziali geni interagiscono in knock out animali 7,9,10. Ad esempio, un ricercatore potrebbe tentare di salvare un fenotipo migrazione in un modello transgenico da electroporating un bersaglio a valle e determinare se il difetto di migrazione viene corretto in neuroni elettroporate. Questo ha il vantaggio aggiuntivo che un salvataggio di successo indica che la migrazione normale può essere ripristinato manipolando l&#39;espressione della proteina in una specifica neurone, anche se l&#39;ambiente circostante è ancora carente per il gene bersaglio. Ancora una volta, questo approccio è più tempo e conveniente che attraversa o generare linee transgeniche, con il vantaggio di determinare se il meccanismo è difettoso cellule autonoma. IUE può essere utilizzato per monitorare la migrazione dei neuroni attraverso elettroporazione di un plasmide giornalista in knock out embrioni (Figura 4C). Poiché solo i neuroni che rivestono il ventricolo al momento dell&#39;intervento chirurgico sono elettroporate 17, IUE può essere utilizzata per seguire i neuroni nati in un momento specifico con il vantaggio di visualizzazione della loro morfologia in vivo. Infine, è possibile utilizzare per indirizzare IUE regioni cerebrali come la telencefalo mediale o dorsale, ippocampo o eminenza gangliare (Figura 2). Questo dà ricercatori il potere di indagare la funzione del gene in una determinata area indipendente complicazioni risultatoing da proteine ​​atterramento in strutture vicine. Proteina retinoblastoma (pRb), P107 e P130 comprendono la famiglia di proteine ​​tasca e sono ben regolatori del ciclo cellulare uscita stabilita. Tuttavia, vi è una crescente evidenza che queste proteine ​​regolano anche del ciclo cellulare aspetti indipendenti di sviluppo neurale. Come abbiamo già dimostrato, pRb e P107 svolgono un ruolo cruciale sia in tangenziale 4,23 e migrazione radiale 6. Qui, dimostriamo il ruolo della proteina tasca familiari pRb e P107 sulla migrazione neuronale 6 per esemplificare l&#39;uso di elettroporazione in utero di Cre in un modello transgenico. In sintesi, IUE fornisce un modo potente di analizzare cellule effetti autonome di delezione del gene (o sovraespressione). Se combinato con tessuto specifico knock out modelli, IUE può fornire ulteriori informazioni riguardanti i meccanismi che controllano la migrazione neuronale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

Delezione genetica utilizzando il sistema Cre-Lox in linee di topi transgenici è un potente strumento utilizzato per studiare la funzione della proteina. Tuttavia, salvo in modelli molto particolari Cre, la cancellazione di una proteina in tutta una popolazione di tessuti o cellule, spesso conduce a fenotipi complessi derivanti da molteplici meccanismi che interagiscono. Determinare se un fenotipo risultati di interruzione di un meccanismo autonomo cella, che è intrinseco alla cella in questione, o da un meccanismo autonomo non cellule, che risulterebbe dal deterioramento dell&#39;ambiente di quella cella, possono essere difficili da distinguere. Per ottenere una visione in funzione delle proteine ​​in un contesto in vivo, in utero elettroporazione (IUE) consente di eliminare gene in un piccolo sottogruppo di cellule all&#39;interno della corteccia in via di sviluppo o di qualche altra regione del cervello selezionata. IUE può essere utilizzato per indirizzare specifiche aree cerebrali, tra cui il telencefalo dorsale, telencefalo mediale, ippocampo, o eminenza gangliare. Questo facilita l&#39;osservazione of conseguenze della cella gene delezione autonoma nel contesto di un ambiente sano. Lo scopo di questo protocollo è quello di mostrare come IUE può essere utilizzato per analizzare un difetto nella migrazione radiale in una linea di topi transgenici floxed, con un&#39;enfasi sulla distinzione tra le cellule effetti autonomi autonomi e non cellulari di delezione della proteina. Confrontando il fenotipo risultante dall&#39;eliminazione gene nell&#39;intera corteccia contro gene delezione IUE mediata in una popolazione di cellule limitata, una maggiore comprensione della funzione delle proteine ​​nello sviluppo cerebrale può essere ottenuto che utilizzando due tecniche in isolamento.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

L&#39;induzione di proteine ​​Cancellazione Through<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione per definire deficit in migrazione neuronale in modelli transgenici

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.2K Views.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Video: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel<em&gt; C. elegans</em&gt; Linea germinale

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

L'induzione di proteine ​​Cancellazione Through

L'induzione di proteine Cancellazione Through