We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

참고 : 모든 실험 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인을 준수, 오타와의 동물 관리 윤리위원회의 대학에 의해 승인되었다. 1. 수술 전 준비 및 재료 <ol><li> 플라스미드 준비 : <ol><li> 제조업체의 프로토콜에 따라 키아 MegaPrep를 사용하여 플라스미드를 준비합니다. 높은 DNA 수율을 보장하고 밤새 품어 변형 박테리아 LB 배지의 적어도 400 ml에 Innoculate. </li><li> 적어도 5 ㎍ / μL 최종 농도 100-200 μL에 재현 탁 TE 플라스미드. -20 ° C에서 나누어지는 DNA를 저장. 농도가 너무 낮 으면, 석출되지 않고 불순물이 추가로 재현 탁. 새로운 준비를 시작. </li><li> 수술하기 전에, 0.1 % 희석 플라스미드 용액 10 또는 20 μL 당 (w / v)의 빠른 그린 염료의 1 μL에 멸균 물에 2 ㎍ / μL에 하나의 플라스미드 (예를 들어 Cre 호텔 - GFP)을 희석. GFP 경우GFP로​​ 표시된 모든 셀 모두 - 일렉트로 공동되는 가능성을 최대화하기 위해 4 : 관심있는 유전자는 GFP 플라스미드 1의 비율로 목적 유전자를 운반하는 플라스미드를 주입​​, 별도의 플라스미드 상에 공동 전기 천공하여야하며 플라스미드. </li></ol></li><li> 62 ° C에서 한 단계 끌어 오기를 사용하여 표준 바늘 풀러에 - 유리 마이크로 모세관 튜브 (이하 바늘로 언급 1mm 외경)을 당깁니다. </li><li> 다음이 포함 된 수술 팩 압력솥 : 니들 홀더, 상처 견인기, 집게, 수술 가위, 바늘 가위, 스테이플러, 스테이플, 거즈, 상처 커버, 수술 용 드레이프 (그림 1A, B, 재료 표). </li><li> 다른 필요한 도구를 수집 : Electroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 ~ 7 mm)를, 식염수, 봉합, 5 ML의 주사기 (자료 표). </li></ol> 2. 수술을 위해 마우스를 준비 <ol><li> 통증 관리를 위해 타임-P를 주입일시간 수술 전 부 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / kg 체중)에 우세한 마우스. E17.5에 배아 일 12.5 (E12.5)에서 아무 곳이나 초과 마우스에이 프로토콜을 적용합니다. </li><li> 백로드하는 microloader 피펫 팁을 사용하여 플라스미드 솔루션 바늘을 뽑아. 이 바늘이 막힐하는 원인이됩니다 아직 바늘의 끝으로 모든 방법을 기입하지 마십시오. </li><li> 1 L / 분 O 2 2-5% 이소 플루 란 가스를 사용하여 마우스를 마취시키다. 일단 움직이지, 얼굴에 마스크를 취하게하고 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 1 ml의 생리 식염수 다시 (0.9 % 염화나트륨) 피하에 주입한다. 참고 : 이소 플루 란 가스로 작업 할 경우, 초과 가스를 탈환하고 방으로 탈출을 방지하기 위해 가스 제거제를 사용합니다. </li><li> 복부를 면도. , Chlorohexadine 스크럽으로 복부를 씻어 물로 씻어 및 chlorohexadine 및 70 % 에탄올의 최종 준비 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 멸균 드레이프 또는 거즈 커버 마우스 모피를 포함하지만 복부 노출 (그림 1C, D)을두고있다. </li></ol>자궁 전기 천공 법 (electroporation)에서 <ol><li> 낮은 유두 사이의 복부를 통해 피부에 절개를합니다. 결합 조직을 찢어서 멀리 하부 근육층으로부터 피부를 당겨, 다음 백선 알바 따라 복강 복막 통해 잘라. 떨어져 상처의 가장자리를 당겨 상처 견인기를 삽입합니다. </li><li> 복강에서 자궁을 제거하고 그림 (그림 1E)로 배치. <ol><li> 다른 새끼 (예 관심 유전자 GFP 대 GFP와 같은) 다른 플라스미드를 주입 할 경우, 각 측면에 새끼를 카운트하고 각 플라스미드 얼마나를 주입하는 것을 결정하고. 다시 따뜻한 윤활 배아를 유지하기 위해 복부에 자궁의 한쪽을 교체합니다. 즉시 식염수 노출 자궁 (바람직하게는, 체온으로 가온)을 적시고. </li><li> 같은 플라스미드 모든 새끼를 주입하면 ONL (예 : 유전자 변형 배아에 Cre 호텔 - GFP를 주입 할 때 등)Y는 한 번에 자궁의 하나의 뿔을 제거합니다. </li></ol></li><li> 작은 수술 가위 또는 미세 집게 한 쌍의 끝을 잘라 조심스럽게 주입 지팡이의 손잡이 머리에로드 된 바늘을 넣고. 여전히 유체 (그림 1Ji-IV)를 통과 할 수 있도록하는 동안 바늘만큼 가능한 한 유지되도록 끝을 잘라. <ol><li> 풋 패드 누를 때 0.1-0.2 μL의 작지만 쉽게 볼 액 적이 바늘의 팁에 나타나도록 마이크로 인젝터에서 (초)의 주사 길이와 분사 압력을 조정한다. 다른 바늘 사이에 최대한의 일관성이 방울의 볼륨을 유지합니다. 참고 :이 단계는 배아의 생존 (설명 참조) 매우 중요하다. </li><li> Femtojet에 대해 다음 주입 매개 변수를 사용하여 압력을 주입 (PI) = 250 ~ 300 헥토 파스칼; 주입 시간 (TI) = 0.8 ~ 1.2 초; 보상 압력 = 10 ~ 50 헥토 파스칼. 필요한 경우, 바늘 사이의 변화를 수용하기 위해 이러한 매개 변수를 조정합니다. </li></ol></li><li> 에스배아을 선출하고 부드럽게 다시 위쪽으로 기울어 진 머리 (그림 1 층)에 위치. 참고 :이 켜거나 배아를 이동해야 할 수 있습니다; 너무 많은 압력을 적용하고 배아를 조작하는 동안 양막의 파열을 방지하지 않도록주의하십시오. </li><li> 배아가 작성되면, 시상 동에 초승달 모양의 그림자 병렬로 제시 뇌실을 찾습니다. 약간의 각도에서 심실 위의 자궁에 바늘의 끝 부분을 터치하고 자궁 벽을 통해 바늘을 안내합니다. 설정 압력의 크기는 바늘의 선명도에 의존한다. 뇌실에 피질을 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 참고 : 거의 모든 추가 검출 저항 없지만 태아의 머리는 종종 약간 멀리 밀려 후 바늘이 뇌실 내로 통과 피질로 젖혀. </li><li> 플라스미드 솔루션을 주입하기 위해 발 패들 펌프. 녹색 영역이 표시되고 준수 될 때까지 펌프 계속뇌실 (그림 1G)의 아크 모양. 젊은 배아 (E14.5에 E12.5)에서 염료는 종종 반대편 심실로 확산됩니다. 주 : 펌프 수가 바늘 끝의 직경에 따라, 태아 (및 결과적인 심실의 크기)과 원하는 주입량의 연령. 볼륨을 유지하는 것은 배아 사이에 가능한 한 일치 주입. </li><li> 서너 배아를 주입한다. 절차를 통해 식염수와 습기 노출 된 배아를 유지합니다. </li><li> 다시 주입 된 최초의 배아로 이동하고 양극은 뇌 (그림 1H)의 원하는 영역에 플라스미드를 그릴 것 같은 패를 놓습니다. 각도가되도록 음극 전극 사이의 최단 경로는 전기를 대상으로 구조 (도 2)를 통해 직접 통과한다. </li><li> 패 자리에되면, 충격을. 배아의 나이와 크기에 따라 35 ~ 50 V의 5 펄스를 사용 (T 참조수 1). 전기 천공 다음 파라미터를 사용하여 5 msec의 펄스의 길이를 950 밀리 초 펄스 간격으로. 모든 주입 배아와 반복합니다. </li><li> 마지막 바늘 가능성이 건조 단계 3.9 동안 막힘 등의 단계 3.3에서와 같이 새로운 사전로드 된 바늘의 끝을 잘라. 같은 플라스미드 또는 다른 플라스미드 중 세 가지 또는 네 개의 배아의 다음 세트를 주입 한 후 단계 3.9에서와 같이 충격을. 자궁의 한쪽에있는 모든 새끼가 주입 될 때, 여성의 복부에서 자궁의 두 번째면을 제거하고 따뜻하게 유지하기 위해 완성 된면을 교체합니다. </li><li> 양수 주머니에 외상을 방지하기 위해 너무 많은 압력을 적용 식염수가 아닌 촉촉한 표면을 유지하기 위해주의하면서 여성에게 자궁의 양쪽 모두를 돌려줍니다. 단순한 연속하여 스티치를 폐쇄 근육층 봉합사. 스테이플 피부가 닫힙니다. 스테이플을 사용할 수없는 경우, 간단한 인터럽트 스티치 피부를 봉합. (그림 1I) </li><li> suturi 동안NG, 점진적으로 임신 여성의 마취 밝게 할 수 있도록 이소 플루 란을 줄이십시오. 주 : 수술이 완료되면이 댐의 각성을 촉진한다; 배아 생존율을 향상 가능한 한 짧은 시간 동안 마취를 유지 여성. 총 수술 시간, 여성이 먼저 마취 때부터 시작하여, 약 30 분이어야한다. </li></ol> 4. 애프터 케어 <ol><li> 인큐베이터 또는 마취에서 회복하기 위해 가열 패드에 봉합 여성을 놓습니다. 깨끗한 침대에 그녀를 침대와 케이지의 표준 복구 젤은 수분을 유지 놓습니다. 다음 수술 통증 관리를 들어, 수술 후 8 시간 간격으로, 12 시간 간격으로 네 개의 추가 용량으로 부 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / kg 체중)의 투여 량 세 여성을 준다. </li></ol> 5. 수확 두뇌 참고 : 두뇌는 성인에 대한 연령까지 수확 할 수있다. 다음이 적용됩니다이전에 출생 두뇌를 수집합니다. 새끼가 태어난 후, 자궁 내 순서는 쓰레기의 모든 강아지 중 하나가 같은 플라스미드를 주입​​해야하므로, 분실, 또는 제어 및 실험 동물을 구별하는 다른 방법이 고안되어야합니다. <ol><li> 감기 (4 ° C에서)를 준비, 여성 안락사 이전에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 필터링. </li><li> 펜 토바 비탈 나트륨 (100mg / kg 체중)의 치사량의 복강 내 주사를 사용하여 여성을 안락사 개방 복부 잘라. 자궁의 양쪽을 잡아 당겨 새끼가 초기에 주입 된 경우와 같이 배치. <ol><li> 모든 새끼는 트랜스 제닉 깔짚 Cre 호텔로 주입 할 때와 같은 플라스미드를받은 경우, 배아 순서에 따라서 PBS 여성 및 여길 자궁 잘라, 중요하지 않다. </li><li> 강아지가 다른 플라스미드를 주입​​ 한 경우, 죽은 새끼를 지적, 각각의 강아지를 찾을 수 있는지, 그리고 제어 및 experimen 주입 된 것 확인여성에서 자궁을 제거하기 전에 탈 플라스미드. 강아지가 자궁 PBS에있는 그룹 후에 속한 추적주의하십시오. </li></ol></li><li> 개별적으로 각각의 강아지를 제거 날카로운 가위 또는 면도날로 목을 베다와 PBS에 머리를 배치합니다. 트랜스 제닉 마우스의 경우, 유전자형 분석을위한 조직 샘플을 수집 및 12 웰 플레이트와 같이, 각 개별 헤드를 유지한다. </li><li> 해부 범위에서 닉에주의하면서 두개골에서 피질 뇌를 제거하거나 중간 선을 찢어. 형광 현미경을 사용하여 성공적 전기 천공 된 것을 나타내는 뇌가 GFP + 패치가 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 PFA에 침수로써의 머리를 고정합니다. 참고 : PFA는 종종 신호를 소멸하기 때문에 이전의 고정에 GFP의 발현을위한 두뇌를 확인합니다. </li><li> 이전 동결에 적어도 3 일 동안 20 % 자당의 침수를 통해 Cryoprotect 두뇌. t 자당 ​​10 %의 구배, 15 % 및 20 % (각 솔루션에 24 시간)을 사용하여O 삼투압으로 인한 조직 손상을 방지한다. -80 ° C에서 냉동 두뇌를 저장하고 10 ~ 14 μm의 두께 부분에서 저온 유지 장치에 잘라. </li></ol> 안티 GFP 6. 공동 염색 주 : 항원 검색 공동 얼룩 방지와 GFP를 위해 필요한 경우에는 GFP 신호를 손상시키지 않는 부드러운 항원 검색 프로토콜을 사용하는 것이 중요하다. 일부 항원 검색 프로토콜 (심지어 GFP에 대한 항체를 사용) GFP 염색과 함께 사용하기에 너무 가혹. 선행 차 항체의 적용에 염기성 시트르산 전처리 가장 에피토프 24 성공적이다. <ol><li> DDH 2 O. 시트르산 0.01 M 용액을 제조 보정 된 pH 미터를 사용하여 pH 6. </li><li> 구연산 산까지 전자 레인지 또는 물을 욕조에 염색 실에서 열 구연산은 75 ~ 80 ° C를 도달한다. 10 ~ 15 분 동안 염색 실에 슬라이드를 넣습니다. 가능한 한 안정적으로 온도를 유지한다. </li><li> PBS에서 슬라이드를 씻으3X 실온에서 3 분. 차 항체를 적용하고 표준 프로토콜에 따라 면역 염색 진행합니다. </li><li> (그림 3A)를 허물고 확인 GFP를위한 공동 라벨링 및 관심의 유전자에 의해 Cre 호텔 매개 절제의 유효성을 검사합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

자궁의 electroporations에서 수행의 기본 과제의 두 배 치사 및 2) electroporations 사이의 변동성을 감소 방지) 일 수 있습니다. 무딘 바늘 배아에 더 손상을 입힌다으로 사멸을 방지하는 가장 중요한 요소 중 하나는, 바늘 품질이다. 바늘을 절단 할 때에는 여전히 발 패들 (그림 1J)의 펌프 다음 나타나는 유체의 0.1 ~ 0.2 μL의 볼 방울을 허용하면서, 가능한 한 오랫동안 팁을 유지. 바늘이...

레이디 얼 이주 초기 대뇌 피질의 개발에 중심 과정이다. 여기에는 올바른 유사 분열 출구 및 신경 분화, 세포 극성 골격 역학과 막 관통 수용체의 발현의 조절뿐만 아니라 반경 폐해 지지체의 형성과 같은 비 세포 자율 요소와 같은 셀 자율 다양한 요인에 의존 철새지도의 분비 1-3 분자. 이러한 메커니즘의 임의의 중단 때문에 복잡하고 어려운 과정이 될 수있는 이주에서의 결함의 근본 원인을 판정하는, 트랜스 제닉 마우스 모델 4-8 신경 마이그레이션을 방해 할 수있다. 자궁 전기 (IUE) 보체 간소화하는데 사용될 수있다 이에 따라 유전자 녹아웃 모델의 표현형과의 해석은 반경 마이그레이션 7,9-11에 필요한 중요한 메커니즘을 해명. 자궁 내에서 전기 천공 (IUE)가 프로세스되는 플라스미드에 의해 carryi<html> 관심의 유전자와 기자 모두 ng를하는 것은 마우스 나 쥐 태아의 뇌의 뇌실에 주입 한 후 전류 12 ~ 14의 사용을 통해 심실을 안감 세포로 그려집니다. 이 연구자가 또는 개발 또는 electroporation하여 신경 세포의 기능에 대한 관심이 유전자의 규제 아래의 효과를 분석 할 수 있습니다. IUE 다음, 두뇌는 면역 조직 화학 7,9-11, 전기 생리학 (15) 또는 세포 배양 (16, 17)에 대해 처리 할 수 있습니다. IUE의 주요 이점은 유전자 발현이 고도로 특이 조작 할 수있게된다. 또한, IUE는 지시 전류 (그림 2)을 통해 개발 뇌의 특정 영역을 대상으로하는 데 사용할 수 있습니다. IUE 또한 다양한 프로모터 플라스미드 또는 활성화 시스템의 제어하에 유전자를 운반하는 플라스미드의 주입을 통해 특정 세포 타입을 표적하는 데 사용할 수 10,18-21 (테트라 사이클린 유도 유전자 발현은 예이다). &gt; IUE가 치운다 훈제 연어 매개 유전자 절제 시스템 7-9,11,22와 함께 사용될 수있다 jove_content는 &quot;. Cre 호텔 단백질의 메시지를 인코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 floxed 대립 유전자 배아 동형 접합체 (에 electroporation 수 하는 유전자 또는 특정 DNA 영역은 Cre 호텔 중재 DNA 재조합에 대한 두 가지에 loxP 사이트)에 의해 측면에 있습니다. Cre 호텔은 다음 구체적으로 electroporation하여 신경 전구체에 대한 관심의 유전자의 재조합을 유도 할 것이다,의 floxed allele.The 효과를 노크 아웃을 생성 신경 영동 개별 뉴런 내 개발 단백질 분해 후 연구 될 수있다. Cre 호텔의 일렉트로 그대로지지 환경을 떠나는 영향 세포의 작은 집단에서 재조합을 유도한다. 반대로, 특정 세포 유형의 제어하에 Cre 호텔의 조직 특이 적 발현 프로모터, 조직 전체에 걸쳐 발생 모두 마이그레이션 neuroblasts 및 주변 환경의 영향을받을 수있다. 따라서, 그렇게 jux이 두 가지 방법의 taposition은 주어진 마이그레이션 결함이 자율적 또는 셀이 아닌 자율적 인 메커니즘을 세포에 의한인지 여부를 확인 할 수 있습니다. 두 실험 시스템의 결함 마이그레이션이 제안 셀 자치기구에서 관찰 된 표현형 결과 그; 조직 특이 Cre 호텔 모델에서 결함이 이주 Cre 호텔의 전기 다음 정상 마이그레이션은 관심의 유전자가 아닌 세포 자율 메커니즘을 통해 작동하고 있음을 나타냅니다. 또한 IUE 녹아웃 동물 7,9,10 전위에 작용하는 유전자를 구조 electroporating하여 실험을 수행하는 데 사용될 수있다. 예를 들어, 연구자는 다운 스트림 대상을 electroporating 및 마이그레이션 결함이 일렉트릭 뉴런에서 해결 여부를 결정하여 형질 전환 모델의 마이그레이션 표현형을 구출하려고 시도 할 수 있습니다. 이것은 성공적인 구조 정상적인 마이그레이션 SPE에서 단백질 발현을 조작함으로써 복원 될 수 있음을 나타낸다 추가적인 이점을 갖는다cific 뉴런, 주위 환경​​이 여전히 표적 유전자 결핍에도. 다시,이 방법은 더 많은 시간과 불량 메커니즘 자율 셀인지 여부를 판단하는 추가적인 이점과 함께, 트랜스 제닉 라인들을 교차하거나 발생보다 비용 효과적이다. IUE는 노크 배아 (그림 4C)에 리포터 플라스미드의 전기를 통해 신경 세포 마이그레이션을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 수술시 심실 안감에만 뉴런 17 일렉트로됨에 IUE는 생체 내에서, 형태의 시각화 이점과 특정 시간에 태어난 뉴런을 수행하는데 사용될 수있다. 마지막으로, 이러한 내측 등쪽 telencephalon, 해마 신경절 또는 융기 (도 2)와 같은 뇌 영역을 대상 IUE를 사용하는 것이 가능하다. 이는 연구자에게 합병증 결과 특정 영역에서 독립적 유전자 기능을 연구 할 수있는 능력을 준다이웃 구조에서 단백질 분해에서 보내고. 망막 모세포종 단백질 (pRb와는), P107과 P130은 포켓 단백질 가족을 포함하고 잘 세포주기 출구의 규제를 설정됩니다. 그러나, 이들 단백질은 또한 신경 발달의 세포주기 독립적 양태를 조절한다는 증거가 증가하고있다. 우리는 앞에서 설명한 것처럼, pRb와 및 P107은 모두 접선 4,23 및 방사형 마이그레이션 6에 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 유전자 변형 모델에 Cre 호텔의 자궁 전기에서의 사용을 예시하는 신경 마이그레이션 6 포켓 단백질 가족 PRB 할당과 P107의 역할을 보여줍니다. 요약하면, IUE 유전자 삭제 (또는 과발현)의 셀 자치 효과를 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 모델을 노크 특정 조직과 함께 사용하면 IUE 신경 마이그레이션을 제어 메커니즘에 관한 추가 정보를 제공 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

트랜스 제닉 마우스 라인 치운다 된 LOX 시스템을 사용하여 유전자 결실은 단백질의 기능을 연구하는데 사용되는 강력한 툴이다. 그러나, 매우 구체적인 Cre 호텔 모델을 제외하고, 조직 또는 세포 인구에 걸쳐 단백질의 삭제는 종종 여러 상호 작용 메커니즘에 의한 복잡한 표현형에 연결됩니다. 문제, 또는 해당 셀의 환경 손상으로부터 초래 비 자율기구 셀로부터 셀로의 극한이다 자율 셀기구의 파괴로부터 표현형 결과를 분별하기 어려운 될 수 있는지 여부를 결정하는 단계. 자궁 전기에서, 생체 맥락에서 단백질의 기능에 대한 통찰력을 얻으려면 (IUE)가 개발 피질 또는 다른 선택 뇌 영역 내 세포의 작은 하위 집합 유전자 삭제를 할 수 있습니다. IUE는 지느러미 telencephalon, 중간 telencephalon, 해마, 또는 신경절 예하을 포함한 뇌의 특정 영역을 대상으로하는 데 사용할 수 있습니다. 이 관찰 O를 용이하게건강한 환경의 컨텍스트에서 자율적 셀 유전자 결실의 결과 F. 이 프로토콜의 목적은 IUE 단백질 결실 셀 자율 및 비 - 셀 자율 효과 구별 중시, floxed 트랜스 제닉 마우스 선에서 방사상 이동의 결함을 분석하는 방법을 보여주는 것이다. 뇌 발달에 단백질 기능에 한정된 세포 집단에서 IUE 매개 유전자 결실 대 전체 피질 내의 유전자 결실로 인한 표현형,보다 정밀한 분리하여 비교함으로써 어느 기술을 이용하여보다 더 얻을 수있다.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

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Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

단백질 삭제의 유도를 통해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로는 형질 전환 모델에서 신경 세포의 마이그레이션에 적자를 정의하려면

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.1K 조회수.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

비디오: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

연구

발생학

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...