עבודה זו נתמכה על ידי G0400268 מענקי מחקר וMR / K018396 / 1 מהמועצה למחקר הרפואי, ועל ידי מחקר רפואי פעולה. תמיכה נוספת סופקה על ידי המכון הלאומי לחקר בריאות באוניברסיטת קולג &#39;בלונדון בתי חולים ביו-רפואי מרכז מחקר.

כל הניסויים בבעלי החיים שבוצעו במחקר זה תאמו את חקיקה לאומית ואירופית ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לרוקחות UCL והמשרד בבריטניה הבית (HO). כל העבודה בבעלי החיים שנערכה במסגרת פרויקט HO רישיונות PPL 80/2243 וPPL 70/7773. 1. עכברוש הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל in vivo הניסויים באמצעות חולדות ילודות Wistar הפתוגן ללא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל המלטות העכברוש (12 ילודים למושבה) בכלובים בודדים עם אמהותיהם נשים (9 - 11 בשבוע שנקבות זקנות), בתנאים אופטימליים (19-21 מעלות צלזיוס, 45-55% לחות, 15-20 שינויי אוויר / שעה ו 12 שעות אור / חושך מחזור). </li></ol> 2. תא חיידק הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות E. מניות coli K1 ב -20% (V / V) גליצרול ב -80 מעלות צלזיוס. עבור כל ניסוי, צלחת את חיידקי המניה על מילר-הינטון (MH) צלחות אגר, ולדגור על 37 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני ההאכלה, inocuמאוחר 10 מיליליטר של מרק MH עם ה יחידה מושבה והתרבות O coli K1 / N על 37 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד. כביקורת על זיהום בינוני, להכין 10 מיליליטר של מרק MH uninoculated ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת O / השעיה חיידקי N 100 μl ל9.9 מיליליטר של מרק MH (1: 100 V / V), ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד, עד שיגיע לאמצע מעריכי-שלב, מתאים לצפיפות אופטית של 0.6 הנמדד באורך גל של 600 ננומטר (OD 600). </li></ol> 3. האכלת חולדות ילודים עם א &#39; K1 coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד בעדינות את בעלי החיים בצורה אנכית ביד אחת מהעורף, המאפשר לפתוח את הפה. לאט לאט להכניס את קצה פיפטה סטרילית לתוך פיו של בעל החיים, ופיפטה 20 μl של הבידוד (~ 37 ° C) לתוך הפה של בעלי החיים על פני פרק זמן של 30 שניות. להחזיר את בעל החיים לאמו מייד לאחר הנקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא ש4 - 8 x 10 6 חיידקים לא האביסו to כל גור על ידי דילול סדרתי של הבידוד בPBS ואיתור על גבי צלחות אגר MH. </li></ol> 4. הערכה של התיישבות על ידי א K1 coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד בעדינות את החיה ביד אחת מהעורף. להרטיב מקל אוזני סטרילי בסטרילי PBS, ולאחר מכן בעדינות לשטוף את האזור פי הטבעת. להחזיר את בעל החיים לאמו מייד לאחר קירצוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קצה הצמר-הגפן לצינור המכיל 300 μl של PBS סטרילית ולאחסן על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספרים של חיידקי קיימא על ידי דילול סדרתי בPBS וציפוי על צלחות אגר MacConkey. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע א קיימא coli K1 על ידי בדיקת רגישות bacteriophage. פיק מושבה בודדת באמצעות לולאת מיקרוביולוגית סטרילי, טבל 200 μl סטרילי PBS, אז בכפוף לערבוב מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאת מיקרוביולוגית סטרילי, תת-תרבות על אגר MH בקו ישר. לאפשר את הצלחת לייבוש למשך 30 שניות, ולאחר מכן פיפטה 10 μl של BACK1E teriophage (10 9 פלאק ויוצרים מיליליטר / יחידות (PFU / ml)) על גבי במרכז הקו. דגירה O הצלחת / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבחון את הצלחת לתמוגה בתיווך bacteriophage. </li></ol> 5. הערכה של מחלת חומרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את חומרת המחלה של כל חיה 4 - 5 פעמים ביום באמצעות מערכת ניקוד שבע נקודות המפורטים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ציונים של בעלי חיים ≥3 מתוך 7, לברור באופן מיידי לבעלי החיים כדי למזער את הסבל. רשום את בעלי החיים למתים. </li></ol> 6. Euthanization של חולדות ילודים ודם אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד בעדינות את החיה ביד אחת, וחושף את הראש וצוואר. לחטא את צווארו של בעל החיים על ידי מנגב עם ספוגית אלכוהול. לחטא זוג מספריים גדול באמצעות אתנול 70%, לפני השטיפה בPBS סטרילי כדי להסיר אתנול עקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד בעדינות את בעלי החיים ישירות מעל צלחת פטרי. לערוף את הילוד באמצעות surgi החדמספריים קאל, על מנת להבטיח כי הדם מטפטף לתוך צלחת פטרי. יש להימנע ממגע עם הראש על מנת למנוע זיהום של דם עם צמחיית עור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאסוף את הדם באמצעות פיפטה סטרילית ומערבבים עם מלח נתרן הפרין בריכוז של 20-50 מיליליטר / יחידות בצינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספרים של חיידקי קיימא על ידי דילול סדרתי בPBS וציפוי על צלחות אגר MacConkey. לקבוע את מספריו של ע &#39;בר-הקיימא coli K1 על ידי בדיקת הרגישות של חיידקי קיימא לK1E bacteriophage. </li></ol> 7. Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות עריפת ראשו של העכברוש בילוד, להשתמש תנאי ספטית לחתוך ולאסוף רקמות של עניין. לשטוף את כל המכשירים (מוצגים באיור 1) ב- 70% אתנול וסטרילי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הלוח לנתיחה ולהרטיב את הבטן לגמרי עם 70% אתנול. מקם את הגופה על הגב שלה ולתקן ללוח לנתיחה על ידי (i) מצמיד את רגלו האחורית השמאלית לשולחן העבודה עם מחט סטרילית, (ii) מתיחת הגופה ומצמיד את הרגל הקדמית הימנית לשולחן הפעולה, (iii) מצמיד את רגל ימין אחורית ורגל קדמית השמאלית לשולחן הפעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את העור לאורך הצד השמאלי של הבטן התחתונה באמצעות מלקחיים, ואז לחתוך לאורך צדו השמאלי של הגופה מהבטן התחתונה לעצם החזה באמצעות מספריים לנתיחה קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את הכריתה פני עצם החזה, ואז למטה בצד ימין של הגופה מעצם החזה ועד הבטן התחתונה באמצעות מלקחיים ומספריים לנתיחה קטנה, להבטיח שאף אחד ממבני היסוד פגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, משוך בעדינות את דש העור מעצם החזה ועד הבטן התחתונה באמצעות קשתית מלקחיים לנתיחה מעוקלות כדי לחשוף את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעלות את הצפק עם מלקחיים ולחתוך בצורה אנכית על מנת לחשוף את האיברים הפנימיים, כדי להבטיח שאף אחד מהאיברים שבבסיסם ניזוקו. </li></ol> 8. איסוףמערכת העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הקיבה, מערכת הלימפה mesenteric מעי דק, cecum, מעי גס ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבטן בעדינות על ידי transecting בכל צד, ואז למקם לתוך קומפקטי המכיל 1.6 מיליליטר של PBS סטרילי באמצעות מלקחיים סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transect המעי הגס בפי הטבעת. משוך בזהירות את המסה במעי כולו מהגופה באמצעות מלקחיים לנתיחה ומניחים בצלחת פטרי סטרילית. ודא שזה נעשה בעדינות כך שמבנה המעיים ומבני הלימפה mesenteric אינם מפריד. </li></ol> 9. הפרדה של מערכת העיכול ומערכת הלימפה mesenteric (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 30 מיליליטר של PBS סטרילי לתוך צלחת פטרי, להבטיח את מערכת העיכול היא שקועה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את המסה של מערכת הלימפה mesenteric המרכזית, ולצבוט באמצעות מלקחיים לנתיחה קנס. זהה את החלק הפרוקסימלי ביותר של המעי הדק, ולצבוט באמצעות מלקחיים לנתיחה קנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט למשוך CENTRAמסת l של מערכת הלימפה mesenteric והמעי הדק דיסטלי בכיוונים מנוגדים, עד שתי הרקמות מופרדות לחלוטין זו מזו. לבצע תהליך זה בזהירות כדי להבטיח שהמעי הדק לא נמתח, כמו זה מונע גבייה לשחזור של הפרוקסימלי, אמצע ואזורי דיסטלי. הנח את מערכת הלימפה mesenteric ב300-500 μl סטרילי PBS ומניח על קרח. </li></ol> 10. חתך של מערכת העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transect מערכת העיכול בcecum להפריד המעי דק מהמעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המעי הגס ב300-500 μl סטרילי PBS ומניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות של רקמות נציג מאזורים הפרוקסימלי, אמצע ואחורי של המעי הקטן. יישר את המעי דק מנקודת האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, (i) לאסוף את 2 סנטימטר האחרון של רקמה לפני המעי האטום כמו המעי הדק דיסטלי, (ii) לאסוף את רקמת 5-7 סנטימטר מעל לנקודת האמצע כמו המעי הדק הפרוקסימלי, ו(Iii) לאסוף את רקמת 3-5 סנטימטר מתחת לנקודת האמצע כמו המעי הדק האמצע. </li></ol> 11. איסוף הכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות שלוש אונות של כבד החולדה לאחר ההסרה של הקיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אונות מחלל הבטן באמצעות מלקחיים לנתיחה קנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכבד על ידי חיתוך כל רצועות חיבור באמצעות מספריים עדינים. הנח כבד ב300-500 μl סטרילי PBS ומניחים על קרח. </li></ol> 12. איסוף הטחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך טחול מהבטן ולהשתמש במספריים עדינים לחתוך את רצועות gastrosplenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טחול ב300-500 μl סטרילי PBS ומניחים על קרח. </li></ol> 13. איסוף הכליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הכליות שתהיינה גלויים בחלק האחורי של חלל הבטן עם ההסרה של המערכה העיכול ואיברים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השופכנים Cut וכל רצועות הצמדת uלשיר מספריים לנתיחה קנס ולהסיר כליות באמצעות מלקחיים בסדר. הסר בלוטת יותרת הכליה וכל חומר שומני (אם עדיין מחובר) באמצעות מלקחיים בסדר ומספריים לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני הכליות ב300-500 סטרילי PBS μl ומניח על קרח. </li></ol> 14. איסוף המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עריפת הראש, להחזיק את הראש בתנוחה זקופה באמצעות מלקחיים מעוקלים. צובט את העור על ראש של אורכית באמצעות קבוצה נוספת של מלקחיים מעוקלים, ולהפוך את חתך באמצעות מספריים לנתיחה קנס. לחתוך את עור שנותר ליד צוואר, שוב אורכית עם מספריים לנתיחה קנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך עור בכיוון החוצה באמצעות מלקחיים בסדר בשני הצדדים כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר דשי עור באמצעות מספריים לנתיחה קנס. הנח מספריים לנתיחה קנס בפתיחת השדרה ולעשות חתך לאורך הגולגולת לכיוון הדוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את שני החלקים של גולגולת בכיוון החוצה באמצעות מלקחיים בסדר. חותך להסרת מקטעי גולגולת. </li><li&gt; הסרת מוח באמצעות מלקחיים רחבים, תוך שימוש בתנועה כלפי מעלה גורפת מפתיחת השדרה לכיוון הדוכן. שטוף את המוח בPBS פעמיים כדי להסיר כל דם מהליך עריפת הראש. </li></ol> 15. עיבוד רקמות ולתפעול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים הדורשים ספירת כדאיות או מיצוי DNA, רקמות מקום לצינורות המכילים סטרילי PBS. מייד לקבוע את המספרים של חיידקי קיימא על ידי דילול סדרתי בPBS וציפוי על צלחות אגר MacConkey, או בחנות ב -20 ° C עם גליצרול 20% לטווח קצר. להפקת DNA, רקמות חנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים הדורשים מיצוי RNA, רקמות מקום באמצעי האחסון מתאים של פתרון RNAlater (10 μl לכל רקמת 1 מ&quot;ג), ולאחר מכן לאחסן באופן מיידי ב -20 ° C לטווח קצר או באחסון לטווח ארוך -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים הדורשים הדמיה, רקמות מקום 10 מיליליטר פתרון Methacarn (מתנול 60%, כלורופורם 30% ו -10% חומצה אצטית), לאחר מכן לאחסןלא RT (20-25 מעלות צלזיוס) לתקופה של עד 3 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את משקל רקמה על ידי השוואת משקל של צינורות של לפני ואחרי תוספת של רקמות. Homogenize רקמות באמצעות homogenizer. שטוף את homogenizer פעם אחת בשנת 70% אתנול ו פעמים PBS סטרילי בין הומוגניזציה של כל דגימה. הערה: קיבעון Methacarn רצוי לקיבעון של דגימות מעיים במטרה לשמר את מבני הגנה ריריים הקשורות mucin; קיבעון פורמלין עשוי לשמש לרקמות מערכתיות. </li></ol>

<ol>
	<li>Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+meningitis+in+the+newborn:+a+prospective+study+of+mortality+and+morbidity.">Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity.</a> 23 (5), 218-225 (1999).</li><li>Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+diagnosis,+and+antimicrobial+treatment+of+acute+bacterial+meningitis.">Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).</li><li>Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queir&#243;s, F., Nova, C. V., Lucena, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+newborn+bacterial+meningitis+and+sepsis+during+the+pregnancy+period+for+public+health+care+system+participants+in+Salvador,+Bahia,+Brazil.">Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil.</a> J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).</li><li>Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+of+the+newborn:+basic+mechanisms+and+clinical+correlates.">Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).</li><li>Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K1+capsular+polysaccharide+associated+with+neonatal+meningitis.">Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis.</a> N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).</li><li>Korhonen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hemolysin+production,+and+receptor+recognition+of+Escherichia+coli+strains+associated+with+neonatal+sepsis+and+meningitis.">hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis.</a> Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).</li><li>Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysialic+acid+in+the+plasticity+of+the+developing+and+adult+vertebrate+nervous+system.">Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).</li><li>Koedel, U., Pfister, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+experimental+bacterial+meningitis.">Models of experimental bacterial meningitis.</a> Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).</li><li>Tunkel, A. R., Scheld, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+pathophysiology+of+bacterial+meningiits.">Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits.</a> Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+K1+capsule+is+the+critical+determinant+in+the+development+of+Escherichia+coli+meningitis+in+the+rat.">The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).</li><li>Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+Escherichia+coli+share+common+virulence+factor+profiles,+serotypes+and+phylogeny+with+other+extraintestinal+E.+coli.">Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli.</a> Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).</li><li>Sarff, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Escherichia+coli+K1+in+healthy+and+diseased+newborns.">Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns.</a> Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).</li><li>Schiffer, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+relation+between+invasiveness+and+the+K1+capsular+polysaccharide+of+Escherichia+coli.">A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli.</a> Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).</li><li>Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+infant+intestinal+microbiota.">Development of the human infant intestinal microbiota.</a> PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).</li><li>Nassif, X., Bourdoulous, S., Eug&#232;ne, E., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+extracellular+pathogens+cross+the+blood-brain+barrier.">How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier.</a> Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).</li><li>Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infant+rat+as+a+model+of+bacterial+meningitis.">The infant rat as a model of bacterial meningitis.</a> J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).</li><li>Birchenough, G. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+innate+defenses+in+the+neonatal+gastrointestinal+tract+in+response+to+colonization+by+neuropathogenic+Escherichia+coli.">Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).</li><li>Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+antimicrobial+peptides+of+innate+immunity.">Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).</li><li>Bevins, C. L., Salzman, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells,+antimicrobial+peptides+and+maintenance+of+intestinal+homeostasis.">Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).</li><li>Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+meningitis+in+infant+rats+after+intranasal+inoculation.">Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation.</a> J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).</li><li>Bortolussi, R., Ferrieri, P., Bj&#246;rkst&#233;n, B., Quie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+K1+polysaccharide+of+Escherichia+coli:+relationship+to+virulence+in+newborn+rats+and+resistance+to+phagocytosis.">Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis.</a> Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).</li><li>Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+neonatal+Escherichia+coli+meningitis:+induction+of+bacteremia+and+meningitis+in+infant+rats+fed+E.+coli+K1.">Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1.</a> Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).</li><li>Pluschke, G., Mercer, A., Kuse&#263;ek, B., Pohl, A., Achtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+bacteremia+in+newborn+rats+by+Escherichia+coli+K1+is+correlated+with+only+certain+O+(lipopolysaccharide)+antigen+types.">Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types.</a> Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+capsule-selective+endosialidase+E+minimizes+changes+in+organ+gene+expression+induced+by+experimental+systemic+infection+with+Escherichia+coli+K1.">Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+polysialyl+capsule+during+blood-to-brain+transit+of+neuropathogenic+Escherichia+coli+K1.">Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+cure+of+systemic+Escherichia+coli+K1+infection+by+modification+of+the+bacterial+phenotype.">Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).</li><li>Achtman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+widespread+bacterial+clones+among+Escherichia+coli+K1+isolates.">Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates.</a> Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+Escherichia+coli.+infection+with+recombinant+bacteriophage-derived+capsule+depolymerase.">Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).</li><li>Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacteriophages+specific+for+the+K1+polysaccharide+antigen+of+Escherichia+coli.">Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מודל החיה המתואר כאן מתבסס על עבודה קודמת שנועדה לשחזר את המאפיינים הבולטים של מתרחש באופן טבעי בזיהומים בבני אדם. חולדות בילוד בתחילה הועסקו ללמוד דלקת קרום מוח תינוקות עקב H. סוג אינפלואנזה b כמינים עומדים בקריטריונים המרכזיים למודל חזק של זיהום. כך, פורטל כניסה של הפתוגן הרלוונטי צריך לשקף את זה של הדבקת בני אדם הטבעית וreproducibly להצמיח פתולוגיה דומה של משך מספיק כדי לאפשר התערבות טיפולית. הטכניקות המשמשות לא צריך להגביל את תחולתו של ההליך ולא צריך לתרום לתוצאה מחלה 20. המודל של ה &#39; דלקת קרום מוח המופילוס בחולדות תינוק שפותחו על ידי Moxon ועמיתים עונה על קריטריונים אלה 20; ההדבקה הטבעית מתרחשת לאחר קולוניזציה של הקרומים הריריים של דרך הנשימה העליונה, תכונה חשובה זו שוכפלה בגורי החולדה על ידי אי-טראומההחדרת טיקים של החיידקים על גבי הקרומים של מעברי האף. חשוב לציין, הטבע תלוי הגיל של הזיהום היה משוכפל במודל. אותה הקבוצה גם היתה הראשונה לפתח מודל לא פולשנית של א &#39; coli K1 NBM בחולדה בילוד 22. גורי ספראג-Dawley הפתוגן ללא שיישבו על ידי האכלת 8 אוקטובר - 10 אוקטובר חיידקים דרך צינור קיבה דרך הפה; הבידוד לכן היה גבוה במידה ניכרת מזה מועסק על ידינו. קולוניזציה עם שלושה זני K1 בדקו, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) ו- LH (O75: K1: H3), התרחשה בשיעור גבוה יחסית (48-74%) של K1-האכיל בעלי חיים, אבל מקרים של בקטרמיה, דלקת קרום המוח ולתמותה היו משתנים ונמוכים משמעותי משיעורים של קולוניזציה. הטבע המשובט של א &#39; זיהום ניסיון coli K1 הוקם מאוחר יותר 23 ונראה עכשיו כי רק O18: K1 ו, ובמידה פחותה, O7: קפסיד K1 יכוליםלגרום באופן עקבי זיהום מערכתי. מסיבה זו, החקירות של פתוגנזה של א &#39;neuropathogenic אלה coli K1 היו מבוסס על השימוש בO18 משופר הארסיות: A192PP מתח K1. השוואה של א &#39; האכלת coli K1 של חולדות בילוד דרך צינור קיבה, כפי שGlode ועמיתי 22, ושיטת האכלת טיפה כפי שהיא מתבצעת על ידי הקבוצה של Achtman 23 חשפו מספרים מוגזמים של מוות תוך שימוש בשיטה הקודמת, כמעט בודאות כתוצאה מניזק לרירית משטחים על ידי צינור קיבה. כמו שיעורים של קולוניזציה דומים עם שתי שיטות אלה, מומלץ להשתמש בשיטה פחות פולשנית של האכלת החיידקים באמצעות פיפטה עם טיפ סטרילי, כפי שתואר בתקשורת זו. A192PP זן החיידק המשמש במחקרים שלנו הוא O18: K1. זה הוא נגזר אלים יותר של הזן הקליני E. A192 coli שהתאושש במקור ממטופל עם הרעלת דם 27 </sup&gt;. האלימות המוגברת של הזן הייתה מתקבלת על ידי מעבר סדרתי דרך חולדות ילודות 26. המתח מעורר את חומרת מחלה תלוית גיל, עם בקטרמיה 100% ותמותה כאשר ניתן לבעלי החיים ישנים 2 יום 28. בניגוד לכך, ישנות חיות 9 יום הן לגמרי עמידות למחלות. K1 הספציפי bacteriophage ממס ניתן להשתמש כדי לבדל את ה coli K1 מא האחר coli זני 29. במחקר זה, רגישות של חיידקי קיימא לK1E bacteriophage יש להשתמש כדי (i) לבדוק את הטוהר של E. השעיות coli K1 מוכנות להיות מוזנות לבעלי החיים, וכן (ii) כדי לבדל את E. K1 coli מהקוליפורמים אחרים על מנת לחשב את הכדאיות במטליות פי טבעת, דם ודגימות רקמה. אם המושבה היא E. coli K1, זה יהיה רגיש לתְמוּגָה K1E bacteriophage, והתפתחות חיידקים יהיו מעוכב באתר של חיסון bacteriophage. אם המושבה לא E. coli K1, זה יהיה בדואר עמיד לתְמוּגָה bacteriophage kie, ולא צריך להיות על שטח של התפתחות חיידקים באתר של חיסון bacteriophage. יש לזכור שמודלים של בעלי החיים אינם יכולים לשקף את כל התכונות של המחלה מתרחשת באופן טבעי. המודל הנוכחי יכול להיות שונה כדי לבחון את מאפייני האלימות של חיידקי neuropathogenic אחרים מאשר E. ניתן לאכלס coli A192PP ושינויים בגודל של הבידוד והמיישבים. יישומים עתידיים של הטכניקה יכולים לכלול ההערכה של תרופות נחוצות לטיפול במצב ולחשוף פרטים על תשובות המארח לפלישת קולוניזציה ורקמה. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה אך יעילה. המלטות יחידה של 10-12 גורים הועסקו כקבוצות מבחן או שליטה וגישה בתוך-אפריון זה מבטיחה רמה גבוהה של שחזור ותוקף סטטיסטי. זה הכרחי כי הגורים יוחזרו לאמהות טבעיות שלהם בהקדם האפשרי לאחר כל procedurדואר והמלטות לא צריכים לכן מהווים חיות עוברות התערבויות שונות. חשוב שהבידוד נמאס לחמם אחרת הגורים ידחו את התרבות המוצעת. הגורים לפתח במהירות חיידקים מורכבים ובתוך יומיים של לידה במערכת העיכול היא יישבה עם מגוון רחב של חיידקים מהמערכת הנוספת שהוקמה כחיידקים הנפוצים ביותר במעיים של התינוקות ומבוגרים. גורים שלא היה מאכילים א coli A192PP אינו נושא את ה coli K1 נחישות במערכת העיכול 17 וכן שיעורים של קולוניזציה היא פשוטה יחסית. עם זאת, Neus המבוסס על מתקפות שיטת qPCR לגילוי של מיישבי E. coli K1 הוא הרבה יותר רגיש כי שיטות תרבות מסורתיות, והוא מומלץ בחום 17.

זיהומים חיידקיים מערכתיים הם איום עיקרי לרווחת ולהישרדותו של הוולד; פגים פגיעים במיוחד. דלקת קרום המוח בילוד בקטריאלי (NBM), קשור לעתים קרובות עם אלח דם חיידקים, ממשיך להיות מקור משמעותי לתמותה ותחלואה בשבועות הראשונים לחייהם והבעיה מחריפה בפיתוח המתמשך של התנגדות לתרופות אנטי-בקטריאלי חזית 1,2. מקרה של NBM הוא מצב חירום רפואי שנושא בנטל רפואי, חברתי וכלכלי גבוה 3; כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בתרופות חדשות ו, במיוחד, אסטרטגיות מניעתי רומן להפחית את הנטל של זיהום. חלק מהתכונות של NBM הן יוצאי דופן: בעולם המפותח, Escherichia coli וקבוצת B סטרפטוקוקוס אחראים לרוב הגדול של המקרים ואת היכולת של זנים אלה כדי לעורר NBM כמעט תמיד קשור בנוכחות של CA פוליסכריד מגןpsule המאפשר פתוגן להתחמק הכרה חיסונית מעבד 4. אחוז גבוה מאוד (80-85%) של neuroinvasive E. coli להביע כמוסת K1 5,6, פולימר חומצת polysialic α-2,8 צמוד שהוא מבני זהה לארח מאפננים של פלסטיות עצבית 7. ההערכה של תרופה חדשה ואמצעי מניעה לNBM ובקטרמיה קשורה ואלח דם הייתה ברורה תועלת ממודל של בעלי חיים חזק של זיהום המחקה את התכונות העיקריות של המחלה בילוד האנושי, בפרט בגיל-התלות החזקה והמסלול הטבעי של זיהום . מגוון רחב של מודלים לדלקת קרום המוח חיידקית שלילי גרם גראם-חיובי והם זמינים 8,9 ואלה שיש לי משמעותי הרחיבו את הידע של אפשרויות פתוגנזה, פתופיזיולוגיה וטיפול בזיהומים אלה שלנו. כך, זיהומים ניסיוניים בחולדות, עכברים, ארנבים וקופים היו בשימוש ללמוד דלקת קרום מוח בשני neonate והמבוגר. עם זאת, רבים מהמודלים האלה להעסיק הזרקה תת עורית או intracisternal ישירה של חיידקים לייזום של זיהום, יצירת פתוגנזה מלאכותית על-ידי עקיפת תהליכים טבעיים של הפצה מהאתר של קולוניזציה. בחלק מהמקרים בשיטות של חיסון אלה הביאו לשינויים משמעותיים בפתולוגיה; לדוגמא, מנהל תת-עורי של א &#39; coli זני K1 ביטלו את גיל תלות הקשורים לזיהום הטבעי, ייצור בקטרמיה ופלישה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) בשני ילודים ומבוגרים 10. נטייה לE. coli NBM תלוי באופן קריטי על העברת אנכית של הסוכן סיבתי מאם לתינוק באו מייד לאחר לידת 11. אימהי המופק E. חיידק E. K1 ליישב את מערכת עיכול של ילוד (GI) 11-13, שהוא סטרילי בלידה, אבל במהירות רוכשת חיידקים מורכבים 14. בילודים יישבו, E. coliיש חיידקי K1 יכולת translocate מחלל המעי למחזור הדם המערכתי לפני הכניסה למערכת העצבים המרכזית על פני מחסום הדם-המוח או מחסומי נוזל דם-המוח והשדרה 9,15. העיצוב של דגמים חזקים של זיהום ניסיון צריך לקחת פרטים אלה בחשבון. למרות שעכברים היו בשימוש נרחב למחקר של צורות מסוימות של דלקת קרום מוח חיידקית 8, הם אינם מתאימים ללימודים של זיהום בילוד: הם מוצפים על ידי זיהום מערכתי ולא מראים אופייני תלות גיל החזקה של תינוקות אנושיים 16. יתר על כן, α-defensins, פפטידים מפתח של מערכת עיכול מתן הגנה מפני פלישה מערכתית על ידי א coli K1 17, באים לידי ביטוי מאוד בתאי פנט ונויטרופילים בבני אדם ובחולדות, אך לא בעכברים 18. יש מידה ראויה לציון של כפילות, יתירות וההטרוגניות בdefensin עכבר והגנים cryptidin קשורים לא נמצאה באחרimals 19. העכברוש בילוד שימש בתחילה על ידי Moxon ועמיתים לעבודה 20 לחקור את פתוגנזה של דלקת קרום מוח המופילוס אינפלואנזה הבאה חיסון intranasal, משכפלים את האתר הטבעי של קולוניזציה של הפתוגן בילוד באדם, ולאחר מכן הותאם לתלוי גיל E. בקטרמיה coli K1 ודלקת קרום מוח. Bortolussi et al. 21 זריקת intraperitoneal מועסק של הבידוד החיידקים ליזום זיהום, אך המחקר המרכזי של Glode ועמיתים לעבודת 22 האכלת קיבה דרך הפה בשימוש במקביל לתוואי הטבעי של זיהום לאחר קולוניזציה GI. כצינור הקיבה עלול לגרום נזק משטחים ריריים, ההליך היה מעודן לכלול האכלה של הבידוד לילודים 23. כאן, השיטה להתיישבות מערכת עיכול ונהלים למעקב אחר הזיהומים בגורי חולדה רגישים מתוארים; בנוסף, יישומים טיפוליים ומניעתי של המודל נדונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td>
			<td>Harlan, UK</td>
			<td>www.harlan.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K1 A192PP</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriophage K1E</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0337</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P4417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>E7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>84020 
			Prepare 20-50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Solution</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R0901 
			10&#181;l/mg tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>320099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>C2432</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>322415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped swabs</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>11542483</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcotip Swabs</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>www.scientificlabs.co.uk</td>
			<td>SWA1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P5856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL Universal Tube</td>
			<td>AlphaLaboratories, UK</td>
			<td>www.alphalabs.co.uk</td>
			<td>CW3890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1405-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1415-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;l calibrated loops</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-0112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped spreaders</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-1005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>10594175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12780036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with blunt tips</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12391369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps watchmaker&#39;s curved with very fine points&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12740926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight with very fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12972055</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Scissors</td>
			<td>VWR, UK</td>
			<td>www.vwr.com</td>
			<td>USBE4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Syringe Needles</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
			<td>N2525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>PerkinElmer, UK</td>
			<td>www.perkinelmer.co.uk</td>
			<td>L60000BB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unitemp Incubator</td>
			<td>B&#38;T, UK</td>
			<td></td>
			<td>OP958</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>INFORS HT, UK</td>
			<td>www.infors-ht.com</td>
			<td>AJ118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td>
			<td>IKA Werke</td>
			<td>www.ika.com</td>
			<td>0003737000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

חקירה של יחסי הגומלין בין בעלי החיים ומארח הפתוגן חיידקים היא משמעותית רק אם מודל הזיהום המועסק משכפל את המאפיינים העיקריים של ההדבקה הטבעית. פרוטוקול זה מתאר הליכים להקמה וההערכה של זיהום מערכתי עקב K1 coli Escherichia neuropathogenic בחולדה בילוד. קולוניזציה של מערכת העיכול גורמת להפצה של הפתוגן לאורך מסלול מעי-לימפה-דם-המוח של זיהום והמודל מציג תלות גיל חזקה. זן של א &#39; coli O18: K1 בארסיות משופרת עבור העכברוש בילוד מייצר שיעורים גבוהים במיוחד של קולוניזציה, טרנסלוקציה לתא הדם והפלישה של קרומי המוח הבאים מעבר דרך המקלעת דמית העין. כמו במארח האנושי, חדירה של מערכת העצבים המרכזית מלווה בדלקת מקומית ותוצאה תמיד קטלנית. המודל הוא של שירות מוכח ללימודים של המנגנוןשל פתוגנזה, להערכת התערבויות טיפוליות, ולהערכה של אלימות חיידקים.

E. מודל זיהום מערכתי coli K1 המתואר כאן משכפל רב מהתכונות של ההדבקה הטבעית בבני אדם. החיידקים הם מעובדים, ליישב את מערכת העיכול, translocate לתוך תא הדם דרך בלוטות לימפה mesenteric לפני הקמת מחלה ספציפית לאיבר עם הדלקת הקשורים במוח 24. חשוב לציין, המודל מציג תלות גיל חזקה; כפי שמוצגים באיור 3, גורי חולדה שתי בנות יום (P2) רגישים מאוד למחלה פולשנית אלא על פני תקופה של שבעה ימים והחיות נעשות יותר ויותר עמידות לזיהום, אך לא למערכת עיכול קולוניזציה בדרכי 17. לאחר מעבר מהאתר של קולוניזציה GI לתא הדם, יכולים להיות דמיינו את החיידקים בדגימות דם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4) לפני הכניסה למערכת העצבים המרכזית בעיקר במקלעת דמית העין 25. אצל בעלי חיים מסוימים, יש פלישה נרחבת של איברים מרכזיים אחרים כגוןריאות, טחול וכליות 25. מספרי חיידקים ברקמות יכולים להשתנות באופן משמעותי בין גורים הבודדים 25 אבל כאשר bioburden הוא הבקיע כמו גם בהווה או בנעדר יש רמה גבוהה של שחזור בכל קשור לפלישת איבר. בשגר של 12 גורים כעוקבת בדיקה אחת, חישובי כוח באמצעות ה- G * תוכנת כוח נקבעו כי גודל מדגם זה משווה להסתברות 98.6% להימצאות השפעה המבוססת על הישרדות באמצעות שישה בעלי חיים מהמחזור ו&gt; הסתברות של 99% אם כל שנים עשר נלקחות בחשבון. המודל לכן הוא מתאים להערכה של תרופות חדשות מותאמות במיוחד לטיפול בזיהומים חיידקיים בילוד ונעשה שימוש בהליך כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של הכמוסה depolymerase EndoE כי סלקטיבי מסירה את הקפסולה K1 ממשטח חיידקי 24-26. גם זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות מארח-חיידקים המשפיעים על הטפיחהhogenesis של א &#39; neuropathogens coli; בהקשר זה היא שמשה ללימודים של א &#39; קולוניזציה coli A192PP והפצה. הוכח כי א קולי תאי A192PP להתמיד במערכת העיכול של גורי P2, P5 וP9 במספרים גדולים; היבטים זמניים של קולוניזציה בשלוש קבוצות אלה היו דומים מאוד (איור 5) ומשקפים את היכולת של החיידקים כדי לשכפל ולשמור על צפיפות אוכלוסייה בתוך הבטן. הארסיות של A192 הבודד הקליני הייתה משופר על ידי מעבר סדרתי בחולדות ילודות כדי להבטיח יתירות מעט או ללא שימוש בבעלי חיים. E. coli A192 יישב חולדות ילודות P2 עם 100 יעילות%, שהושרו בקטרמיה ב -35% מבעלי החיים וניב תוצאה קטלנית ב -25% 27. A192PP הנגזר passaged colonizes מערכת העיכול, מייצר בקטרמיה וגורם קטלני בכל גורי P2. כך, המודל יכול להיות מועסק על מנת לחקור את האלימות של דיfferent K1 זנים ביחס ליכולתם לחדור לתוך מערכת העצבים המרכזית ומערכות גוף שונות מהאתר של קולוניזציה. בהקשר זה, Pluschke ועמיתים לעבודה 23 השתמשו במודל זיהום עכברוש בילוד כדי לקבוע את הקיבולת של 95 E. coli K1 זנים ממקור אנושי כדי לגרום לבקטרמיה לאחר קולוניזציה הבטן; הם נצפו וריאציות רחבות ביעילות של שני קולוניזציה ויכולת פולשנית, שבבסיס הטבע המשובט של א &#39; coli K1 neuropathogens. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. חומרים לאוסף רקמות: (א) בקנה מידה במשקל, (ב) צינורות-שקל מראש המכילים תקשורת הכרחית, (ג) פעולת שולחן, שליט ומחטים להצמיד בעלי החיים, 70% (ד) (V / V) אתנול וPBS לעקר ציוד אוסף רקמות, <sטרונג&gt; ערכת איסוף רקמות כוללים זוג מספריים גדול לעריפת הראש והמספריים ופינצטה ולהבים בגדלים שונים ובצורות קרח, (F) לשימור הרקמות (E), (G) 70% (V / V) אתנול לחיטוי שולחן הפעילות ומקיף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2. הפרדה של מערכת העיכול ומערכת הלימפה mesenteric. גריפ ההמוני של מערכת הלימפה mesenteric עם מלקחיים לנתיחה קנס המרכזי מערכת עיכול מערכת הלימפה mesenteric (). גריפ (ב &#39;) החלק הפרוקסימלי של המעי הדק, ומושך בכיוונים מנוגדים. (ג) וseparat מלאדואר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. הישרדות של גורי חולדה יילודים בגילים מ יומיים (P2) לתשעה ימים (P9) לאחר נטילה דרך הפה של א &#39; coli A192PP, הממחיש את תלות גיל החזקה של זיהום מערכתי. כל קבוצה מייצגת 24 ילודים. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4. תמונות הקרינה של ה קולי תאי A192PP בכתם דם מגור P2 נגועים לאחר הנטילה דרך הפה של חיידקים. אנטיגן O lipopolysaccharide על פני השטח של החיידקים היה stained עם נוגדן ארנב נגד O18 polyclonal ונוגדן שני עז-נגד ארנב Alexa546 מצומדות-. כמוסת K1 הייתה דמיינה עם מגיב EndoE-GFP. כמעט כל החיידקים שאותרו בדגימות דם מוצג כמוסת K1 מגן. תמונות שנתפסו על ידי ד&quot;ר אנדריאה Zelmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. E. הממשל הבא קולוניזציה במעי coli A192PP של הבידוד החיידקים. DNA הופק מכל מעי וא רקמת coli K1 המושבה להרכיב יחידות / g (CFU / g) שנקבעה על ידי תגובת השרשרת של פולימראז כמותית (QPCR) מיקוד גן polysialyltransferase (Neus) כפי שמתוארת במקום אחר 17 </sup&gt;. לוד: גבול של זיהוי. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תכונה </td><td> בריא </td><td> לא בריא </td></tr><tr><td> צבע של העור </td><td> ורוד </td><td> חיוור / צהוב </td></tr><tr><td> Agility (רפלקס ליישר) </td><td> גור הופך באופן מיידי על מיקום אחורה </td><td> קושי בהיפוך מיקום לאחור (&gt; 3 שניות) או לא יכול להשיג </td></tr><tr><td> לחץ עדין על הבטן </td><td> אין קול </td><td> קול של תסיסה </td></tr><tr><td> בטן קו חלב / </td><td> גלוי ולבן </td><td> לא נראה לעין </td></tr><tr><td> טמפרטורה </td><td> חם </td><td> * קר יחסית </td></tr><tr><td> משקל </td><td> רווח של 1.5-2 גרם ליום </td><td> ללא עלייה במשקל או ירידה במשקל </td></tr><tr><td> התנהגות כאשר הניחו בכלוב </td><td> נע לכיוון אמא ומתחיל Feeding </td><td> לא יכול לזוז לכיוון אמא ומראה האכלת קושי </td></tr></tbody></table> 1. מערכת שולחן שבע נקודות ניקוד: שלושה הציונים הראשונים ברשימה הן בדרך כלל הסימנים הראשונים שנצפו. * ילודים עם טמפרטורת זיהום מערכתי ניסיון מוגבה גוף (&gt; 2 מעלות צלזיוס). עם זאת, בשל חוסר הגמישות של בעלי החיים כדי להגיע לאמא שלהם כדי לשמור על טמפרטורת גוף, בעלי חיים לא בריאים עשויים להיות מופרדים מהפסולת ומרגישים קר ליד החשופה.

Watch this Scientific Journal Video about Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat at JoVE.com

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

כאן, הליך מתואר להקמת זיהום מערכתי בחולדה היילודים עם תרבויות של Escherichia coli K1. הליך בלתי פולשני זה מאפשר קולוניזציה של מערכת העיכול, טרנסלוקציה של הפתוגן למחזור המערכתי, ופלישה של מערכת העצבים המרכזית במקלעת דמית העין.

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; זיהום בעכברוש הילודים

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.8K Views.  University College London.  כאן, הליך מתואר להקמת זיהום מערכתי בחולדה היילודים עם תרבויות של Escherichia coli K1. הליך בלתי פולשני זה מאפשר קולוניזציה של מערכת העיכול, טרנסלוקציה של הפתוגן למחזור המערכתי, ופלישה של מערכת העצבים המרכזית במקלעת דמית העין. 

Video: Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; חלבון נויטרופילים-הפעלת ביתר<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; במצב אצווה

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...