وأيد هذا العمل عن طريق المنح البحثية G0400268 وMR / K018396 / 1 من مجلس البحوث الطبية، وعمل أبحاث الطبية. وقدمت المزيد من الدعم من قبل المعهد الوطني للكلية لندن المستشفيات مركز البحوث الطبية الحيوية بجامعة بحوث الصحية.

<ol>
	<li>Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+meningitis+in+the+newborn:+a+prospective+study+of+mortality+and+morbidity.">Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity.</a> 23 (5), 218-225 (1999).</li><li>Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+diagnosis,+and+antimicrobial+treatment+of+acute+bacterial+meningitis.">Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).</li><li>Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queir&#243;s, F., Nova, C. V., Lucena, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+newborn+bacterial+meningitis+and+sepsis+during+the+pregnancy+period+for+public+health+care+system+participants+in+Salvador,+Bahia,+Brazil.">Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil.</a> J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).</li><li>Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+of+the+newborn:+basic+mechanisms+and+clinical+correlates.">Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).</li><li>Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K1+capsular+polysaccharide+associated+with+neonatal+meningitis.">Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis.</a> N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).</li><li>Korhonen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hemolysin+production,+and+receptor+recognition+of+Escherichia+coli+strains+associated+with+neonatal+sepsis+and+meningitis.">hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis.</a> Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).</li><li>Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysialic+acid+in+the+plasticity+of+the+developing+and+adult+vertebrate+nervous+system.">Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).</li><li>Koedel, U., Pfister, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+experimental+bacterial+meningitis.">Models of experimental bacterial meningitis.</a> Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).</li><li>Tunkel, A. R., Scheld, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+pathophysiology+of+bacterial+meningiits.">Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits.</a> Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+K1+capsule+is+the+critical+determinant+in+the+development+of+Escherichia+coli+meningitis+in+the+rat.">The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).</li><li>Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+Escherichia+coli+share+common+virulence+factor+profiles,+serotypes+and+phylogeny+with+other+extraintestinal+E.+coli.">Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli.</a> Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).</li><li>Sarff, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Escherichia+coli+K1+in+healthy+and+diseased+newborns.">Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns.</a> Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).</li><li>Schiffer, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+relation+between+invasiveness+and+the+K1+capsular+polysaccharide+of+Escherichia+coli.">A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli.</a> Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).</li><li>Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+infant+intestinal+microbiota.">Development of the human infant intestinal microbiota.</a> PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).</li><li>Nassif, X., Bourdoulous, S., Eug&#232;ne, E., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+extracellular+pathogens+cross+the+blood-brain+barrier.">How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier.</a> Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).</li><li>Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infant+rat+as+a+model+of+bacterial+meningitis.">The infant rat as a model of bacterial meningitis.</a> J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).</li><li>Birchenough, G. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+innate+defenses+in+the+neonatal+gastrointestinal+tract+in+response+to+colonization+by+neuropathogenic+Escherichia+coli.">Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).</li><li>Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+antimicrobial+peptides+of+innate+immunity.">Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).</li><li>Bevins, C. L., Salzman, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells,+antimicrobial+peptides+and+maintenance+of+intestinal+homeostasis.">Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).</li><li>Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+meningitis+in+infant+rats+after+intranasal+inoculation.">Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation.</a> J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).</li><li>Bortolussi, R., Ferrieri, P., Bj&#246;rkst&#233;n, B., Quie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+K1+polysaccharide+of+Escherichia+coli:+relationship+to+virulence+in+newborn+rats+and+resistance+to+phagocytosis.">Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis.</a> Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).</li><li>Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+neonatal+Escherichia+coli+meningitis:+induction+of+bacteremia+and+meningitis+in+infant+rats+fed+E.+coli+K1.">Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1.</a> Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).</li><li>Pluschke, G., Mercer, A., Kuse&#263;ek, B., Pohl, A., Achtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+bacteremia+in+newborn+rats+by+Escherichia+coli+K1+is+correlated+with+only+certain+O+(lipopolysaccharide)+antigen+types.">Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types.</a> Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+capsule-selective+endosialidase+E+minimizes+changes+in+organ+gene+expression+induced+by+experimental+systemic+infection+with+Escherichia+coli+K1.">Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+polysialyl+capsule+during+blood-to-brain+transit+of+neuropathogenic+Escherichia+coli+K1.">Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+cure+of+systemic+Escherichia+coli+K1+infection+by+modification+of+the+bacterial+phenotype.">Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).</li><li>Achtman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+widespread+bacterial+clones+among+Escherichia+coli+K1+isolates.">Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates.</a> Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+Escherichia+coli.+infection+with+recombinant+bacteriophage-derived+capsule+depolymerase.">Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).</li><li>Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacteriophages+specific+for+the+K1+polysaccharide+antigen+of+Escherichia+coli.">Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).</li></ol>

تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

نموذج الحيوان الموصوفة هنا يبني على الأعمال السابقة التي تهدف لإعادة إنتاج السمات البارزة من الالتهابات التي تحدث بشكل طبيعي في البشر. كانوا يعملون الفئران حديثي الولادة في البداية لدراسة التهاب السحايا الرضع بسبب H. النزلية نوع (ب) كما اقتنعت الأنواع المعايير الرئيسية لنموذج قوي للعدوى. وبالتالي، يجب على بوابة دخول العوامل المسببة للأمراض ذات الصلة التي تعكس من العدوى البشرية الطبيعي وتعطي بتكاثر ترتفع إلى أمراض مماثلة لفترة كافية للسماح للتدخل العلاجي. التقنيات المستخدمة يجب أن لا تحد من إمكانية تطبيق هذا الإجراء ويجب أن لا تساهم في نتائج المرض 20. نموذج H. النزلية التهاب السحايا في الفئران الرضع التي وضعتها Moxon وزملاؤه يلبي هذه المعايير 20؛ تحدث العدوى الطبيعي بعد تكرار الاستعمار في الأغشية المخاطية في الجهاز التنفسي العلوي وهذه ميزة مهمة في الفئران الوليدة من غير الصدمةتقطير التشنج من البكتيريا على أغشية الممرات الأنفية. الأهم من ذلك، وتكرر الطبيعة تعتمد على عمر العدوى في النموذج. وكانت نفس المجموعة أيضا أول من وضع نموذجا غير الغازية من E. القولونية K1 NBM في الفئران حديثي الولادة 22. كانت مستعمرة خالية من العوامل الممرضة الجراء سبراج داولي عن طريق تغذية 10 أغسطس - 10 أكتوبر البكتيريا عن طريق أنبوب المعدة عن طريق الفم. كان اللقاح بالتالي أعلى بكثير من تلك المستخدمة من قبلنا. استعمار مع سلالات K1 ثلاثة فحصت، C94 حدث، في نسبة كبيرة نسبيا (48-74٪) من (O7: K1: H-)، EC3 (O1: K1: H-) وLH (H3 O75: K1) الحيوانات K1 التي تغذيها، ولكن حالات تجرثم الدم والتهاب السحايا وفيات متغير وأقل بكثير من معدلات الاستعمار. طبيعة نسيلي من E. تأسست العدوى التجريبية القولونية K1 بعد 23 ومن الواضح الآن أن O18 فقط: K1، وإلى حد أقل، O7: الأنماط المصلية K1 قادرةأن تسبب عدوى باستمرار النظامية. لهذا السبب، فإن هذه التحقيقات من التسبب في ممرض للأعصاب E. واستندت القولونية K1 على استخدام محسنة الفوعة O18: K1 سلالة A192PP. مقارنة بين E. التغذية القولونية K1 من الفئران حديثي الولادة عن طريق أنبوب المعدة، كما يستخدمه Glode وزملاؤه 22، وطريقة التغذية قطرة كما تستخدمها مجموعة Achtman في 23 كشفت أرقام كبيرة من الوفيات باستخدام الأسلوب السابق، يكاد يكون من المؤكد بسبب الأضرار التي لحقت المخاطية السطوح من قبل أنبوب المعدة. كما نسب الاستعمار قابلة للمقارنة مع هاتين الطريقتين، فمن المستحسن استخدام الأسلوب أقل الغازية لتغذية البكتيريا باستخدام ماصة مع طرف عقيمة، كما هو موضح في هذه الاتصالات. كولاي سلالة A192PP المستخدمة في دراساتنا هو O18: K1. وهو مشتق أكثر ضراوة من سلالة السريري E. القولونية A192 التي تم استرداد الأصل من المريض مع تسمم الدم 27 </سوب&gt;. تم الحصول على زيادة الفوعة من سلالة قبل مرور تسلسلي من خلال الفئران حديثي الولادة 26. سلالة يثير لشدة المرض تعتمد على السن، مع 100٪ تجرثم الدم وفيات عندما تدار ل2 يوم 28 الحيوانات القديمة. في المقابل، الحيوانات القديمة يوم 9 مقاومة تماما للمرض. يمكن استخدام K1 محددة الجراثيم التحللي للتمييز E. القولونية E. K1 من الآخرين سلالات القولونية 29. في هذه الدراسة، يجب أن تستخدم حساسية البكتيريا قادرة على البقاء لK1E عاثية إلى (ط) تحقق نقاء E. تعليق القولونية K1 أعدت لتغذية الحيوانات، و (ii) للتمييز E. القولونية K1 من القولونيات أخرى لاحتساب الجدوى في مسحات حول الشرج، والدم وعينات الأنسجة. إذا كانت مستعمرة هي E. القولونية K1، فإنه سيكون عرضة للعاثية K1E تحلل، وسيتم تثبيط نمو البكتيريا في موقع التلقيح عاثية. إذا كانت مستعمرة ليست E. القولونية K1، سيكون بمقاومة للتحلل KIE عاثية البريد، ويجب أن تكون هناك مساحة للنمو البكتيري في موقع التلقيح عاثية. وينبغي أن يوضع في الاعتبار أن النماذج الحيوانية لا يمكن أن تعكس كل مظاهر المرض تحدث بشكل طبيعي. يمكن تعديل النموذج الحالي لدراسة خصائص الفوعة البكتيريا ممرض للأعصاب أخرى من E. يمكن استيعاب القولونية A192PP والاختلافات في حجم اللقاح استعمار. ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية لتقنية تقييم الأدوية التي تشتد الحاجة إليها لعلاج حالة وللكشف عن تفاصيل استجابة المضيف للاستعمار وغزو الأنسجة. الطريقة الموصوفة هنا هو بسيطة لكنها فعالة. تم توظيف 12 الجراء مثل اختبار أو سيطرة الجماعات وهذا النهج داخل القمامة يضمن درجة عالية من التكاثر وصحة الإحصائية - الفضلات واحدة من 10. لا بد من أن يتم إرجاع الجراء لأمهاتهم الطبيعية في أقرب وقت ممكن بعد أي الاجراءلذا لا ينبغي أن تشمل البريد والفضلات الحيوانات تمر التدخلات المختلفة. من المهم أن اللقاح بتغذية أن تكون درجة حرارة وإلا فإن الجراء سيرفض الثقافة المقدمة. الجراء تتطور بسرعة والجراثيم معقدة وخلال يومين من الولادة واستعمرت الجهاز الهضمي مع مجموعة واسعة من البكتيريا من الكائنات الحية من تأسيس مثل الميكروبات الأكثر وفرة في الرضع والبالغين الأمعاء. الجراء التي لم يتم تغذيتها E. القولونية A192PP لا تحمل E. K1 القولونية في الجهاز الهضمي 17 وحتى تحديد معدلات الاستعمار هو بسيط نسبيا. ومع ذلك، المستندة على neuS QPCR طريقة للكشف عن استعمار E. القولونية K1 هو أبعد ما يكون أكثر حساسية أن أساليب الثقافة التقليدية ويوصى بقوة 17.

التهابات جرثومية جهازية تشكل تهديدا كبيرا للرفاه وبقاء الأطفال حديثي الولادة. الخدج أكثر عرضة بشكل خاص. التهاب السحايا الجرثومي حديثي الولادة (NBM)، وكثيرا ما يرتبط مع الإنتان الجرثومي، لا يزال يشكل مصدرا مهما للوفيات والمراضة أثناء الأسابيع القليلة الأولى من الحياة، وتفاقم المشكلة عن طريق التطور المستمر للمقاومة لعقاقير مضادة للجراثيم المواجهة 1،2. وهناك حالة من NBM حالة طبية طارئة أن يحمل عبء الطبي والاجتماعي والاقتصادي المرتفع 3؛ وبالتالي، هناك حاجة ملحة لعلاجات جديدة وخاصة، استراتيجيات وقائية جديدة للحد من عبء المرض. بعض ملامح NBM غير عادية: في العالم المتقدم، كولاي والمكورات العقدية المجموعة الثانية هي المسئولة عن الغالبية العظمى من الحالات وقدرة هذه السلالات لانتزاع NBM يكاد يرتبط دائما مع وجود السكاريد كاليفورنيا الواقيةpsule تمكن الممرض للتهرب من الاعتراف المناعة العمليات 4. وهناك نسبة عالية جدا (80-85٪) من neuroinvasive E. القولونية التعبير عن كبسولة K1 5،6، وهو بوليمر حمض polysialic المرتبطة α-2،8 مطابق هيكليا لاستضافة جهري من اللدونة العصبية 7. ان تقييم علاجات جديدة واقية لNBM وتجرثم الدم والإنتان المرتبطة تستفيد بشكل واضح من نموذج حيواني قوية من العدوى التي يحاكي الملامح الرئيسية لهذا المرض في الوليد البشري، ولا سيما قوية سن التبعية والمسار الطبيعي للعدوى . وهناك مجموعة واسعة من النماذج لالتهاب السحايا الجرثومي إيجابية الجرام وسالبة الجرام متاحة 8،9 وهذه لها بمد كبير معرفتنا خيارات المرضية، الفيزيولوجيا المرضية والعلاج في هذه الالتهابات. وبالتالي، استخدمت الالتهابات التجريبية في الجرذان والفئران والأرانب والقردة لدراسة التهاب السحايا في كل من نeonate والكبار. ومع ذلك، فإن العديد من هذه النماذج تستخدم حقن الصهريج أو تحت الجلد مباشرة من البكتيريا لبدء العدوى، وخلق التسبب الاصطناعي من خلال تجاوز العمليات الطبيعية للنشر من موقع الاستعمار. في بعض الحالات أدت هذه الأساليب التلقيح إلى تغييرات كبيرة في علم الأمراض. على سبيل المثال، الإدارة تحت الجلد من E. ألغت سلالات القولونية K1 للالإعالة العمرية المرتبطة عدوى الطبيعي، وتنتج تجرثم الدم والغزو من الجهاز العصبي المركزي (CNS) في كل من حديثي الولادة والبالغين 10. الاستعداد لE. القولونية NBM يعتمد بشكل حاسم على الانتقال الرأسي للعامل المسبب للمرض من الأم إلى الرضيع عند أو بعد الولادة مباشرة 11. أمومي المستمدة من E. البكتيريا القولونية K1 استعمار الجهاز الهضمي حديثي الولادة (GI) المسالك 11-13، والتي هي عقيمة عند الولادة ولكنه يكتسب الجراثيم معقدة بسرعة 14. في حديثي الولادة المستعمر، E. القولونيةK1 البكتيريا لديها القدرة على نقل من من لمعة الأمعاء إلى الدورة الدموية الجهازية قبل الدخول إلى الجهاز العصبي المركزي في الدماغ عبر الدم أو الدم النخاعي الحواجز السوائل 9،15. تصميم نماذج قوية من العدوى التجريبية يجب أن تأخذ بعين الاعتبار هذه التفاصيل. على الرغم من أن الفئران التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة بعض أشكال التهاب السحايا الجرثومي 8، فهي غير صالحة للدراسات عدوى حديثي الولادة: يتم طغت من قبل الإصابة الجهازية وعدم إظهار السمة الإعالة العمرية قوية للرضع الإنسان 16. وعلاوة على ذلك، defensins α، الببتيدات الرئيسية الجهاز الهضمي توفير الحماية ضد الغزو النظامية التي كتبها E. القولونية K1 17، يتم التعبير بشكل كبير في خلايا بانيت والعدلات في البشر والفئران ولكن ليس في الفئران (18). هناك درجة ملحوظة من الازدواجية والتكرار وعدم التجانس في الماوس defensin والجينات cryptidin ذات الصلة التي لا توجد في غيرها وimals 19. وقد استخدمت الفئران حديثي الولادة في البداية من قبل Moxon وزملاء العمل 20 للتحقيق في الآلية المرضية لالتهاب السحايا المستدمية النزلية بعد التلقيح داخل الأنف، تكرار الموقع الطبيعي للاستعمار هذا الممرض حديثي الولادة في الإنسان، وتكييفها لاحقا لتعتمد على سن E. القولونية K1 تجرثم الدم والتهاب السحايا. Bortolussi وآخرون 21 حقن داخل الصفاق العاملين من اللقاح البكتيري لبدء الإصابة ولكن الدراسة الرئيسية Glode وزملاء العمل 22 المستخدمة للتغذية في المعدة عن طريق الفم موازية الطريق الطبيعي للعدوى بعد GI الاستعمار. كما أنبوب المعدة قد يضر الأسطح المخاطية، وقد تم تطوير هذا الإجراء ليشمل التغذية من اللقاح إلى الأطفال حديثي الولادة 23. هنا، وطريقة للاستعمار الجهاز الهضمي وإجراءات لتتبع العدوى في وصفها الفئران الوليدة الحساسة؛ بالإضافة إلى ذلك، تمت مناقشة التطبيقات العلاجية والوقائية للنموذج.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td>
			<td>Harlan, UK</td>
			<td>www.harlan.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K1 A192PP</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriophage K1E</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0337</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P4417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>E7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>84020 
			Prepare 20-50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Solution</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R0901 
			10&#181;l/mg tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>320099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>C2432</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>322415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped swabs</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>11542483</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcotip Swabs</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>www.scientificlabs.co.uk</td>
			<td>SWA1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P5856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL Universal Tube</td>
			<td>AlphaLaboratories, UK</td>
			<td>www.alphalabs.co.uk</td>
			<td>CW3890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1405-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1415-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;l calibrated loops</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-0112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped spreaders</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-1005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>10594175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12780036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with blunt tips</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12391369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps watchmaker&#39;s curved with very fine points&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12740926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight with very fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12972055</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Scissors</td>
			<td>VWR, UK</td>
			<td>www.vwr.com</td>
			<td>USBE4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Syringe Needles</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
			<td>N2525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>PerkinElmer, UK</td>
			<td>www.perkinelmer.co.uk</td>
			<td>L60000BB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unitemp Incubator</td>
			<td>B&#38;T, UK</td>
			<td></td>
			<td>OP958</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>INFORS HT, UK</td>
			<td>www.infors-ht.com</td>
			<td>AJ118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td>
			<td>IKA Werke</td>
			<td>www.ika.com</td>
			<td>0003737000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

التحقيق في التفاعلات بين المضيف الحيواني والممرض الجرثومي هو معنى فقط اذا كان النموذج إصابة العاملين يعيد ملامح الرئيسية للعدوى الطبيعية. يصف هذا البروتوكول الإجراءات لإنشاء وتقييم العدوى النظامية بسبب ممرض للأعصاب K1 القولونية في الفئران حديثي الولادة. استعمار الجهاز الهضمي يؤدي إلى نشر الممرض على طول مجرى القناة الهضمية-الليمفاوية الدم في الدماغ من الإصابة ويعرض نموذج الإعالة العمرية قوية. سلالة من E. القولونية O18: K1 مع تعزيز الفوعة للجرذ حديثي الولادة ينتج معدلات عالية بشكل استثنائي من الاستعمار، النبات إلى المقصورة الدم وغزو السحايا بعد المرور عبر الضفيرة المشيمية. كما هو الحال في الإنسان المضيف، ويرافق اختراق الجهاز العصبي المركزي التهاب المحلي والنتيجة فتاكة دائما. هذا النموذج هو لفائدة ثبت للدراسات آليةالمرضية، لتقييم التدخلات العلاجية وتقييم الفوعة البكتيرية.

وE. القولونية K1 نموذج العدوى النظامية الموصوفة هنا يتطابق العديد من الميزات من العدوى الطبيعية في البشر. يتم بلعها البكتيريا، استعمار الجهاز الهضمي، نقل من داخل مقصورة الدم عن طريق الغدد الليمفاوية المساريقي قبل إنشاء هيئة خاصة مرض الالتهاب المرتبطة مع الدماغ 24. الأهم من ذلك، يعرض نموذج الإعالة العمرية قوية. كما هو مبين في الشكل (3)، القديمة لمدة يومين (P2) الفئران الوليدة هي عرضة للأمراض الغازية ولكن على مدى فترة سبعة أيام الحيوانات تصبح تدريجيا أكثر مقاوم للعدوى، ولكن ليس إلى الجهاز الهضمي الاستعمار (17). بعد عبور من موقع GI الاستعمار إلى المقصورة الدم والبكتيريا يمكن تصور في عينات الدم بواسطة المجهر مضان (الشكل 4) قبل الدخول إلى الجهاز العصبي المركزي في الغالب في الضفيرة المشيمية 25. في بعض الحيوانات، وهناك اجتياح واسعة من الأجهزة الرئيسية الأخرى مثلالرئة والطحال والكلى 25. أرقام البكتيرية في الأنسجة يمكن أن تختلف بشكل كبير بين الجراء الفردية 25 ولكن عندما سجل bioburden إما موجودة أو غائبة هناك درجة عالية من استنساخ فيما يتعلق الغزو الأعضاء. مع القمامة من 12 الجراء كاختبار جماعة واحدة، حسابات الطاقة باستخدام G * برامج الطاقة أن يكون هذا حجم العينة يساوي احتمال 98.6٪ من إيجاد تأثير بناء على البقاء على قيد الحياة باستخدام ستة حيوانات من الفوج و&gt; 99٪ إذا كانت كل الاحتمالات تؤخذ بعين الاعتبار اثني عشر. هذا النموذج هو بالتالي مناسبة لتقييم وكلاء رواية المصممة خصيصا لعلاج الالتهابات البكتيرية حديثي الولادة، واستخدمت في إجراء تقييم الإمكانات العلاجية من كبسولة depolymerase EndoE التي تزيل بشكل انتقائي الكبسولة K1 من سطح البكتيريا 24-26. ويمكن أيضا أن تستخدم لتحقيق المضيفة للبكتيريا التفاعلات التي تؤثر على باتhogenesis من E. neuropathogens القولونية. ضمن هذا السياق واستخدمت لأنها دراسات E. القولونية A192PP الاستعمار ونشرها. وقد ثبت أن E. لا تزال هناك خلايا القولونية A192PP في الجهاز الهضمي من P2، P5 وP9 الجراء بأعداد كبيرة. وكانت الجوانب الزمنية للاستعمار في هذه المجموعات الثلاث متشابهة جدا (الشكل 5)، وتعكس قدرة البكتيريا لتكرار والحفاظ على الكثافة السكانية داخل القناة الهضمية. تم تعزيز الفوعة للA192 العزلة السريري من قبل مرور التسلسلي في الفئران حديثي الولادة من أجل ضمان التكرار ضئيلة أو معدومة للاستخدام الحيواني. E. استعمرت القولونية A192 P2 الفئران حديثي الولادة مع كفاءة 100٪، أثارت تجرثم الدم في 35٪ من الحيوانات وتنتج تأثير مميت في 25٪ 27. وA192PP مشتق passaged يستعمر الجهاز الهضمي، وتنتج تجرثم الدم ويسبب الفتك في جميع الجراء P2. وبالتالي، فإن النموذج يمكن أن تستخدم للتحقيق في الفوعة للديfferent K1 سلالات فيما يخص قدرتها على غزو الجهاز العصبي المركزي وأجهزة الجسم الأخرى من موقع الاستعمار. في هذا السياق، وتستخدم Pluschke وزملاء العمل 23 لحديثي الولادة نموذج إصابة الفئران لتحديد قدرة 95 E. القولونية K1 سلالات من الأصل البشري للتسبب تجرثم الدم بعد الوتر الاستعمار. لاحظوا اختلافات واسعة في كفاءة وقدرة كل من الاستعمار الغازية، التي تقوم عليها طبيعة نسيلي من E. القولونية K1 neuropathogens. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> الرقم 1. المواد لجمع الأنسجة: (A) على نطاق وزنها، (ب) أنابيب وزنه قبل وسائل الإعلام التي تحتوي اللازمة، (C) عملية الجدول، الحاكم والإبر تحديد ماهيتها الحيوان، (D) 70٪ (V / V) الإيثانول وبرنامج تلفزيوني لتعقيم المعدات جمع الأنسجة، <sترونج&gt; (E) مجموعة جمع الأنسجة بما في ذلك زوج كبير من مقص لقطع الرأس ومقص وملاقط وشفرات مختلف الحجم والأشكال، (F) الثلج للحفاظ على الأنسجة، (G) 70٪ (V / V) الايثانول لتعقيم الجدول عملية والمناطق المحيطة به. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2. فصل الجهاز الهضمي والجهاز اللمفاوي المساريقي. (A) قبضة كتلة مركزية من الجهاز اللمفاوي المساريقي مع ملقط تشريح غرامة. (ب) قبضة الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة، وسحب في اتجاهين متعاكسين. (C) والجهاز الهضمي والجهاز اللمفاوي المساريقي سوف تماما separat(ه) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> الشكل 3. بقاء الجراء الفئران حديثي الولادة الذين تتراوح أعمارهم بين يومين (P2) إلى تسعة أيام (P9) بعد تناوله عن طريق الفم من E. A192PP القولونية، مما يدل على الإعالة العمرية قوية من العدوى النظامية. وتمثل كل مجموعة 24 وليدا. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> الرقم 4. الصور الإسفار من E. وكان مستضد عديد السكاريد الشحمي يا على سطح خلايا البكتيريا القولونية A192PP في مسحة الدم من الجرو P2 المصابة بعد تناوله عن طريق الفم من البكتيريا. الحادي وained مع أرنب الأجسام المضادة بولكلونل مكافحة O18 وAlexa546 مترافق الماعز المضادة للأرنب الضد الثاني. وقد تصور الكبسولة K1 مع EndoE-GFP كاشف. تقريبا كل البكتيريا المكتشفة في عينات الدم عرضها في K1 كبسولة واقية. كانت الصور الملتقطة بواسطة الدكتور أندريا Zelmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. E. تم استخراج كولاي المعوية A192PP الاستعمار الإدارة التالية من اللقاح البكتيري. DNA من الأمعاء كله وE. القولونية K1 مستعمرة / غرام (كفو / ز) الأنسجة التي يحددها الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل (QPCR) استهداف polysialyltransferase (neuS) الجين كما وصفت في أماكن أخرى 17 </suP&gt;. اللد: الحد من الكشف. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ميزة </td><td> صحي </td><td> معتل </td></tr><tr><td> لون البشرة </td><td> وردي </td><td> شاحب / أصفر </td></tr><tr><td> خفة الحركة (المنعكس المقوم) </td><td> الجرو عكس فورا على وضع متخلف </td><td> صعوبة في عكس وضع متخلف (&gt; 3 ثانية) أو لا يمكن تحقيق </td></tr><tr><td> ضغط لطيف على البطن </td><td> أي صوت </td><td> صوت التحريض </td></tr><tr><td> المعدة / خط الحليب </td><td> مرئية والأبيض </td><td> غير مرئية </td></tr><tr><td> درجة الحرارة </td><td> دافئ </td><td> باردا نسبيا * </td></tr><tr><td> الوزن </td><td> كسب 1.5-2 غرام يوميا </td><td> لا زيادة الوزن أو فقدان الوزن </td></tr><tr><td> السلوك عند وضعه في قفص </td><td> خطوات نحو الأم ويبدأ وeeding </td><td> لا يمكن أن تتحرك نحو الأم ومعارض التغذية صعوبة </td></tr></tbody></table> الجدول 1. سبع نقاط نظام التسجيل: الدرجات الثلاث الأولى المدرجة وعادة ما تكون العلامات الأولية المرصودة. * حديثي الولادة مع الإصابة الجهازية تجربة رفع درجة حرارة الجسم (&gt; 2 درجة مئوية). ولكن نظرا لعدم وجود رشاقة من الحيوانات للوصول إلى والدتهما للحفاظ على درجة حرارة الجسم، قد تصبح الحيوانات غير صحية فصلها عن القمامة وتشعر بالبرد في اليد العارية.

Watch this Scientific Journal Video about Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat at JoVE.com

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

هنا، يتم وصف هذا الإجراء لإنشاء العدوى النظامية في الفئران حديثي الولادة مع ثقافات القولونية K1. يسمح هذا الإجراء غير الغازية استعمار الجهاز الهضمي، النبات من الممرض إلى الدوران الجهازي، وغزو النظام العصبي المركزي في الضفيرة المشيمية.

نموذج غير الغازية من ممرض للأعصاب<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; العدوى في الأطفال حديثي الولادة الجرذ

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.8K Views.  University College London.  هنا، يتم وصف هذا الإجراء لإنشاء العدوى النظامية في الفئران حديثي الولادة مع ثقافات القولونية K1. يسمح هذا الإجراء غير الغازية استعمار الجهاز الهضمي، النبات من الممرض إلى الدوران الجهازي، وغزو النظام العصبي المركزي في الضفيرة المشيمي?...

Video: Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

غير الغازية التصوير الضوئي من الأوعية الدموية اللمفية على فأرة الحاسوب

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

واحد خطوة السلبية الكروماتوغرافي تنقية<em&gt; هيليكوباكتر بيلوري</em&gt; بروتين العدلات، تفعيل Overexpressed في<em&gt; كولاي</em&gt; في دفعة واسطة

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

الكشف عن استعمار الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic موريني واستضافة بنظام الإضاءة الحيوية غير الغازية في فيفو

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...