This work was supported by a research grant MOP 119271 to JMW by the Canadian Institute of Health Research. The authors would like to thank Ms. Yao Fang Tan for her outstanding technical assistance.

הערה: כל נהלי בעלי החיים תאמו את הנחיות בריאות ורווחת בעלי החיים של החוג לרפואה באוניברסיטת טורונטו. 1. הכנת Slices בהיפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המכשירים הבאים באמצעות החיטוי היבש ב 125 ° C: ידית אזמל (# 3) (2), מלקחיים דפוס רגילים, (1), מספריים מבתר קטנים גדולים (זווית לצד) (1), כפית מיקרו (כף ושטוחה קצות מרית) (1), מיקרו-מריות (מעוגלות ומעוגלות קצוות מחודדים) (2), מכחול דק (1), אש מלוטשת פיפטה פסטר (2), ריבועי גזה, 2 x 2 אינץ &#39;(5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סטרילי, לשים את המכשירים למכל סטרילי ולשמור מכוסה עד לשימוש. מייד לפני הנתיחה, לטבול את הכלים בפתרון אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת תרבות 6 היטב עם להכניס את התרבות לפני תחילת הליך הנתיחה על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום התרבות / טוב ואחסון הצלחת בחממה ב 35 ° Cnd 5% CO 2. </li></ol> 2. מסדרים כלים Dissection בשכונת סטרילי זרימה למינרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את הזרימה למינרית עם אתנול 70% ולהסיר מכשירי נתיחה מעוקרות מאלכוהול. לאפשר למכשירים לייבוש בזמן מנוחה בצלחת פטרי סטרילי כדי למנוע מגע בין האלכוהול ורקמת המוח גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדה 5-7 מיליליטר של תמיסה לנתח קר כקרח מעוקר ב 2 צלחות פטרי סטרילי גדולות. מנה אחת תהיה להירגע ולנקות את הראש (מלוכלך), והשני לקירור ושטיפת המוח גרף החוצה (הנקי). מניחים נייר סינון מעוקר באחד מהמכסים בצלחת פטרי ללנתח את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר קטן, מעוקר מסנן באחד ממכסת צלחת פטרי הקטנה ללנתח את ההיפוקמפוס. הפקדה 3-5 מיליליטר של תמיסה לנתח קר כקרח מעוקר ב 2 מנות קטנות, סטרילי פטרי. צלחת אחת תחזיק היפוקמפוס גרף החוצה, אחד יחזיק חלקים בהפרדת סעיפים בהיפוקמפוסתחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מסוק הרקמה ידי מקליטה פיסת נייר סינון מעוקר לשלב הגזירה והרכבת סכין גילוח סטרילי. להרטיב את נייר הסינון עם פתרון לנתח מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס ביו-שקית נקייה עם אלכוהול ולמקם אותו בספסל נקי זרימה למינרית. </li></ol> 3. בהיפוקמפוס Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את גור החולדה P7 ספראג Dawley עם אתנול 70% מחוץ לספסל הנקי הזרימה למינרית ולערוף במהירות את בעל החיים באמצעות מספריים ניתוח סטרילי גדולים בתוך הזרימה למינרית הספסל. בואו ראש טיפה לפתרון לנתח קר כקרח באחד מצלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת פטרי, לשטוף את הדם ובמהירות להעביר את הראש לנייר סינון מעוקר, בצד הגחון למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות האזמל, לחתוך לאורך המשטח הגבי במטוס sagittal לחשוף את הגולגולת הבסיסית. חותך דרך העור, אך לא את עצם הבסיס, שהוא רך וקלות חדירה בחולדות של tבגילו. מניח בצד אזמל &quot;מלוכלך&quot; זה ולא להשתמש ברקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המספריים הקטנים המבתר (זווית לצד) ומלקחיים, לחתוך פתוחים הגולגולת לאורך תפר sagittal של הגולגולת לגבחת, הנקודה אנטומיים בגולגולת שבו תפר העטרה הוא הצטלבה בניצב על ידי תפר sagittal. שימוש במלקחיים כדי למשוך דשי גולגולת ומן קו האמצע של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את כף מיקרו על החלק התחתון של המוח, מתחת לגזע המוח, כדי להרים בעדינות את המוח מהגולגולת. הרם את המוח כדי לחשוף את עצבי הראייה ונורת חוש הריח על פני השטח בסיס של מוח. חותך את המבנים האלה עם מספריים קטנים כדי לנתק את המוח באופן מלא מגולגולת. הסר ולהעביר את המוח שלם לצלחת פטרי הגדולה האחרות המכילה פתרון לנתח קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכפית מיקרו, להעביר את המוח למכסה צלחת פטרי קטן המכיל נייר סינון סטרילי. עם פיפטה פסטר סטרילי, יש לשטוף את המוח עם כמה טיפות של דיסsecting פתרון כדי לשמור על רקמה לחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין &quot;נקי&quot; אזמל לחתוך שתי ההמיספרות בנפרד. העבר את האונה השמאלית חזרה לצלחת פטרי גדולה עם כפית מיקרו ומניח את צד פיא חצי כדור למטה בפתרון לנתח קר כקרח לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את הפנים המדיאלי של האונה הימנית ולזהות את fornix הקצה, להקה בולטת של חומר לבן בשולי המדיאלי של ההיפוקמפוס. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך sagittal דרך fornix, אבל דואג כי רק 0.5 סנטימטר של קצה האזמל יהיה מספיק כדי לחתוך את fornix. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 2 מיקרו-מריות, להסיר את ההיפוקמפוס הראשון מאונה ימנית על ידי הנחת יד-המרית ממש על גזע המוח והרמת הקליפה שמעליה עם יד שמאל המרית. רם בעדינות את הקליפה כדי לחשוף את החדר לרוחב ושטח המדיאלי של ההיפוקמפוס. קו מעוגל לבן, fimbria, צריך עכשיו להיות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את העקמומיות של מרית עם Curvaטבעה של fimbria ולוחץ בעדינות המרית תחת fimbria. החלק את המרית עזבה ולרכב לאורך ציר מקורי, זנב ולאחר מכן הרם מרית בכיוון גב כדי להסיר היפוקמפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ההיפוקמפוס לצלחת 2 nd קטן פטרי עם פתרון לנתח קר כקרח. חזור על אותו ההליך באונה השמאלית כדי להסיר את ההיפוקמפוס השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית מיקרו, להעביר בזהירות את hippocampi לבמה מסוק רקמות. מסדרים אותם צמודים ומקביל זה לזה וניצב לציר של להב המסוק. להשתמש במכחול כדי למקם את הרקמה ולהוסיף כמה טיפות של התמיסה לנתח על גבי hippocampi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרקמה ב400 מיקרומטר פרוסות בלי לעצור ולהסיר פרוסות בודדות (בדרך כלל הם לא ידבקו ללהב). אחרי כל ההיפוקמפוס נחתך, להשתמש במכחול כדי להעביר בעדינות את החלקים למנת 2 nd קטן פטרי עם פתרון לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מודעהissecting מיקרוסקופ, להפריד בזהירות את הפרוסות צף באמצעות amicro-מרית ומכחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת התרבות מוכנה מראש עם להכניס את התרבות מן החממה והמקום בזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת, לצייר 4-5 פרוסות לפרוסות פיפטה והעברה למשטח הפסגה של קרום להכניס את התרבות. בשלב הבא, להתאים את המיקום עם מכחול ולהשאיר רווח בין חלקים בודדים והגבול של להכניס את התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר סטרילי, להסיר את הפתרון לנתח העודף ממשטח הפסגה של קרום. הערה: בעוד הסרת להימנע פתרון ציור סעיפי רקמות לתוך פיפטה. לחלופין, להשתמש פיפטה רגילה (P200 או P1000) עם טיפים פיפטה מעוקרים כדי להסיר פתרון לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת התרבות עם מדיום סרום המכיל תרבות והפרוסות בהיפוקמפוס בחזרה לתוך החממה ב 35 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הערה: אם שיחות ניסויליצירת תרבויות מבעלי חיים רבים, לנקות ביסודיות את הספסל נקי הזרימה למינרית בין ניתוחים. חזור מכשירים לפתרון אלכוהול ולהחליף את כל פטרי-מנות, ניירות לסנן וסכיני גילוח סטרילי לפני לנתיחה שנייה. </li></ol> 4. האכלה ושמירת Organotypic Slices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות Feed בספסל נקי זרימה למינרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההאכלה הראשונה של הסעיפים בתרבית 2 ימים לאחר נתיחה. מדיום תרבות הישנה לשאוב באמצעות פיפטה זכוכית מעוקרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 מיליליטר סטרילי פיפטה סרולוגיות להוסיף 1 מיליליטר של מדיום חדש, סטרילי, סרום המכיל את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחליף להכניס את התרבות ולטפל כדי להסיר בועות אוויר שאולי נוצרו מתחת לפני שטח קרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שההנקה הראשונה, לשנות בינוני בכל יום אחר. </li></ol> 5. Slices רקמות דוגרים עם אנלוגים תימידין לייבל יילוד נוירונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת ללמודההתבגרות והאינטגרציה של תאי גרגיר המשונן בהיפוקמפוס, דגירה את פרוסות organotypic עם אנלוגי thymidine, כגון Bromodeoxyuridine (BrdU) או Chlorodeoxyuridine (CldU). כאן, אנו משתמשים CldU בגלל מסיסותו הגבוהה בתמיסת מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3DIV, להוסיף 1 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות CldU מלוחים עד 1 מיליליטר של מדיום התרבות לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. אם BrdU משמש, לתקן את הריכוז להבדלים במשקל מולקולרי. הוסף בינוני עם CldU לבארות תרבות ודגירת רקמה עם CldU המכיל בינוני לשעה 2 ב 35 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 2 שעות של דגירה על 35 ° C, להסיר את מדיום CldU המכיל ולהחליף עם מדיום האכלה קבוע כדי לחדש את לוח הזמנים האכלה רגיל (שתואר לעיל). </li></ol> 6. רקמות קיבוע ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת ציר זמן ליישום טיפולים ותיקון דגימות רקמה לפני תחילת ניסויי תרבות (איור 2). </li> &lt;li&gt; בהודעה לנתיחה-יום שנקבע מראש, להכין את הדברים הבאים במנדף מעבדה: כוס 10-50 מיליליטר המכילה paraformaldehyde 4% (PFA) בופר פוספט (PBS); כוס ריקה למדיום התרבות הושלך; מלקחיים קטנים; ופיפטה 1000 מיליליטר עם טיפים חד פעמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת התרבות (שניות) מתא דגירה והעברה למנדף. הטה את הצלחת מוסיף גם הבודד עם מלקחיים. בשלב הבא, להשתמש פיפטה להסיר מדיום תרבות והעברה לכוס לרשות. הטה את צלחת התרבות בזווית כדי להבטיח שכל מדיום התרבות מוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים הסרת בינונית לצלחת תרבות אחת בכל פעם. כאשר בינוני הוסר, להוסיף 1 מיליליטר של 4% PFA לכל תרבות היטב ולאטום היטב צלחת עם parafilm. חזור על פעולה עבור צלחות תרבות רבות כמו צלחות צורך והעברה למקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להכין את הדברים הבאים במנדף: 10-50 כוס מיליליטר מכילה 0.1% יזידו הנתרן בPBS; ריקכוס לPFA מושלך (בהתאם לצעדי בטיחות כאשר השלכת חומרים רעילים); מלקחיים קטנים; ופיפטה 1000 מיליליטר עם טיפים חד פעמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההליך מתואר ב6.4 להוספת PFA, אבל להוסיף 1 מיליליטר של PBS עם אזיד הנתרן במקום. ברגע שהועבר לחלוטין, צלחות גם חותם לשימוש עתידי על ידי עטיפת קצוות בparafilm ואחסון במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 7. חתך רקמות לאימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע רקמת חתך באמצעות vibratome. שורה של צעדים הבאים לסייע למקסם את התשואה של קטעי רקמה שמישים מתרבויות organotypic. הערה: מייד לאחר נתיחה וציפוי של פרוסות בהיפוקמפוס, יש רקמת עובי של כ 400 מיקרומטר. עם זאת, לאחר 2-3 שבועות בתא הדגירה, פרוסות רקמה תתחיל לשטח, וכתוצאה מכך עובי חלק אחרון של 150-300 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפריטים הבאים לרקמה תרבותית סעיף: # ב 11 אזמללְהַעֲמִיס ולהתמודד, צלחת פטרי זכוכית המכילה PBS קרח קר, מלקחיים מיקרו לנתיחה, ושלב גזירת vibratome נקי לעלות רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל כדי לחתוך בזהירות לאורך ההיקף של קרום להוסיף המעגלי כך שיכול להיות מנותק זה מדיור סוגר הפלסטיק. השאר שטח נרחב בין פרוסה התרבותית והאזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הקרום להוסיף המנותק לצלחת פטרי המכילה PBS. לאחר השטיפה בPBS, להשתמש במלקחיים כדי להעביר את הקרום לשלב ההרכבה vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להשתמש באזמל לחסל קרום עודף סביב פרוסות תרבותיים ולחתוך משם חומר עודף כדי ליצור קצוות נקיים. צעד זה יבטיח את הקרום שטוח ובקלות יכול לדבוק במשטח החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 1-2 טיפות של דבק על הבמה חיתוך vibratome והתפשט באפילו שכבה באמצעות מחט 22 G. מורחים דבק לצורה מלבנית עם מקביל קצה הארוך ללהב החיתוך של vibratome. לבצע שלב זהבמהירות, כדי למנוע הדבקה מייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להעביר את הקרום המכיל גזוז פרוסות בהיפוקמפוס לשלב הגזירה ועדינות למקם את הקרום בדבק ולהבטיח שאין בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדבק המגע מתייבש, להעביר את שלב vibratome עם הקרום מודבק חזרה לצלחת פטרי המכילה PBS. הכן את להב vibratome ויזיד הנתרן המכיל 48 צלחת גם לאחסן קטעי רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בvibratome להפקה 30 מיקרומטר חלקים של הרקמה הפרוסה organotypic והעברה ליזיד הנתרן המכיל 48 צלחת גם לאחסון ומכתים immunohistochemical שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין מראש קיימים פרוטוקולים ל26,29 מכתים immunohistochemical. </li></ol>

<ol>
	<li>Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+modifications+associated+with+synaptic+development+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+organotypic+cultures.">Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures.</a> Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Opitz-Araya, X., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+synaptic+development+in+hippocampal+organotypic+cultures.">Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures.</a> Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).</li><li>Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+differentiation+of+glial+fibrillary+acidic+protein-immunoreactive+glial+cells+in+organotypic+slice+cultures+of+rat+hippocampus.">Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus.</a> Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).</li><li>Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-glucose+deprivation+promotes+gliogenesis+and+microglia+activation+in+organotypic+hippocampal+slice+culture:+involvement+of+metalloproteinases.">Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).</li><li>Subramanian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Lhx2+is+necessary+and+sufficient+to+suppress+astrogliogenesis+and+promote+neurogenesis+in+the+developing+hippocampus.">Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).</li><li>Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+treatment+with+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+inhibitor+SB239063+is+neuroprotective,+decreases+the+number+of+activated+microglia+and+facilitates+neurogenesis+in+oxygen-glucose-deprived+hippocampal+slice+cultures.">Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures.</a> European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).</li><li>Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kainic+acid+induces+rapid+cell+death+followed+by+transiently+reduced+cell+proliferation+in+the+immature+granule+cell+layer+of+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).</li><li>Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+in+an+organotypic+hippocampal+slice+model+of+the+developing+rat+brain:+the+effects+on+N-methyl-D-aspartate+subunit+composition.">Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition.</a> Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).</li><li>Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics.">slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).</li><li>Noraberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+studies+of+brain+damage,+neuroprotection+and+neurorepair.+Current+Drug+Targets.">Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets.</a> CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).</li><li>Berdichevsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-Akt+signaling+activates+mTOR-mediated+epileptogenesis+in+organotypic+hippocampal+culture+model+of+post-traumatic+epilepsy.">PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).</li><li>Koyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+excitation+after+febrile+seizures+induces+ectopic+granule+cells+and+adult+epilepsy.">GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).</li><li>Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interictal+spikes:+harbingers+or+causes+of+epilepsy.">Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy.</a> Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).</li><li>Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+mediates+the+network+activity-dependent+facilitation+of+axonal+outgrowth+from+the+newborn+granule+cells+in+the+early+postnatal+rat+hippocampus.">GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus.</a> The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).</li><li>Raineteau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+labeling+of+newborn+granule+cells+to+visualize+their+integration+into+established+circuits+in+hippocampal+slice+cultures.">Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).</li><li>Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+hippocampal+slice+cultures.">Neurogenesis in hippocampal slice cultures.</a> Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).</li><li>Kamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+spontaneous+neurogenesis+in+the+postnatal+slice+culture+of+rat+hippocampus.">Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus.</a> The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).</li><li>Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+culture+from+the+adult+mouse+brain:+a+versatile+tool+for+translational+neuropsychopharmacology.">Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology &amp; Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).</li><li>Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+hippocampal+slices+as+in+vitro+models+for+neurodegeneration:+Studies+on+cell+viability+and+apoptotic+processes.">Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes.</a> Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).</li><li>Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+granule+layer+cell+count,+cell+density,+and+single-pulse+BrdU+incorporation+in+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures+with+respect+to+culture+medium,+septotemporal+position,+and+time+in+vitro.">Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro.</a> The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).</li><li>Mielke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal,+synaptic,+and+nuclear+protein+changes+associated+with+rat+interface+organotypic+hippocampal+slice+culture+development.">Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development.</a> Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).</li><li>Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+pre-+and+postsynaptic+distribution+of+AMPA+receptors+at+synapses+in+CA3+stratum+radiatum+of+hippocampal+slice+cultures+compared+with+intact+brain.">Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).</li><li>Laplagne, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+convergence+of+neurons+generated+in+the+developing+and+adult+hippocampus.">Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus.</a> PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).</li><li>McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+adult+rats.">Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats.</a> Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).</li><li>Stone, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+convergence+of+developmentally+and+adult-generated+granule+cells+in+dentate+gyrus+circuits+supporting+hippocampus-dependent+memory.">Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory.</a> Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).</li><li>Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogenous+properties+of+dentate+granule+neurons+in+the+adult+rat.">Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat.</a> Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+Methods,+Vol.+1:+Practical+Methods+for+Biological+Morphometry.">Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry.</a> Zeitschrift f&#252;r Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).</li><li>Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA-induced+injury+of+mouse+organotypic+hippocampal+slice+cultures+triggers+delayed+neuroblast+proliferation+in+the+dentate+gyrus:+an+in+vitro+model+for+the+study+of+neural+precursor+cell+proliferation.">NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation.</a> Brain Research. 1359, 22-32 (2010).</li><li>Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+postnatal+injections+of+bromodeoxyuridine+produce+age-dependent+morphological+and+behavioral+abnormalities.">Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).</li><li>Morris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+toxicology+of+5-bromodeoxyuridine+in+mammalian+cells.">The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells.</a> Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).</li><li>Bannigan, J., Langman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+effect+of+5-bromodeoxyuridine+on+the+mammalian+embryo.">The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo.</a> Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).</li><li>Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+that+glitters+isn't+gold:+a+critical+review+of+postnatal+neural+precursor+analyses.">Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).</li><li>Duque, A., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+effects+of+bromodeoxyuridine+and+[3H]thymidine+incorporation+into+DNA+on+cell+proliferation,+position,+and+fate.">Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).</li><li>Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+neurogenesis+in+hippocampal+slice+cultures:+early+in+vitro+labeling+of+neural+precursor+cells+leads+to+efficient+neuronal+production.">Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production.</a> Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בעקבות ממשל CldU (או BrdU), ניתן לבחור את ציר הזמן של יישום של סוכנים תרופתיים למקד DGCs יילוד בחלונות התפתחות מסוימים. לדוגמא, סוכן היפותטי ניתן ליישם במהלך הזרקת שבוע שלאחר CldU השני, שמוצע בקנה אחד עם הגיל של נוירונים בוגרים שנמצאים בשלב ההתפתחותי שבו GABA הוא depolarizing. מחקרים ע...

Adult neurogenesis in the mammalian hippocampus represents a remarkable example of the brain&#8217;s innate capacity for adaptability and plasticity. Dentate granule cells (DGCs) are generated from a renewable pool of neural progenitor cells in the hippocampal dentate gyrus, which is one of the two presently well-characterized neurogenic regions in the mammalian brain, and is thought to be particularly important for learning and memory. The hippocampus is part of the limbic system and has a deep location within the mammalian brain, which makes it a difficult target for precise pharmacological manipulation. Additionally, aberrant neurogenesis has been implicated in conditions, such as epilepsy, schizophrenia, and Alzheimer&#8217;s disease, which has prompted interest in understanding the influence of various pharmacological agents during the maturation and survival of newborn neurons. The distinction between postnatal and adult neurogenesis is blurred and previous studies have shown that many features of in vivo neuronal development in the early postnatal period and adulthood are similar25. Here we emphasize postnatal neurogenesis and suggest possible applications to adult neurogenesis.
Organotypic slice cultures provide an efficient in vitro method for studying various physiological properties of the mammalian hippocampus. The value of slice cultures prepared from rodent brains can be summarized in three main qualities: 1) the protocol is straightforward and requires readily available materials; 2) slice cultures allow for pharmacological studies that eliminate complex variables such as the deep anatomic location of the hippocampus and circumvents the blood brain barrier1; and 3) the well characterized structure of the hippocampus and tri-synaptic circuit is preserved2. Previous investigators have used the organotypic hippocampal culture to study synaptic development and physiology3,4, gliogenesis5-7, ischemic brain damage8,9, neuroprotection and neurorepair10-12 as well as epilepsy13-15.The slice cultures could also provide a useful model system allowing for the monitoring of cell development in conjunction with labeling of cells with green fluorescent protein (GFP) or other vital markers.
Slice cultures have also been previously employed to study postnatal hippocampal neurogenesis16-19, but one important factor in the majority of these studies is the well-characterized degeneration that results from explanting tissue from adult animals after approximately 2 weeks in vitro20,21. For this reason, slice cultures are typically prepared from early post-natal (P5-P10) mice or rat pups, which utilizes the improved viability of early postnatal brain tissue for culturing22. While previous studies have shown that the early postnatal and adult hippocampus differ with regards to synaptic physiology and the expression of specific neuronal subtypes23,24, there is substantial conservation of the choreographed developmental program that newborn dentate granule cells proceed through during maturation25. Additionally, recent studies have suggested that the physiological characteristics of newborn DGCs in culture are very similar to immature neurons in the acute hippocampal slice preparation16.

<table><tbody><tr><td>5-chloro-2&#039;-deoxyuridine (CldU)</td><td>MP Biomedicals</td><td>105478</td><td>Hazardous, Carcinogenic</td></tr><tr><td>Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 &amp;micro;m pore size</td><td>Thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>140660</td><td>Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality.</td></tr><tr><td>Conical Centrifuge tubes (sterile)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Dissector scissors (angled to side)</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11095; liquid</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Eclipse Ni-U fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glue for tissue</td><td>Krazy Glue</td><td>KG585</td><td>Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC.</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Horse Serum Heat Inactivated (500 ml)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Make 50 ml aliquots and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>TW 31KYPBX</td><td></td></tr><tr><td>Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Brand</td><td>FB0875712 and FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipettes</td><td>Sorfa Medical Plastic Co.</td><td>P8050</td><td></td></tr><tr><td>Standard Pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Sterile vacuum filter</td><td>Thermo-Scientific</td><td>565-0020</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Syringe driven filter unit</td><td>Millipore-Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tissue chopper with moveable stage</td><td>Stoelting&amp;nbsp;</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip paintbrush</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic slice cultures for studies of postnatal neurogenesis

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס במוח המכרסם באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו שומרת על המורפולוגיה הטופוגרפית האופיינית של ההיפוקמפוס, ובמקביל לאפשר יישום ישיר של סוכנים תרופתיים לgyrus המשונן בהיפוקמפוס הפיתוח. בנוסף, יכולה להישמר תרבויות פרוסה לתקופה של עד 4 שבועות ובכך, לאפשר אחד כדי ללמוד את תהליך ההבשלה של תאי עצב גרגר יילוד. תרבויות פרוסה לאפשר מניפולציה תרופתית יעילה של פרוסות בהיפוקמפוס ואילו בניכוי משתנים מורכבים כגון אי ודאויות הקשורות למיקום האנטומי העמוק של ההיפוקמפוס, כמו גם את מחסום דם המוח. מסיבות אלה, אנו מבקשים לייעל את התרבויות פרוסה organotypic במיוחד עבור מחקר neurogenesis לאחר לידה.

קביעה אם תרבויות organotypic תהיה מתאימות למחקר neurogenesis למבוגרים נדרש כי הם לספק שני קריטריונים עיקריים: 1) שפרוסות לשמור על תכונות מורפולוגיות אופייניות לפרוסות בהיפוקמפוס לאחר 10-21 ימים במבחנה (DIV), ו -2) שניתן לכמת DGCs היילוד תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical סטנדרטית המועס...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis at JoVE.com

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

organotypic-slice-cultures-for-studies-of-postnatal-neurogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.2K Views.  University of Toronto.  כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי. 

Video: Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

פורסים תרבות Organotypic של E18 מוח החולדה

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Biology

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early postnatal development, cerebellar Purkinje cells are known to go through a vulnerable period, during which they undergo programmed cell death. Here, we provide a detailed protocol to perform mouse organotypic cerebellar slice culture during this critical time. The slices are further labeled to assess Purkinje cell survival and the efficacy of neuroprotective treatments. This method can be extremely valuable to screen for new neuroactive molecules.

Organotypic slice cultures are a powerful tool to study neurodevelopmental or degenerative/regenerative processes. Here, we describe a protocol that models the neurodevelopmental death of Purkinje cells in mouse cerebellar slice cultures. This method may benefit research in neuroprotective drug discovery.

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video