This work is supported by a National Science Foundation award (1145581) to LWG.

הערה: כל ההליך נערך בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות, כפי שאושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. 1 פתרונות ותכשירי מדיה תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל הפתרונות ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. שמור את התקשורת והתרבות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של תקשורת בתרבות 100 מ&quot;ל על ידי ערבוב 1 מ&quot;ל של תמיסת עט סטרפטוקוקוס ו1 מ&quot;ל של ITSX (אינסולין transferrin-סלניום-תוספים) לעם DMEM 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אנזים על ידי ערבוב 250 מ&quot;ל של DMEM, 2.5 מ&quot;ל של 100 מ&quot;מ CaCl 2, ו2.5 מ&quot;ל של 50 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון איון על ידי ערבוב 225 מ&quot;ל של DMEM, 25 מ&quot;ל של FBS, 625 מ&quot;ג של אלבומין, ו625 מעכבי טריפסין מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הפתרון של לוק של 154 mM NaCl, 5.6 מ&quot;מ KCl, 5.0 HEPES מ&quot;מ, 3.6 מ&quot;מ NaHCO3, 5.6 גלוקוז מ&quot;מ. התאם את רמת החומציות ל7.3 עם NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הכן פתרון poly-D-ליזין (PDL) של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל. השתמש בריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לcoverslips מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון תאי של 140 mM NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ-NaOH, ו10 גלוקוז מ&quot;מ. התאם את רמת החומציות ל7.3 עם NaOH עם osmolarity של 310 nmol / קילוגרם ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיפטה של 50 mM NaCl, 100 מ&quot;מ TEACl, 5 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו10 HEPES מ&quot;מ. כדי להתאים את pH 7.3 עם NaOH עם osmolarity של 290 nmol / קילוגרם ~. </li></ol> בידוד .2 הכליה בלוטת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מספריים לנתיחה קטנים וגדולים ושני זוגות מלקחיים. ללבוש כפפות במהלך כל התהליך ולמקם את המגש לנתח בדלי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברים שצולמו ביום 0-3. להרדים חיות עם CO 2 טנק בלחץ ואחריו עריפת ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנצל את הקבוצה קטנה יותר של מספריים כדי לצמצם את החלק האחורי של הגור הבא עמוד השדרה מCervi<html> קאל לזנב אזור. הקפד לחתוך באופן שטחי מתחת לעור ולא לחדור לתוך חלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, עור לקלף מן העמוד שדרה, כך שרירים שנחשפו ליש תצוגה ברורה של עמוד השדרה. מכאן, לעשות חתך transectional בחוט השדרה הצווארי ולאחר מכן לבצע שני חתכים מקבילים לאורך צידי עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים מחזיקים את הגוף העיקרי של בעלי החיים, להשתמש בזוג מלקחיים האחר כדי לתפוס את עמוד השדרה ולקלף את עמוד השדרה עד כליות חשופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע זה, לדמיין את בלוטת יותרת הכליה בחלק העליון של הכליות. לאחר מכן למקם בזהירות שתי בלוטות מכל חיה לתוך צינור חרוטי מלא פתרונו של לוק. הערה: לפעמים הבלוטות תדבק המלקחיים. אם זה המקרה, בעדינות להשתמש זוג נוסף של מלקחיים על מנת לסייע בהסרת הבלוטות מהמלקחיים ולפתרונו של לוק. יכולות להיות כל הזמן הבלוטות במצב הזה עד שעה 2. </li></ol>דואר &quot;&gt; 3. עיכול רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, בועת פתרון האנזים עם 5% CO 2 + 95% O 2 במשך 15 דקות לפני השימוש. ודא כי פתרון equilibrated הופך מצבע ורוד בהיר לצבע ורדרד / כתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את פפאין לפתרון האנזים הטרי מבעבע בריכוז סופי של 20-25 יחידה / מ&quot;ל. דגירה כל זוג בלוטות מכל חיה ל40-60 דקות ב37 מעלות צלזיוס בפתרון האנזים עם פפאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75% מפתרון איון על צינור אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 10 דקות. דגירה זה מנטרלת את פעילות האנזים של פפאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 10 דקות עם פתרון איון, בעדינות להעביר את הבלוטות לתוך צינור שכותרתו חדשה ולאחר מכן לשטוף את הבלוטות 3x עם תקשורת והתרבות. </li></ol> .4 תא דיסוציאציה וציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, הנח שתי בלוטות ל200 μl של התקשורת והתרבות ואז בעדינות לכייל את הבלוטות ולמטה דרך קצה פיפטה עם טפטפת 200 μl עד שהוא כבר לא חתיכה גדולה של רקמה בפתרון. הערה: כאשר titrating, לשמור על בלוטות בחלק התחתון של הצינור עם כוח כלפי מטה מקצה פיפטה 200 μl ולעסוק הרקמות בעדינות ובאיטיות. להיות בטוח לשימוש תנועות איטיות, מתמשכים, אף פעם לא pipetting מהיר או פתאומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תקשורת ותרבות 250 μl נוספת להביא עד 450 μl הנפח הכולל של תקשורת בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 60 μl של פתרון המכיל תא זה על כל אחד משבעה coverslips 12 מ&quot;מ מצופה PDL מראש, אשר ממוקמים בצלחת תרבות 60 x 15 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצופים ברגע, מניח את הצלחת לתוך החממה שנקבעה ל37 מעלות צלזיוס ומתוחזק עם זרימה / אספקה ​​קבועה של 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי להבטיח סביבה לכדאיויות תא. לאחר דגירה, בעדינות להוסיף 5 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות מראש חימם לצלחת התרבות ולהחזיר את הצלחת בחזרה לתוך החממה ל24 שעות לפני תא נספחהקלטות ד. הערה: בדרך כלל, התאים יכולים לשמש לקלטות אלקטרו עד 4 ימים. </li></ol> .5 סלולארי גיבוש זיהוי וGigaohm חותם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip 12 מ&quot;מ לפתרון תאי. מאז בלוטת יותרת הכליה השלמה משמשות להכנת תא, לערבב את תאי chromaffin (בדרך כלל בהירים מאוד עם חום / צביעה בצבע בז&#39; וצורה מעגלית מושלמת ליד (איור 1) בתרבות עם תאים בקליפת המוח (קטנים ועמומים יותר chromaffin תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את טפטפות התיקון בארבעה שלבים באמצעות חולץ P-97 לתכנות. טובלים את קצה פיפטה לתוך שעווה מותכת, שיעזור להפחית את הקיבול של הזכוכית ולאחר מכן לירות פולני טיפ ל&quot; לפוצץ משם &quot;שעווה זה מחלק הפנימי של קצה פיפטה. הערה: כאשר מלא פתרון פיפטה התיקון, יש לי טפטפות תיקון בדרך כלל התנגדות של ~ 2 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרב לפיפטה התיקון הקרובה לתא בתוך כמה מ &#39;icrons. כדי להשיג תצורה המצורפת תא, לחפש כל עיוות תא קלה במהלך הגישה של פיפטה התיקון הקרוב יותר לתא. החל שאיבה עדינה עד חותם GΩ מושגת. </li></ol> .6 הקלטות קיבוליות-מצורף סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחותם GΩ מתגלה, לבצע הקלטות מצורפים תא באמצעות מגבר EPC-7 בתוספת תיקון מהדק ומגבר נעילה ב אנלוגי שני שלבים (ראה טבלה המצורפת של ציוד). החל sinewave עם משרעת של 50 mV (RMS) ותדירות של 20 kHz ממגבר הנעילה ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מסנן המוצא של מגבר הנעילה ב 1 בקבוע זמן אלפיות שני ו24 db. הגדר את השלב של מגבר הנעילה ב כך ששינויי קיבול זמניים המיוצרים על ידי פולסים שאיבה עדינים מופיעים רק בזכר קיבול תיקון (Im) ללא הקרנה לזכר מוליכות תיקון (Re) (איור 2). הערה: אנא ראה את הפרטים לכיול של המערכת מחדשפרנץ 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות טיפוסי קיבול שינויים בצעדים &quot;כלפי מטה&quot; (איור 3). הערה: הקלטה מוצקה תיחשב כסוג דמיון &quot;מדרגות&quot; עם הרבה צעדים כלפי מטה, דבר המצביע על הפנמת שלפוחית ​​אחת. תהליך התיקון משמש כגירוי מכאני מאז נוכחי פעולה יכולה להיות מוקלטת בדרך כלל מרוב התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם קבצים כתיקיות בודדות כולל תאריך: MM / DD / שנה וכל הקלטה המצורפת סלולארי כשל המספור בודד (xx) בתוך קובץ ש. </li></ol>

<ol>
	<li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca++-triggered+exocytosis.">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li><li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion.">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li><li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore.">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li><li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules,+measured+in+the+cell-attached+configuration.">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li><li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel.">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li><li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+amperometry:+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release.">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na++influx+through+the+fusion+pore.">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li><li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells.">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li><li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li><li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2++dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li><li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal.">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li><li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses.">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li><li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations.">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li><li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells.">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li><li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+inhibition+of+endocytosis:+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G(z).">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li><li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles.">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מדידות קיבול מצורף תא דורשות כמה שלבים קריטיים על מנת להשיג הצלחת הקלטות באיכות גבוהה: 1) תאי קיימא ובריאים שהוכנו מבלוטת יותרת הכליה; 2) ציפוי PDL של coverslips; 3) היווצרות חותמת gigaohm; רמת רעש של המערכת 4); ו5) תיקון שלב. לניתוח של בעלי חיים, ?...

שידור סינפטי מתווך על ידי exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית המכיל מוליך עצבי, ושלפוחית ​​אלה חייבת לעבור מחזור endocytic מקומי במסוף העצב לשמור על תקשורת עצבית בטווח הארוך. בהתחשב בתפקיד החיוני של שידור סינפטי במוח, הבנת המנגנון המולקולרי המהווה את מעגל השלפוחית ​​הסינפטית הוא בסיס חיוני להבנה טובה יותר בתקשורת הסלולרית בכללותו. בין מערכות מודל תא, תא chromaffin יותרת הכליה סיפק כמה תובנות העקרוניות ביותר למכונות מולקולריות שבבסיס מחזור שלפוחית ​​הסינפטית. Exocytosis, השלב האחרון בשחרור הנוירוטרנסמיטר, נחקר מאוד ובחן באמצעות השימוש בתאי chromaffin יותרת הכליה 1,2. למעשה, רוב השחקנים המולקולריים שלתזמר את ההיווצרות, מיקוד, עגינה, ושילוב של גרגרי הפרשה זוהו בשל יישום של divטכניקות erse בתאי chromaffin 1. יתר על כן, על ידי מתן הזדמנות לאפשר לרזולוציה יחידה שלפוחית ​​של מכונות החלבון מעורבות בexocytosis, תא chromaffin נשאר מודל רב עוצמה כדי לענות על השאלות של שלפוחית ​​היתוך 3. מדידות קיבול מצורף תא נוצלו ראשונה בפתרון היתוך יחיד שלפוחית ​​במהלך exocytosis 3. Exocytosis של שלפוחית ​​קטנה כמו ~ 60 ננומטר בקוטר הוכח להיות מזוהה על ידי מדידות להתקבל קרום תא עם טכניקת מהדק תיקון בתצורת התא מצורף 4-7. אדמיטנס מוגדר כמדד של כמה בקלות מעגל או התקן יאפשר לזרם לזרום; זה הוא ההופכי של עכבה. לפיכך, מדידות להתקבל לספק הבנה של קיבול הקרום. המטרה זו מושגת על ידי השילוב של קרום לפוחי לתוך קרום הפלזמה; התאגדות זו חושפת שינויים במשטחאזור 8. כל שלפוחית ​​פיוזינג גורמת לעלייה הדרגתית ב9,10 קיבול קרום. בנוסף, מדידה להתקבל זה מספקת את מוליכות הממברנה ומוליכות נקבוביות ההיתוך במהלך אירוע exocytotic 3. כטכניקה זו סיפקה כלי ייחודי בזיהוי קינטיקה יחידה שלפוחית ​​במהלך exocytosis, המעבדה שלנו לאחרונה מיושמת תפיסה זו כדי לזהות אנדוציטוזה של שלפוחית ​​אחת 11,12. העניין הספציפי שלנו הוא אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME), שכבר נחשב כמרכיב ניהול משק בית בסיסי בתאים רבים 13 וכדרך הראשית לאנדוציטוזה שלפוחית ​​הסינפטית במסופים עצביים 14,15. CME ידוע להיות חשוב מבחינה ביולוגית, לעומת זאת, קינטיקה שלה תישאר לא מובנת היטב בשל מגבלות טכניות בניטור אירועי endocytic ייחודיים. בהתחשב בקווי הדמיון במנגנוני exocytic בין תאים ונוירונים 1 chromaffin, זה plausible שמנגנוני הביקוע בתאי chromaffin עשויים עשויים לחול על אנדוציטוזה שלפוחית ​​הסינפטית בתאי עצב. מדידות הקיבול מצורף התא כבר נוצלו כדי לעקוב אחר אירועי endocytic בודדים ולנתח את קינטיקה הביקוע, שרוב השיטות לא מצליחות לפתור. בהקלטות מצורפים התא שלנו, גל סינוס ב20 kHz משולב לתוך פוטנציאל ההחזקה, והתפוקה הנוכחית מופרד למוליכות קרום בקיבול ערוץ וקרום אחד בערוץ האחר משני שלבי נעילה ב מגבר 16- 18. מהשינויים במוליכות הממברנה וקיבול, ניתן לחשב את קינטיקה של הביקוע נקבובי, שסביר להניח מתאים לצוואר קרום הצינור שמחבר את שלפוחית ​​ההפנמה לקרום הפלזמה לפני שלפוחית ​​קמצוץ-off. באופן קולקטיבי, טכניקה זו נותנת לנו את ההזדמנות כדי לבחון את מנגנוני הוויסות של ביקוע שלפוחית ​​במהלך CME.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>Keep out of UV</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Carolina Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Insulin-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>Only thaw on ICE!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus patch amplifier</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 data acquisition board</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor data acquisition software</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Outer diameter: 1.5 mm&lt;br /&gt;
Inner diameter: 1.10 mm&lt;br/&gt;
Length: 10 cm</td></tr></tbody></table>

methods for cell-attached capacitance measurements in mouse adrenal chromaffin cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

כדאיות התא והאיכות של חותם gigaohm הן קריטיות בקביעת האיכות של הקלטות קיבול מצורף תא. לכן, זה קריטי כדי להשיג תרבית תאים אפקטיבית ויעילה לפני קלטות אלקטרו, ותאי קיימא טיפוסיים באיור 1. העיסוק והזמן יהיה מועילים בהשגת חותם gigaohm עם איכות גבוהה. אם אחד יכול לראות בבי...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell at JoVE.com

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

methods-for-cell-attached-capacitance-measurements-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  University of Illinois at Chicago. After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Video: Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex.  The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting. This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex. The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

עכבר בידוד הכליה Chromaffin Cell

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Biology

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunology and Infection

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity and the amount of neurotransmitter released from vesicles in single exocytosis events. It has been suggested that the reduction in neurotransmitters expelled is due to alterations in membrane biophysical properties when cells shrink in response to osmotic stress and with assumptions made that secretory vesicles in the cell cytoplasm are not affected by extracellular osmotic stress. Amperometry recording of exocytosis monitors what is released from cells the moment a vesicle fuses with the plasma membrane, but does not provide information on the vesicle content before the vesicle fusion is triggered. Therefore, by combining amperometry recording with other complementary analytical methods that are capable of characterizing the secretory vesicles before exocytosis at cells is triggered offers a broader overview for examining how secretory vesicles and the exocytosis process are affected by osmotic shock. We here describe how complementing amperometry recording with intracellular electrochemical cytometry and transmission electron microscopy (TEM) imaging can be used to characterize alterations in secretory vesicles size and neurotransmitter content at chromaffin cells in relation to exocytosis activity before and after exposure to osmotic stress. By linking the quantitative information gained from experiments using all three analytical methods, conclusions were previously made that secretory vesicles respond to extracellular osmotic stress by shrinking in size and reducing the vesicle quantal size to maintain a constant vesicle neurotransmitter concentration. Hence, this gives some clarification regarding why vesicles, in response to osmotic stress, reduce the amount neurotransmitters released during exocytosis release. The amperometric recordings here indicate this is a reversible process and that vesicle after osmotic shock are refilled with neurotransmitters when placed cells are reverted into an isotonic environment.

Osmotic stress affects exocytosis and the amount of neurotransmitter released during this process. We demonstrate how combining electrochemical methods together with transmission electron microscopy can be used to study the effect of extracellular osmotic pressure on exocytosis activity, vesicle quantal size, and the amount of neurotransmitter released during exocytosis.

ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal microscopy was used in combination with patch-clamp recording to detect three fusion modes in primary culture bovine adrenal chromaffin cells. The three fusion modes include 1) close-fusion (also called kiss-and-run), involving fusion pore opening and closure, 2) stay-fusion, involving fusion pore opening and maintaining the opened pore, and 3) shrink-fusion, involving shrinkage of the fusion-generated &#937;-shape profile until it merges completely at the plasma membrane.
To detect these fusion modes, the plasma membrane was labeled by overexpressing mNeonGreen attached with the PH domain of phospholipase C &#948; (PH-mNG), which binds to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) at the cytosol-facing leaflet of the plasma membrane; vesicles were loaded with the fluorescent false neurotransmitter FFN511 to detect vesicular content release; and Atto 655 was included in the bath solution to detect fusion pore closure. These three fluorescent probes were imaged simultaneously at ~20-90 ms per frame in live chromaffin cells to detect fusion pore opening, content release, fusion pore closure, and fusing vesicle size changes. The analysis method is described to distinguish three fusion modes from these fluorescence measurements. The method described here can, in principle, apply to many secretory cells beyond chromaffin cells.

This protocol describes a confocal imaging technique to detect three fusion modes in bovine adrenal chromaffin cells. These fusion modes include 1) close-fusion (also called kiss-and-run), involving fusion pore opening and closure, 2) stay-fusion, involving fusion pore opening and maintaining the opened pore, and 3) shrink-fusion, involving fused vesicle shrinkage.

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Camera-based Measurements of Intracellular [Na+] in Murine Atrial Myocytes

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the sarcolemmal Na+/Ca2+ exchanger, the behavior of voltage-gated Na+ channels and the Na+,K+-ATPase. Intracellular Ca2+ signaling is altered in atrial diseases such as atrial fibrillation. While many of the mechanisms underlying altered intracellular Ca2+ homeostasis are characterized, the role of [Na+]i and its dysregulation in atrial pathologies is poorly understood. [Na+]i in atrial myocytes increases in response to increasing stimulation rates. Responsiveness to external field stimulation is therefore crucial for [Na+]i measurements in these cells. In addition, the long preparation (dye-loading) and experiment duration (calibration) require an isolation protocol that yields atrial myocytes of exceptional quality. Due to the small size of mouse atria and the composition of the intercellular matrix, the isolation of high quality adult murine atrial myocytes is difficult. Here, we describe an optimized Langendorff-perfusion based isolation protocol that consistently delivers a high yield of high quality atrial murine myocytes.
Sodium-binding benzofuran isophthalate (SBFI) is the most commonly used fluorescent Na+ indicator. SBFI can be loaded into the cardiac myocyte either in its salt form through a glass pipette or as an acetoxymethyl (AM) ester that can penetrate the myocyte&#8217;s sarcolemmal membrane. Intracellularly, SBFI-AM is de-esterified by cytosolic esterases. Due to variabilities in membrane penetration and cytosolic de-esterification each cell has to be calibrated in situ. Typically, measurements of [Na+]i using SBFI whole-cell epifluorescence are performed using a photomultiplier tube (PMT). This experimental set-up allows for only one cell to be measured at one time. Due to the length of myocyte dye loading and the calibration following each experiment data yield is low. We therefore developed an EMCCD camera-based technique to measure [Na+]i. This approach permits simultaneous [Na+]i measurements in multiple myocytes thus significantly increasing experimental yield.

<meta charset="utf8"></head><body>מדידות מבוססות מצלמה של תוך-תאיים [Na+] במיוציטים פרוזדוריים של עכברים

The intracellular Na+ concentration ([Na+]i) in cardiac myocytes is altered during cardiac diseases. [Na+]i is an important regulator of intracellular Ca2+. We introduce a novel approach to measure [Na+]i in freshly isolated murine atrial myocytes using an electron multiplying charged coupled device (EMCCD) camera and a rapid, controllable illuminator.

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video