This work is supported by a National Science Foundation award (1145581) to LWG.

הערה: כל ההליך נערך בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות, כפי שאושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. 1 פתרונות ותכשירי מדיה תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל הפתרונות ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. שמור את התקשורת והתרבות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של תקשורת בתרבות 100 מ&quot;ל על ידי ערבוב 1 מ&quot;ל של תמיסת עט סטרפטוקוקוס ו1 מ&quot;ל של ITSX (אינסולין transferrin-סלניום-תוספים) לעם DMEM 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אנזים על ידי ערבוב 250 מ&quot;ל של DMEM, 2.5 מ&quot;ל של 100 מ&quot;מ CaCl 2, ו2.5 מ&quot;ל של 50 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון איון על ידי ערבוב 225 מ&quot;ל של DMEM, 25 מ&quot;ל של FBS, 625 מ&quot;ג של אלבומין, ו625 מעכבי טריפסין מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הפתרון של לוק של 154 mM NaCl, 5.6 מ&quot;מ KCl, 5.0 HEPES מ&quot;מ, 3.6 מ&quot;מ NaHCO3, 5.6 גלוקוז מ&quot;מ. התאם את רמת החומציות ל7.3 עם NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הכן פתרון poly-D-ליזין (PDL) של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל. השתמש בריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לcoverslips מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון תאי של 140 mM NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ-NaOH, ו10 גלוקוז מ&quot;מ. התאם את רמת החומציות ל7.3 עם NaOH עם osmolarity של 310 nmol / קילוגרם ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיפטה של 50 mM NaCl, 100 מ&quot;מ TEACl, 5 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו10 HEPES מ&quot;מ. כדי להתאים את pH 7.3 עם NaOH עם osmolarity של 290 nmol / קילוגרם ~. </li></ol> בידוד .2 הכליה בלוטת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מספריים לנתיחה קטנים וגדולים ושני זוגות מלקחיים. ללבוש כפפות במהלך כל התהליך ולמקם את המגש לנתח בדלי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברים שצולמו ביום 0-3. להרדים חיות עם CO 2 טנק בלחץ ואחריו עריפת ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנצל את הקבוצה קטנה יותר של מספריים כדי לצמצם את החלק האחורי של הגור הבא עמוד השדרה מCervi<html> קאל לזנב אזור. הקפד לחתוך באופן שטחי מתחת לעור ולא לחדור לתוך חלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, עור לקלף מן העמוד שדרה, כך שרירים שנחשפו ליש תצוגה ברורה של עמוד השדרה. מכאן, לעשות חתך transectional בחוט השדרה הצווארי ולאחר מכן לבצע שני חתכים מקבילים לאורך צידי עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים מחזיקים את הגוף העיקרי של בעלי החיים, להשתמש בזוג מלקחיים האחר כדי לתפוס את עמוד השדרה ולקלף את עמוד השדרה עד כליות חשופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע זה, לדמיין את בלוטת יותרת הכליה בחלק העליון של הכליות. לאחר מכן למקם בזהירות שתי בלוטות מכל חיה לתוך צינור חרוטי מלא פתרונו של לוק. הערה: לפעמים הבלוטות תדבק המלקחיים. אם זה המקרה, בעדינות להשתמש זוג נוסף של מלקחיים על מנת לסייע בהסרת הבלוטות מהמלקחיים ולפתרונו של לוק. יכולות להיות כל הזמן הבלוטות במצב הזה עד שעה 2. </li></ol>דואר &quot;&gt; 3. עיכול רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, בועת פתרון האנזים עם 5% CO 2 + 95% O 2 במשך 15 דקות לפני השימוש. ודא כי פתרון equilibrated הופך מצבע ורוד בהיר לצבע ורדרד / כתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את פפאין לפתרון האנזים הטרי מבעבע בריכוז סופי של 20-25 יחידה / מ&quot;ל. דגירה כל זוג בלוטות מכל חיה ל40-60 דקות ב37 מעלות צלזיוס בפתרון האנזים עם פפאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75% מפתרון איון על צינור אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 10 דקות. דגירה זה מנטרלת את פעילות האנזים של פפאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 10 דקות עם פתרון איון, בעדינות להעביר את הבלוטות לתוך צינור שכותרתו חדשה ולאחר מכן לשטוף את הבלוטות 3x עם תקשורת והתרבות. </li></ol> .4 תא דיסוציאציה וציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, הנח שתי בלוטות ל200 μl של התקשורת והתרבות ואז בעדינות לכייל את הבלוטות ולמטה דרך קצה פיפטה עם טפטפת 200 μl עד שהוא כבר לא חתיכה גדולה של רקמה בפתרון. הערה: כאשר titrating, לשמור על בלוטות בחלק התחתון של הצינור עם כוח כלפי מטה מקצה פיפטה 200 μl ולעסוק הרקמות בעדינות ובאיטיות. להיות בטוח לשימוש תנועות איטיות, מתמשכים, אף פעם לא pipetting מהיר או פתאומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תקשורת ותרבות 250 μl נוספת להביא עד 450 μl הנפח הכולל של תקשורת בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 60 μl של פתרון המכיל תא זה על כל אחד משבעה coverslips 12 מ&quot;מ מצופה PDL מראש, אשר ממוקמים בצלחת תרבות 60 x 15 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצופים ברגע, מניח את הצלחת לתוך החממה שנקבעה ל37 מעלות צלזיוס ומתוחזק עם זרימה / אספקה ​​קבועה של 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי להבטיח סביבה לכדאיויות תא. לאחר דגירה, בעדינות להוסיף 5 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות מראש חימם לצלחת התרבות ולהחזיר את הצלחת בחזרה לתוך החממה ל24 שעות לפני תא נספחהקלטות ד. הערה: בדרך כלל, התאים יכולים לשמש לקלטות אלקטרו עד 4 ימים. </li></ol> .5 סלולארי גיבוש זיהוי וGigaohm חותם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip 12 מ&quot;מ לפתרון תאי. מאז בלוטת יותרת הכליה השלמה משמשות להכנת תא, לערבב את תאי chromaffin (בדרך כלל בהירים מאוד עם חום / צביעה בצבע בז&#39; וצורה מעגלית מושלמת ליד (איור 1) בתרבות עם תאים בקליפת המוח (קטנים ועמומים יותר chromaffin תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את טפטפות התיקון בארבעה שלבים באמצעות חולץ P-97 לתכנות. טובלים את קצה פיפטה לתוך שעווה מותכת, שיעזור להפחית את הקיבול של הזכוכית ולאחר מכן לירות פולני טיפ ל&quot; לפוצץ משם &quot;שעווה זה מחלק הפנימי של קצה פיפטה. הערה: כאשר מלא פתרון פיפטה התיקון, יש לי טפטפות תיקון בדרך כלל התנגדות של ~ 2 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרב לפיפטה התיקון הקרובה לתא בתוך כמה מ &#39;icrons. כדי להשיג תצורה המצורפת תא, לחפש כל עיוות תא קלה במהלך הגישה של פיפטה התיקון הקרוב יותר לתא. החל שאיבה עדינה עד חותם GΩ מושגת. </li></ol> .6 הקלטות קיבוליות-מצורף סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחותם GΩ מתגלה, לבצע הקלטות מצורפים תא באמצעות מגבר EPC-7 בתוספת תיקון מהדק ומגבר נעילה ב אנלוגי שני שלבים (ראה טבלה המצורפת של ציוד). החל sinewave עם משרעת של 50 mV (RMS) ותדירות של 20 kHz ממגבר הנעילה ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מסנן המוצא של מגבר הנעילה ב 1 בקבוע זמן אלפיות שני ו24 db. הגדר את השלב של מגבר הנעילה ב כך ששינויי קיבול זמניים המיוצרים על ידי פולסים שאיבה עדינים מופיעים רק בזכר קיבול תיקון (Im) ללא הקרנה לזכר מוליכות תיקון (Re) (איור 2). הערה: אנא ראה את הפרטים לכיול של המערכת מחדשפרנץ 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות טיפוסי קיבול שינויים בצעדים &quot;כלפי מטה&quot; (איור 3). הערה: הקלטה מוצקה תיחשב כסוג דמיון &quot;מדרגות&quot; עם הרבה צעדים כלפי מטה, דבר המצביע על הפנמת שלפוחית ​​אחת. תהליך התיקון משמש כגירוי מכאני מאז נוכחי פעולה יכולה להיות מוקלטת בדרך כלל מרוב התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם קבצים כתיקיות בודדות כולל תאריך: MM / DD / שנה וכל הקלטה המצורפת סלולארי כשל המספור בודד (xx) בתוך קובץ ש. </li></ol>

<ol>
	<li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca++-triggered+exocytosis.">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li><li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion.">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li><li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore.">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li><li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules,+measured+in+the+cell-attached+configuration.">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li><li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel.">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li><li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+amperometry:+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release.">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na++influx+through+the+fusion+pore.">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li><li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells.">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li><li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li><li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2++dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li><li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal.">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li><li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses.">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li><li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations.">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li><li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells.">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li><li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+inhibition+of+endocytosis:+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G(z).">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li><li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles.">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מדידות קיבול מצורף תא דורשות כמה שלבים קריטיים על מנת להשיג הצלחת הקלטות באיכות גבוהה: 1) תאי קיימא ובריאים שהוכנו מבלוטת יותרת הכליה; 2) ציפוי PDL של coverslips; 3) היווצרות חותמת gigaohm; רמת רעש של המערכת 4); ו5) תיקון שלב. לניתוח של בעלי חיים, ?...

שידור סינפטי מתווך על ידי exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית המכיל מוליך עצבי, ושלפוחית ​​אלה חייבת לעבור מחזור endocytic מקומי במסוף העצב לשמור על תקשורת עצבית בטווח הארוך. בהתחשב בתפקיד החיוני של שידור סינפטי במוח, הבנת המנגנון המולקולרי המהווה את מעגל השלפוחית ​​הסינפטית הוא בסיס חיוני להבנה טובה יותר בתקשורת הסלולרית בכללותו. בין מערכות מודל תא, תא chromaffin יותרת הכליה סיפק כמה תובנות העקרוניות ביותר למכונות מולקולריות שבבסיס מחזור שלפוחית ​​הסינפטית. Exocytosis, השלב האחרון בשחרור הנוירוטרנסמיטר, נחקר מאוד ובחן באמצעות השימוש בתאי chromaffin יותרת הכליה 1,2. למעשה, רוב השחקנים המולקולריים שלתזמר את ההיווצרות, מיקוד, עגינה, ושילוב של גרגרי הפרשה זוהו בשל יישום של divטכניקות erse בתאי chromaffin 1. יתר על כן, על ידי מתן הזדמנות לאפשר לרזולוציה יחידה שלפוחית ​​של מכונות החלבון מעורבות בexocytosis, תא chromaffin נשאר מודל רב עוצמה כדי לענות על השאלות של שלפוחית ​​היתוך 3. מדידות קיבול מצורף תא נוצלו ראשונה בפתרון היתוך יחיד שלפוחית ​​במהלך exocytosis 3. Exocytosis של שלפוחית ​​קטנה כמו ~ 60 ננומטר בקוטר הוכח להיות מזוהה על ידי מדידות להתקבל קרום תא עם טכניקת מהדק תיקון בתצורת התא מצורף 4-7. אדמיטנס מוגדר כמדד של כמה בקלות מעגל או התקן יאפשר לזרם לזרום; זה הוא ההופכי של עכבה. לפיכך, מדידות להתקבל לספק הבנה של קיבול הקרום. המטרה זו מושגת על ידי השילוב של קרום לפוחי לתוך קרום הפלזמה; התאגדות זו חושפת שינויים במשטחאזור 8. כל שלפוחית ​​פיוזינג גורמת לעלייה הדרגתית ב9,10 קיבול קרום. בנוסף, מדידה להתקבל זה מספקת את מוליכות הממברנה ומוליכות נקבוביות ההיתוך במהלך אירוע exocytotic 3. כטכניקה זו סיפקה כלי ייחודי בזיהוי קינטיקה יחידה שלפוחית ​​במהלך exocytosis, המעבדה שלנו לאחרונה מיושמת תפיסה זו כדי לזהות אנדוציטוזה של שלפוחית ​​אחת 11,12. העניין הספציפי שלנו הוא אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME), שכבר נחשב כמרכיב ניהול משק בית בסיסי בתאים רבים 13 וכדרך הראשית לאנדוציטוזה שלפוחית ​​הסינפטית במסופים עצביים 14,15. CME ידוע להיות חשוב מבחינה ביולוגית, לעומת זאת, קינטיקה שלה תישאר לא מובנת היטב בשל מגבלות טכניות בניטור אירועי endocytic ייחודיים. בהתחשב בקווי הדמיון במנגנוני exocytic בין תאים ונוירונים 1 chromaffin, זה plausible שמנגנוני הביקוע בתאי chromaffin עשויים עשויים לחול על אנדוציטוזה שלפוחית ​​הסינפטית בתאי עצב. מדידות הקיבול מצורף התא כבר נוצלו כדי לעקוב אחר אירועי endocytic בודדים ולנתח את קינטיקה הביקוע, שרוב השיטות לא מצליחות לפתור. בהקלטות מצורפים התא שלנו, גל סינוס ב20 kHz משולב לתוך פוטנציאל ההחזקה, והתפוקה הנוכחית מופרד למוליכות קרום בקיבול ערוץ וקרום אחד בערוץ האחר משני שלבי נעילה ב מגבר 16- 18. מהשינויים במוליכות הממברנה וקיבול, ניתן לחשב את קינטיקה של הביקוע נקבובי, שסביר להניח מתאים לצוואר קרום הצינור שמחבר את שלפוחית ​​ההפנמה לקרום הפלזמה לפני שלפוחית ​​קמצוץ-off. באופן קולקטיבי, טכניקה זו נותנת לנו את ההזדמנות כדי לבחון את מנגנוני הוויסות של ביקוע שלפוחית ​​במהלך CME.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:88px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:88px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">P0899</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">DMEM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">15066024</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Keep out of UV</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:88px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:88px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:88px;">Carolina Biological</td>
			<td style="width:88px;">633029</td>
			<td style="width:88px;">12mm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="56" rowspan="2" style="height:57px;width:88px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">15140122</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">100mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:88px;">Insulin-Trans-Sel-X</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">51500056</td>
			<td style="width:88px;">Only thaw on ICE!</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Papain</td>
			<td style="width:88px;">Worthington</td>
			<td style="width:88px;">39S11614</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="56" rowspan="2" style="height:57px;width:88px;">EPC-7 plus patch amplifier</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">HEKA</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC-2090 data acquisition board</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">National Instruments</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:88px;">Igor data acquisition software</td>
			<td style="width:88px;">Wavemetrics</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:88px;">P-97 pipette puller</td>
			<td style="width:88px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:88px;">Microforge</td>
			<td style="width:88px;">Scientific Instruments</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="161" rowspan="3" style="height:161px;width:88px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td rowspan="3" style="width:88px;">Sutter Instruments</td>
			<td rowspan="3" style="width:88px;">B150-110-10</td>
			<td style="width:88px;">Outer diameter-1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:88px;">Inner diameter 1.10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:88px;">Length- 10 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for cell-attached capacitance measurements in mouse adrenal chromaffin cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

כדאיות התא והאיכות של חותם gigaohm הן קריטיות בקביעת האיכות של הקלטות קיבול מצורף תא. לכן, זה קריטי כדי להשיג תרבית תאים אפקטיבית ויעילה לפני קלטות אלקטרו, ותאי קיימא טיפוסיים באיור 1. העיסוק והזמן יהיה מועילים בהשגת חותם gigaohm עם איכות גבוהה. אם אחד יכול לראות בבי...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell at JoVE.com

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

methods-for-cell-attached-capacitance-measurements-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  University of Illinois at Chicago. After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Video: Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

אולטרסאונד מונחה Microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

שיטות לניהול עצמי תוך ורידים במודל של עכברים

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

שיטות לאפנון וניתוח של Neurogenesis מבוגרים NF-κB תלוי

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

במדידות Vivo אלקטרו על עצבים העכבר השת

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

A Behavioral Screen for Heat-Induced Seizures in Mouse Models of Epilepsy

Transgenic mouse models have proved to be powerful tools in studying various aspects of human neurological disorders, including epilepsy. The SCN1A-associated genetic epilepsies comprise a wide spectrum of seizure disorders with incomplete penetrance and clinical variability. SCN1A mutations can result in a large variety of seizure phenotype ranging from simple, self-limited fever-associated febrile seizures (FS), moderate-level genetic epilepsy with febrile seizures plus (GEFS+) to more severe Dravet Syndrome (DS). Although FS are commonly seen in children below 6-7 years of age who do not have genetic epilepsy, FS in GEFS+ patients continue to occur into adulthood. Traditionally, experimental FS have been induced in mice by exposing the animal to a stream of dry air or heating lamps, and the rate of change in body temperature is often not well controlled. Here, we describe a custom-built heating chamber, with a plexiglass front, that is fitted with a digital temperature controller and a heater-equipped electric fan, which can send heated forced air into the test arena in a temperature-controlled manner. The body temperature of a mouse placed in the chamber, monitored through a rectal probe, can be increased to 40-42 &#176;C in a reproducible manner by increasing the temperature inside the chamber. Continual visual monitoring of the animals during the heating period demonstrates induction of heat-induced seizures in mice carrying an FS mutation at a body temperature that does not elicit behavioral seizures in wild-type litter mates. Animals can be easily removed from the chamber and placed on a cooling pad to rapidly return body temperature to normal. This method provides for a simple, rapid, and reproducible screening protocol for the occurrence of heat-induced seizures in epilepsy mouse models.

The goal of the method is to screen for hyperthermia or heat-induced seizures in mouse models. The protocol describes the use of a custom-built chamber with continuous monitoring of the body temperature to determine whether elevated body temperature leads to seizures.

מסך התנהגותי להתקפים הנגרמים על ידי חום במודלים של עכבר של אפילפסיה

Transgenic mouse models have proved to be powerful tools in studying various aspects of human neurological disorders, including epilepsy. The ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are laterally packed in the outermost layer of the retina, the photoreceptor layer, resulting in alignment of analogous subcellular compartments. Traditionally, tangential sectioning of the frozen flat-mounted retina has been used to study the movement and localization of proteins within different rod compartments. However, the high curvature of the rod-dominant mouse retina makes tangential sectioning challenging. Motivated by the study of protein transport between compartments, we developed two peeling methods that reliably isolate the rod outer segment (ROS) and other subcellular compartments for western blots. Our relatively quick and simple techniques deliver enriched and subcellular-specific fractions to quantitatively measure the distribution and redistribution of important photoreceptor proteins in normal rods. Moreover, these isolation techniques can also be easily adapted to isolate and quantitatively investigate the protein composition of other cellular layers within both healthy and degenerating retinae.

This protocol presents two techniques to isolate the subcellular compartments of murine rod photoreceptors for protein analysis. The first method utilizes live retinae and cellulose filter paper to separate rod outer segments, while the second employs lyophilized retinae and adhesive tape to peel away rod inner and outer segment layers.

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...