שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח המעית ופיזיולוגיה של מערכת העיכול, כגון, מהם המנגנונים של עצבנות התא enterochromaffin ותגובה לגירויים זוהרים, ומה הם המנגנונים של שחרור הורמון העיכול? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו ללמוד בפירוט תאים enterochromaffin באמצעות טכניקות תא יחיד, כמו אלקטרופיזיולוגיה. הדגמת ההליך תהיה המחברים הראשונים קייטלין קנוטסון ופיטר סטרג ', טכנולוגים מצטיינים שפיתחו טכניקות אלה.
כדי להתחיל בהליך זה, מניחים מחט מזרק שישה מיליליטר מלא PBS קר כקרח לתוך הלומן של קטע המעי שחולץ. השתמש מלקחיים microdissection, מהדק ולאטום את המעיים סביב מחט המזרק, בעדינות לשטוף שישה מיליליטר של PBS דרך לומן לשטוף כל חומר צואה. לאחר מכן, להפוך את רקמת המעי על ידי אריגה עדין של מלקחיים microdissection דרך לומן, צביטת דופן המעי, וחזרה על הרקמה קרוב לקצה המלקחיים.
חזור על תהליך זה עד שהמקטע יהיה מבפנים החוצה כאשר הלומן פונה כלפי חוץ. באמצעות מספריים microdissection, לחתוך את מקטעי הרקמה לחתיכות של סנטימטר אחד. ואז להעביר את מקטעי הרקמה לתוך מקור 50 מיליליטר מלא חמישה מיליליטר של PBS סטרילי.
לאחר מכן, טחון את חתיכות הרקמה לעקביות נזילות. מעבירים את הרקמה הטחון ו-15 מיליליטר של PBS קר כקרח לצינור נקי של 50 מיליליטר. טריורט פעמיים עם פיפטה ההעברה.
חכה לרקמה להתיישב. לאחר מכן, להסיר 15 מיליליטר של על טבעי PBS ולהחליף עם PBS טרי. חזור על תהליך זה שלוש פעמים, עד שה- PBS יתפנה.
לעיכול הראשון, מאמבט המים, יש לאחזר את אחד מצינורות ה-50 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר של אמצעי עיכול מחוממים מראש. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של פתרון קולגנס PBS בצינור עם חתיכות מעיים טחונים. לבסוף, חתיכות רקמת מעיים טחונות נוספו לתקשורת העיכול ותופס קולגן PBS.
לאחר מכן, מניחים את הדגימה באמבט מים במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאט titrate את הרקמה פעם אחת עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר בקצרה לתת חתיכות הרקמה להתיישב. השתמש פיפטה העברה כדי להסיר 10 מיליליטר של supernatant.
לעיכול השני, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של פתרון הקולגנס PBS לרקמה ומ מניחים אותו באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאט לאט titrate הפתרון פעם אחת עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר. ואז להסיר 10 מיליליטר של העל-טבעי.
לעיכול השלישי, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של תוסף הקולגנס PBS בצינור. מניחים אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ואז לנער את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים בדקה בעוצמה גבוהה יותר מאשר עיכול אחד ושתיים.
לאחר מכן, לאט pipette את הרקמה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר ולאפשר חתיכות הרקמה להתיישב לזמן קצר. העבר 10 מיליליטר של העל-טבעי לצינור חדש של 15 מיליליטר. הוסף שני מיליליטר של מדיה תרבותית מלאה של תאי EC מחוממים והתהפך פעם אחת כדי לערבב.
לאחר מכן, לסובב את המדגם ב 100 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה הנותרים ב 2.5 מיליליטר של תקשורת תרבות מלאה תא EC מחומם. עבור העיכול הרביעי, לחזור על הליכי העיכול, אבל להגדיל את זמן הדגירה על ידי 15 דקות עבור המעי הגס, ולהישאר ב 10 דקות עבור jejunum.
כדי לתרבת את התאים, השתמש פיפטה העברה לשלב את מתלי התא שנאספו מעיכול שלוש וארבע לתוך צינור חדש 15 מיליליטר. הסר aliquot 10 מיקרוליטר של תאים לספור עם המוציטמטר. ואז לסובב את המתלה התא הנותר ב 100 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר חמש דקות, להסיר את supernatant ולהוסיף תא EC להשלים מדיה תרבות באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מיליליטר בצפיפות של מיליון תאים למיליליטר. להשעות מחדש את הרקמה באמצעות פיפטה העברה. לאחר מכן, הסירו את מנות התרבות מצופות הזכוכית מהה חממה.
באמצעות פיפטה P1000, החלף את המטריצה התאית הנוספת מכל צלחת תרבות ב-250 מיקרוליטרים של ההשעיה הסופית של התא. כדי להשיג ג'יגה-זל של תא שלם, הורידו את האלקטרודה לתסרון האמבטיה. עם המיקרומניפולטור, תמרן את קצה האלקטרודה במישור עם ואופקי ישירות מהתא.
ואז לגרש 0.2 מיליליטר של אוויר מהמזרק. הזז בעדינות את האלקטרודה אופקית לאורך ציר ה- X כדי לגעת בתא. צפה גומה להופיע על התא EC, עלייה בהתנגדות קרום על בדיקות החותם.
החל 0.1 כדי 0.2 מיליליטר של יניקה על המזרק ולהחזיק את הבוכנה יציבה עד 100 מגה אוהם מושגת. ואז לשחרר את האחיזה מה הבוכנה. המתן עד שהתא יצחקק.
ואז בעדינות לנתק את המזרק. כדי להקליט זרם נתרן מגודר במתח שלם, יש למרוח ברז מהיר של יניקה על מזרק. חזור על הפעולה עד שהגישה לתא כולו תושג לפני ניתוק עדין של המזרק.
לאחר מכן, הפעל את פיצוי קיבולות התא כולו ולהתאים את קיבולות והתנגדות הסדרה. הפעל את פיצוי ההתנגדות לסדרה. עם השהיה מוגדרת ב 60 מיקרו שניות, להתאים את פיצוי ההתנגדות הסדרה ולסגור את מבחן החותם.
רשום בממוצע חמש ריצות של זרם נתרן שלם של שער מתח תאים. שימו לב במהירות לשני פרמטרים של זרם הנתרן המגודר במתח:המתח בזרם החלון, וצפיפות זרם הנתרן הגבוהה ביותר. כדי לתעד את פוטנציאל הפעולה הממושך, העבר את המצב ממהדק מתח למהדק זרם.
טען את פרוטוקול המהדק הנוכחי האפיזודי. התאם את זרם ההחזקה לאפס פיקואמפ כאן והפעיל את הפקודה החיצונית. רשום את פוטנציאל הפעולה הממושך.
שים לב לכמות הפחותה ביותר של זרם מוזרק כדי לירות את פוטנציאל פעולה. כדי לתעד פוטנציאל פעולה ספונטני, בטל את הפקודה החיצונית. טען פרוטוקול מהדק זרם ללא פערים.
שנה את זרם האחזקה לכמות הזרם שהוזרקה בסריקה האחרונה בפרוטוקול הממושך שלא תצית פוטנציאל פעולה. לאחר מכן, הפעל את הפקודה החיצונית. בדוק שוב כי זרם החזקה חזוי מביא את פוטנציאל הממברנה מתחת לסף לירות פוטנציאל פעולה.
התאם את זרם החזקה במידת הצורך והתרשם מהפעילות הספונטנית. תרבויות שמוטבו לאלקטרופיזיולוגיה כללו תאים בודדים וגושים קטנים עם אות CFP בהיר. כאשר תנאי התרבות לא היו אופטימיזציה, תרבות התא האפיתל כללה גושים גדולים, פסולת תאית צפה, ממברנות פגומות, אות CFP חלש בתאי EC.
תאים שלמים של EC הושגו ב 30 פלוס או מינוס 7% של ניסיונות מתרבות המעי הגס, ו 41 פלוס או מינוס 3% של ניסיונות מתרבות jejunum. על ידי אלקטרופיזיולוגיה של תא שלם, זרמי נתרן נרשמו מ 81.3 פלוס או מינוס 4.0% של TPH-1 CPF תאים חיוביים מ jejunum ו 64.1 פלוס או מינוס 9.2% מהם מן המעי הגס. מתוך 59 תאים EC מתרבות jejunum, 19 תאים EC במצב מהדק הנוכחי ירה AP ספונטני, 29 תאים EC ירה AP רק כאשר עורר על ידי פרוטוקול צעד במצב מהדק הנוכחי, ו 11 תאים EC לא ירה AP באופן ספונטני או על ידי פרוטוקול צעד.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי פרוטוקול העיכול האופטימלי עבור תרבויות אפיתל ראשוני עשוי להיות משתנה בין שימושים, ולכן חשוב לקבוע את הכמות האופטימלית של תסיסה כדי להשיג תאים בודדים. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו PCR תא יחיד פלואורסצנטי, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות, כמו מה enterochromaffin תאים להביע וכיצד גירויים מרוכבים איתות בין תאי. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך למחקרים בפיזיולוגיה של מערכת העיכול כדי לחקור כיצד פועלים תאי enterochromaffin וכיצד הם מווסתים את תנועתיות מערכת העיכול ואת הפרשת בעכברים.
