שיטה זו היא כלי רב ערך בתחום הביולוגיה התאית להערכת רמות ROS הסלולר בתאים ראשוניים חיים מעובדים במבחנה כמו organoids באמצעות בדיקה פלואורוגנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי ROS ניתן לדמיין באופן איכותי באורגנוידים מעיים שלמים על ידי מיקרוסקופיה וניתוח כמותי בתאים מנותקים על ידי cytometry זרימה באמצעות לוחות 96-well. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים organoid אחרים וחיישנים פלואורסצנטיים חלופיים עשויים לשמש לניתוח מסלולים תאיים שונים.
לפני החלת פרוטוקול זה בפעם הראשונה, הנסיין צריך להכיר את תרבות האורגנויד ואת passaging. למרות הפרוטוקול שלנו מותאם היטב גישות הקרנה, למתחילים צריך להתחיל עם כמה דוגמאות. מי שתדגים את ההליך תהיה סופי דולארוי, מהנדסת מהמעבדה.
לאחר הקרבת עכבר Lgr5-GFP בן 8 עד 10 שבועות, לאסוף חמישה עד שמונה סנטימטרים של אזור jejunum המקיף בין התריסריון לאיליאום, ולהניח אותו DPBS קר בתוספת אנטיביוטיקה על קרח. לאחר מכן, לנקות את התוכן במעיים על ידי שטיפה עם חמישה עד 10 מיליליטר של DPBS קר המכיל אנטיביוטיקה. לאחר מכן באמצעות מספריים קצה כדור, לפתוח את המעי קו אורך, באמצעות מלקחיים, להעביר את הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה DPBS קר עם אנטיביוטיקה.
לנער את הרקמה בתוך הצלחת כדי לשטוף אותו. לאחר מכן, לתפוס את המעי על ידי שאיפה באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק ולהעביר אותו לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 10 מיליליטר קר 10 מילימולר EDTA. הפוך את הצינור שלוש פעמים ודגר אותו על קרח במשך 10 דקות.
לאחר הדגירה, להעביר את הרקמה בצינור המכיל 10 מיליליטרים של DPBS ומערבולת במשך שתי דקות. מיד להוסיף 10 microliters של השבר בצלחת פטרי ולהשתמש מיקרוסקופ כדי להעריך את איכות השבר. לאחר שתי העברות ב- DPBS המכילות צינורות עם מערבולת של שתי דקות בין כל העברה, לדגור על המעי ב- EDTA על קרח במשך חמש דקות כפי שהוכח בעבר.
לאחר שלוש העברות רצופות בצינורות המכילים DPBS עם מערבולת של שלוש דקות בין כל העברה, לשלב את השברים הטובים ביותר לתוך צינור 50 מיליליטר על ידי היפוך הצינורות שנבחרו שלוש פעמים סינון דרך מסננת תא 70 מיקרון. ואז לסובב את הקריפטות, להשליך את supernatant ולשבש את הכדור באופן מכני לפני הוספת חמישה מיליליטרים של DMEM F12 קר. ספרו את מספר הקריפטות הקיימות ב-10 מיקרוליטרים באופן ידני מתחת למיקרוסקופ.
לאחר הספירה, לסובב את הקריפטות שוב ולהסיר בזהירות את supernatant. לאחר מכן באופן מכני לשבש את הכדור ולהוסיף תרבות צמיחה מדיום לצינור כדי לקבל ריכוז של 90 קריפטות לכל microliter. לאחר מכן, להוסיף שני כרכים של מטריצת ממברנת מרתף לא מדוללת או BMM כדי לקבל ריכוז סופי של 30 קריפטות לכל מיקרוליטר ובזהירות pipette המתלה למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לתערובת.
לניתוח ציטומטריית זרימה, צלחת 10 מיקרוליטרים של קריפטות BMM לערבב ככיפה במרכז כל באר של צלחת 96-well תחתית 96-well מחומם מראש. ולהדמיה, להפקיד 10 מיקרוליטרים של התערובת כשכבה דקה בתא מיקרו-מפולת שמונה בארות שחומם מראש. לאחר מתן אפשרות ל- BMM להתמצק בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, מניחים את הצלחות באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.
לאחר 15 דקות, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה לתוך כל באר, מקפידים לא לנתק את ה- BMM, ומניחים את הצלחת באינקובטור. כדי לדמיין עקה חמצונית על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי n-אצטילציסטאין בבארות המתאימות של microslide שמונה בארות תא היטב מצופה organoids. לאחר דגירה של שעה, מוסיפים מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי טרט-בוטיל הידרופרוקסיד בבארות המתאימות ודגורים במשך 30 דקות נוספות.
לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של דילול 1.25 מילימולרי של הבדיקה פלואורוגנית לכל באר, ואחריו מיקרוליטר אחד של 1.25 מיליגרם לפתרון Hoechst מיליליטר. לאחר דגירה נוספת של 30 דקות, הסר את המדיום מבלי להפריע ל- BMM והוסף בעדינות 250 מיקרוליטרים של DMEM חם ללא אדום פנול. דמיינו את האורגנוידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בתא תרמי ובאספקת גז המזהה את הגשוש הפלואורוגני.
באמצעות הפקד החיובי, הגדר את עוצמת הלייזר ואת חשיפת הזמן עבור אות ROS, ובדוק כי אות זה נמוך יותר בפקד השלילי. לאחר מכן, באמצעות עין, לסנן את השקופית כדי לזהות את organoids מבטא GFP ולהתאים את עוצמת הלייזר. הגדר z-stack של 25 מיקרומטר והגדר עמדות כדי לקבל תמונה תפורה של האורגנויד כולו כדי לקבל קטע של organoids מראה שכבה אחת של תאים.
הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון מניית n-אצטילציסטאין בבארות הבקרה השליליות של הצלחת התחתונה העגולה בת 96 הבאר המכילה את האורגנוידים. לאחר דגירה של שעה, מוסיפים תמיסת מלאי מיקרו-בוטיל הידרופרוקסיד אחת בבארות המתאימות ודגורים במשך 30 דקות. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, להסיר את המדיום מבלי להפריע BMM המצורף ולהעביר אותו לצלחת תחתונה עגולה אחרת 96 היטב.
שמור את הצלחת הזאת בצד. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטרים של טריפסין ושימוש פיפטה רב ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להרוס את BMM. לאחר דגירה קצרה של חמש דקות, נתק את האורגנוידים על ידי צנרת למעלה ולמטה בפעם השנייה.
לסובב את הצלחת ולהשליך את supernatant על ידי היפוך הצלחת. הוסף את המדיום שנאסף בעבר בצלחת אחרת של 96 בארות בחזרה לבארות המתאימות והחזר את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של הגשוש הפלואורוגני ודגרים במשך 30 דקות.
לאחר מכן לסובב את הצלחת שוב ולהחזיר את התאים עם 250 מיקרוליטרים של פתרון DAPI. העבר את הדגימות בצינורות ציטומטריה זורמים ולשמור את הצינורות על קרח. מטב את הגדרות מתח הפיזור קדימה וצד על שליטה בלתי מוכתמת ומתחי לייזר עבור כל פלואורופור באמצעות דגימות חד-מוכתמות.
לאחר מכן באמצעות אסטרטגיית gating מתאימה, לאסוף מינימום של 20,000 אירועים. תמונות קונפוקליות מייצגות של כתמי ROS ואורגנוידים הראו כי בנוכחות מעכב NAC, רק האות מהתאים המתים הכלולים בלומן של האורגנויד נראה לעין. באורגנויד שאינו מטופל, ניתן לראות את רמות ה- ROS הבסיסיות, במיוחד בתאים חיוביים GFP, המוכיחים כי תאי גזע מייצרים ROS גבוה יותר מאשר תאים מובחנים.
תאים חיוביים GFP מציגים אות ציטופלסמי משמעותי יותר עם התמריץ בנוכחות הבדיקה הפלואורוגנית, המוכיח כי רמות ROS להגדיל במיוחד בתאי גזע לאחר הטיפול. ניתוח ציטומטריה זרימה של ייצור ROS באורגנוידים במעיים מראה כי רמות ROS הבסיסי להקטין לאחר גירוי עם מעכב ולהגדיל לאחר אתגר עם תמריץ. תאים מטופלים מראש עם מעכב ולאחר מכן מגורה עם ממריץ להציג רמות נמוכות יותר מאשר אלה מגורה עם ממריץ בלבד.
ניתוח דומה על תאי גזע מגודרים כמו GFP חיובי מראה ירידה של פי 3.5 ברמת ROS על טיפול מעכב ועלייה פי ארבעה על טיפול ממריץ על תאים שאינם מגורה. בעת ניסיון הליך זה, משתמשים צריכים לזכור להגביל את הלחץ התא במהלך מניפולציה אורגנויד ודיסוציאציה. בנוסף, תמיד יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים בעת ניתוח ROS.
בעקבות הליך זה, ניתן להשלים את הניתוח על ידי כתמים immunofluorescence על אורגנוידים שלמים קבועים, מיון תאים, וניתוח ביטוי גנים כדי לקבל תובנות נוספות על ויסות ROS. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך לדעת איך לגדל אורגנוידים מעיים מורין, לבצע ניתוח הדמיה חיה של organoids שלם, ולעבד איברי מעיים לניתוח ציטומטריה זרימה.
