This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+after+trauma:+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury.">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li><li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods:+the+optical+disector+and+fractionator.">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li><li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans.">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke;+a.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li><li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain.">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li><li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells.">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).</li><li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke.">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li><li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways.">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li><li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung:+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area.">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li><li>Hern&#225;ndez-Jim&#233;nez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage.">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li><li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis.">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Y&#233;benes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+overload,+measured+as+serum+ferritin,+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion.">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li><li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent,+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke.">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPAR&#947;+Agonist+Rosiglitazone.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPAR&#947; Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression.">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מודל איסכמיה המוחי הציג כאן נותן כרכי אוטם מאוד לשחזור נקבעו 24-48 שעות ו -7 ימים לאחר MCA קשירה ידי גישות שונות 8,15,17. יש מודל MCAO זה שיעור נמוך תמותה (פחות מ -1%) בהשוואה לאחרים, צמצום מספר בעלי החיים המשמשים במחקרים. שלב קריטי כדי להשיג את השיעור הנמוך הזה של תמותה הוא לשמור על תנאים אספטיים נאותים כדי למנוע זיהומים שעלולים לפגוע בהישרדות לאחר אינדוקציה שבץ. מודל MCAO זה יכול לא רק לשמש כמודל MCAO קבע, שנחשב למודל רלוונטי קליני למחקר translational 18, אלא גם כמודל חולף ידי קשירה זמנית של המרכז לאמנות העכשווית וMCA עם Slipknot וreperfusion האחורי בזמן הרצוי 19. שיטה זו שמשה בהצלחה בעכברים וחולדות 17,20. כל ראיות מצביעות על כך שזה MCAO על ידי קשירה הוא מודל רב-תכליתי גבוה של איסכמיה המוחית עם יישומים מרובים. Critiצעד cal של טכניקה זו הוא שהיא דורשת ניתוח פולשני תחת סטראו; craniotomy צריכה להתבצע בזהירות רבה כדי לא לפגוע בעצם הלחי, כמו גם את MCA. עם זאת, השימוש בבעלי חי דמה (אשר נתון להליך כירורגי אבל קשירת CCA וMCA לא מתבצע) מספק כלי שימושי להפלות השפעות הליך תלוי כירורגית. הבאות בטכניקה זו המידה של פגיעה מוחית ניתן לכמת על ידי מספר שיטות. הפרוטוקול של חתך מוח, מכתים Nissl וההערכה הבאה של אמצעי האחסון על ידי Cavalieri שלנו מאפשר לכימות מדויק של האזור הפגוע וממזער את מספר העכברים המשמשים בסוג זה של מחקרים מאז חלקים במוח הסידורי יכולים לשמש גם לניתוח immunohistochemical שונה. לביצועים טובים יותר של מתודולוגיה זו, זה קריטי לבחור את הפרמטרים המתאימים בשימוש בתוכנת stereology (טבלה 1) שיהיה צורך להערכת הדואר נפח של האזורים השונים על ידי הנוסחא: V = 1 / SSF * * f * t ΣP i (SSF הוא שבר דגימת פרוסה, t הוא העובי הממוצע של הסעיפים, f היא האזור של ריווח הרשת ו ΣP את מספר הנקודות שפגע במבנה). MCAO דיסטלי על ידי קשירה יכול להיות שימושי כדי לאפיין את ויקוציטים הסתננו ותת-אוכלוסיות של תאים חיסוניים 8,13 המשתתפים בתהליך הדלקתי בעקבות פציעת מוח 1-4. כאן, אנו מציעים שתי שיטות שונות לאפיון תאים חיסוניים במוח, גישת stereological מדויקת וניתוח הזרימה cytometric לטוב האפיון תת-אוכלוסיות leukocytes מרובה. מנצלת את חתך מוח סדרתי, כימות של המספר הכולל של נויטרופילים יכולה להיות מושגת על ידי השיטה האופטית fractionator 16, האומדת את המספר הכולל של תאים ממספר התאים שנדגמו שנינותחה סט שיטתי נדגמים מקריים (SRS) של חללים משוחדות וירטואליים ספירה מכסים את האזור כולו של עניין, במקרה שלנו באזור האוטם, עם מרחק אחיד בין חללי ספירה וירטואליים משוחדות בX כיוונים, Y ו- Z. שיטה זו מספק כלי מדויק ל להעריך מספרי נויטרופילים הכולל במוח איסכמי בזמנים שונים לאחר קשירה. למרות שזה לא הוכח במחקר זה, פרוטוקול זה יכול לשמש גם להערכה של תת-האוכלוסיות השונות נויטרופילים לאחר איסכמיה 21 ולכימות מדויק של כל אוכלוסיית תאים אחרת הנמצאת במוח איסכמי כמו כדוריות דם לבנות הסתננו אחרים (מונוציטים / מקרופאגים) וגם להערכת הנוירונים ששרדו או אפילו לכימות neurogenesis לאחר שבץ. הצעד החשוב ביותר להערכה מדויקת באזור הרצוי הוא הבחירה של הפרמטרים המתאימים, כמו אלה שמוצגים בטבלה 3 לכימות נויטרופילים באזור איסכמי.פרמטרים אלה ישמשו לתוכנת stereology כדי לחשב את מספר התאים החיוביים הכולל (N) על ידי שימוש במשוואה N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- הוא המספר הכולל של תאים נספרו ב fractionator, SSF הוא שבר דגימת הסעיף, ASF הוא אזור שבר הדגימה, וTSF הוא עובי בר דגימה) 5. למרות שמתודולוגיה זו היא איטית יותר מאשר טכניקות כימות אחרות (לדוגמא, ניתוח של סמני נויטרופילים ידי מ&quot;ג של רקמה, צפיפות של תמונות או מספר הנויטרופילים לכל שדה נציג), יש לו את היתרון להיות משוחד וטכניקה מוצקה המספקת מדויק כימות של מספרים סלולריים. גישת בידוד ויקוציטים המוח מאפשרת זיהוי בו זמני וכימות של כמה תת תא חיסון ללא הצורך בהטית המערכת על ידי צביעת in vivo או מניפולציות גנטיות. תא לאחר מיון מp מיאלואידית המאופייןopulations או הפרדת immunomagnetic יכול לשמש ליישומים במורד הזרם מרובים, כגון מחקרים נוספים על גן או ביטוי חלבון. האפיון מדויק של נויטרופילים, מונוציטים ומיקרוגליה מתקבלים בשיטה זו מספק סגוליות גבוהה ביחס לשיטות קיימות, כגון מחקרי immunohistochemical, יתרון המאפשר הקצאת פונקציות ספציפיות לתאי מיאלואידית השונים אשר מתווכים תגובה חיסונית מולדת במוח. בנוסף, ניתן להאריך עוד יותר לאפיין אוכלוסיות אחרות במוח עם התווית המתאימה, כמו מקרופאגים דם נולד (CD11b + היי CD45 CD68 +), וזה יכול להיות מיושם לחקר פתולוגיות אחרות במערכת העצבים המרכזית או פציעות. לכן טכניקה זו מספקת כלי חיוני כדי לחקור את ההטרוגניות של התגובה הדלקתית במוח. מגבלה העיקרית של טכניקה זו מתגוררת בהכנת השעיות ויקוציטים מרקמת המוח טרי, אשר יכולה לשנות אתמצב הפעלה של התאים או שינוי אנטיגן. למרות שטכניקה זו מאפשרת אפיון איכותי יותר מפורט בהשוואה למחקרי immunohistochemical, היא מספקת כימות פחות מדויק המבוסס על בידוד תא. למרות זאת, את היעילות של פרוטוקול בידוד תא שלנו היא דומה לשיטות אחרות שפורסמו 9 וניתן להשתמש בו ביעילות כדי לזהות הבדלים במספר התאים חיסוניים במוח בין שליטה וקבוצות MCAO או אפילו בין קבוצות MCAO נתון לטיפולים שונים 8. שלבים קריטיים של פרוטוקול זה הם לנתיחה הרקמה, הליך שיבוש רקמות, והסרת המיאלין. בנוגע לאיסוף הרקמות, ניתן לכלול צעד נורמליזציה (בהתחשב ברקמה שנאספו), כדי למנוע השתנות בשל הופעות נתיחה שונות. בנוסף, נורמליזציה בין קבוצות MCAO השונות יכולה להתרחש גם דרך נפח אוטם (שנקבע בעבר על ידי R המגנטיesonance). דרך נוספת לפתור את הבעיה הזו היא להשתמש בכל חצי הכדור ipsilateral של שני קבוצות איסכמי ושליטה, או אפילו להשתמש באונה הנגדית של עכבר איסכמי כביקורת כדי למזער את מספר בעלי החיים המשמשים. בעוד גישה זו נמנעת הבדלים בין כל נתיחה, יש לו חסרון עיקרי; גורם לדילול נוסף על ידי הגדלת המספר הכולל של תאים אך לא את מספר תאי מיאלואידית אשר ממוקמים באופן בלעדי בתחומי הליבה ופרי אוטם של קליפת המוח ipsilateral. לגבי שיבוש רקמות, פרוטוקול זה מדגים את השלבים להפרעה המכנית של תאי מוח, הימנעות טיפולים האנזימטית ומניעת שינוי פני השטח אנטיגן 9,22, נושא חיוני לניתוח איכותי וכמותית נוסף של תת-האוכלוסיות של תאים דלקתיים. בנוסף להכנת ההשעיה התא של עניין, הסרת המיאלין מדגימות המוח הוא צעד מומלץ מאוד להימנע מהפרעה לdownstיישומים לקדד, כגון הפרדת תאי immunomagnetic או cytometry זרימת 23,24. זה יכול להיות מושלם תוך שימוש בשיטות שונות, כגון סוכרוז או הדרגתיים Percoll, או חרוזים נגד המיאלין. כאן, ועל סמך מחקרים קודמים שהשוו שיטות שונות לבידוד השעיה תא המוח, הפרעה מכאנית בשילוב עם שימוש Percoll להסיר המיאלין משמש לשיפור תשואות תא ואת כדאיות 25.

שינויים מורפולוגיים, פנוטיפי וביטוי גנים של מיקרוגליה, כמו גם extravasation והפעלה של מקרופאגים ונויטרופילים haematogenous הם האמינו לשחק תפקיד מרכזי במפל pathophysiological בעקבות פציעת מוח 1-4. פרוטוקול זה מספק שתי גישות כדי להעריך את המספר של תת תא מיאלואידית שונה של מוח איסכמי ולבצע אפיון phenotypical. בנוסף, הוא גם מספק תיאור של מודל ניסיוני של איסכמיה המוחית בעכברים, אשר מורכב של קשירה החולפת או קבועה של שני עורק המוח התיכון דיסטלי (MCA) ועורק התרדמה המשותפת (CCA), כולל כיצד להעריך את האוטם בשיטה מדויקת Cavalieri באמצעות תוכנת stereological. הגישה הראשונה לאפיין תת תא מיאלואידית של מוח איסכמי היא שיטה stereological מבוססת על גישת fractionator האופטית 5. זהו ביותרנפוץ בדיקה stereological בתחום מדעי חיים ומספק רמה גבוהה של דיוק עם מקדמים נמוכים של שגיאת 5-7. זה הוא הבחירה הטובה ביותר לכימות תא כאשר הרקמה היא לחתוך למקטעים, כפי שהוא ימנע את ההטיה בהערכת תא בגלל הפיצול של הרקמה למקטעים. שיטה זו היא דרך חזקה מאוד לאפיין מספרים, דינמיקה ושינויים פנוטיפי של תת-אוכלוסיות נויטרופילים הסתננו של הרקמה איסכמית 8. גישת האפיון השנייה מבוססת על פרוטוקול שונה מקמפנלה ומשתפי פעולה 9 שמספק דרך פשוטה לבודד השעיות ויקוציטים מוח ולאפיין אותם על ידי cytometry זרימה. בניגוד לשיטות immunohistochemical קונבנציונליים, cytometry זרימת אפיון מאפשר הבחנה בין microglia (CD45 lo CD11b +) והסתננתי תאי מיאלואידית (CD45 היי CD11b +) המבוסס על ההבדל שלהםרמות ביטוי erent של CD45 9-13. בנוסף, מונוציטים פרו-דלקתיים (היי CD11b + Ly-6G CD45 - היי Ly-6C), נויטרופילים (היי CD11b + Ly-6G + CD45) ניתן להבחין ותת leukocytes אחרות של הרקמה איסכמית. גישה זו מספקת assay אמין והמהיר כדי להעריך neuroinflammation במודלים ניסיוניים של איסכמיה. עם זאת, עיבוד רקמות יכול להשפיע על מצב ההפעלה ומספרים של אוכלוסיות תאים השונות הנמצאות ברקמה איסכמית מתן אפיון חצי כמותית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

הפעלת מיקרוגליה, כמו גם extravasation של מקרופאגים ונויטרופילים haematogenous, הוא האמין לשחק תפקיד מרכזי בפגיעה מוחית לאחר שבץ. תת-אוכלוסיות תא מיאלואידית אלה יכולים להציג פנוטיפים ופונקציות שונים וצריכים להיות מכובד ומאופיינות ללמוד תקנתם ותרומתם לנזק לרקמות. פרוטוקול זה מספק שתי שיטות שונות לאפיון תאים חיסוני במוח: גישת stereological מדויקת וניתוח התזרים cytometric. גישת stereological מבוססת על השיטה האופטית fractionator, המחשבת את המספר הכולל של תאים באזור של עניין (מוח infarcted) מוערכת על ידי דגימה מקרית שיטתית. גישת האפיון השנייה מספקת דרך פשוטה לבודד השעיות ויקוציטים המוח ולאפיין אותם על ידי cytometry זרימה, המאפשר לאפיון של מיקרוגליה, הסתנן מונוציטים ונויטרופילים של הרקמה איסכמית. בנוסף, הוא גם דetails מודל איסכמיה מוחית בעכברים שבאופן בלעדי משפיע קליפת מוח, יצירת אוטמי שחזור מאוד עם שיעור נמוך של תמותה, ואת ההליך לעיבוד היסטולוגית המוח לאפיין נפח אוטם בשיטת Cavalieri.

מודל איסכמיה המוחי המוצג כאן מייצר אוטמים ראו אך ורק בקליפה מבלי להשפיע על רקמת striatal מאז סניפי lenticulostriatal של MCA שלהשקות סטריאטום לא יחסמו (איור 1). על ידי צביעת Nissl, האזור הפגוע יכול להיות מזוהה כאזור hypochromic קליפת המוח (איור 2). מודל זה מאופיין במחזורי אוטם לשחזור מאוד ב 24 שעות לאחר MCAO (IH% 15.89 ± 0.28) מוערך על ידי שיטת Cavalieri בסעיפים מוכתמים-Nissl (איור 2). הערכה של נפח infarcted בשיטת Cavalieri היא גישה מדויקת עם שגיאה נמוכה שבאה לידי ביטוי במקדם של השגיאה (CE) של Gundersen בההמיספרות contralesional וipsilesional כמו גם באזור infarcted (הטבלה 2). נפגע נפח רקמה יכול לבוא לידי ביטוי במ&quot;מ 3, אלא גם כIH% באמצעות הנוסחא בסעיף 3.2.13. בנוסף, להערכתמהנפח הכולל של אזורי ipsilesional וcontralesional מאפשר לחישוב מדד בצקת לתקן את נפח infarcted ולהימנע מהערכת יתר של הרקמות הפגועות (טבלה 2). בהתחשב בעיבוד חתך הסידורי של רקמת המוח, זה יכול להיות מנוצל כדי לבצע הערכה מדויקת של המספר הכולל של תת-אוכלוסיות של תאים, כמו נויטרופילים הסתננו, באזור איסכמי, באמצעות גישת Fractionator האופטי (איור 3 ולוח 4) עם פרמטרים שמוצגים בטבלה 3. פרוטוקול זה אומד מספר כולל של נויטרופילים (תאי Ly6G-חיוביים) באזור infarcted של 23328 ± 3,623 ב 24 שעות ו± 82856 8143 בשעה 48 בעכברים לאחר pMCAO (איור 3D). בהסכם עם מחקרים קודמים, חדירת נויטרופילים מתואמת ישירות עם גודל האוטם (איור 3E). הערכה של tהוא מספר הנויטרופילים בשיטת Fractionator האופטי הוא גישה מדויקת עם שגיאה נמוכה שבאו לידי ביטוי בספירה של Gundersen (לוח 4). הבידוד לויקוציטים וזרימת cytometry פרוטוקול אפיון מאפשר בידוד של 47922 ± 23174 תאי מיאלואידית מהקליפה של חצי הכדור ipsilesional של עכברי איסכמי. זה כולל 10-30% מהאירועים הכולל שנמצאו בהשעית התא. רובם המכריע של אירועים שנתפסו באמצעות פרוטוקול זה הווה פרמטר FSC נמוך, הקשורים לפסולת תאית (איור 4). הכתמת CD11b מראה כי התאים CD11b + ערך FSC גבוה יותר (איור 4), המצביעים על כך פסולת תא אינה מסומנת בסמן זה, וכפי שצוין בעבר, שזה יכול להיות מחוץ ניתוח נוסף על ידי קביעת סף FSC ב 200 9. הכמות המשתנה של פסולת תא שהושגה עם שיטה זו מצביעה על כך שהבדלים בתהליך הדגימהing (עיתוי, שימור רקמות, טמפרטורת מדגם, הסרת המיאלין יעילה, וכו &#39;) יכול להסביר את זה. בנוסף, השימוש במסננות תא נחוץ גם כדי למנוע את נוכחותו של מהדק סלולארי בדגימות; צעד זה צריך להיעשות לפני מכתים תא. שימוש באסטרטגית gating שמוצגת באיור 5 המבוסס על CD11b וביטוי CD45, אנו יכולים להבחין בין התושב ותאי מיאלואידית הסתננו ברקמה איסכמית. עליות אוכלוסיית CD11b + זה בחץ כדור איסכמי בהשוואה לנאיבית ועם קבוצת הדמה, שבו תאים אלה בעיקר קשורים לביטוי נמוך של CD45 המצביעים על כך מיקרוגליה הוא מתרבים לאחר איסכמיה (איור 4, איור 5 ולוח 5) . הבדל זה הוא כנראה עקב חדירת תא מהפריפריה, כפי שמעיד על ידי הופעתו של תת-אוכלוסייה של תאים היי CD11b + CD45 במוח איסכמי (איור 4<html> , איור 5 ולוח 5) שהוא מספר נמוך בנאיבי ובמוח של העמדת פנים. התרומה של מחלחל לאוכלוסיית תא CD11b + באיסכמיה היא תהליך דינמי מאוד 4. במודל MCAO על ידי קשירה, זה יכול להשתנות מ -30% ל -60% מCD11b + התאים הכולל תלוי בגודל של הנגע ושל הזמן שבו האפיון שנעשה. נויטרופילים, מאופיינים כתאי Ly-6G +, הם אוכלוסיית התא הסתנן הרבות ביותר נמצאת ב 24 שעות לאחר MCAO במוח עכבר איסכמי באמצעות מודל זה של איסכמיה המוחית, כפי שהם מהווים 70-80% מCD11b + CD45 היי. שאר התאים הם בעיקר תת-אוכלוסייה של CD11b + CD45 היי Ly-6G - מונוציטים Ly-6C היי פרו-דלקתיים. במודל זה, אוכלוסייה זו תגדל במספר באזורים במוח איסכמי 24-48 שעות לאחר MCAO. ithin-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig1.jpg" /> איור 1:. הליך כירורגי לקשירת MCA () לאחר הנסיגה של השרירים זמניים, פתיחת גולגולת קטנה מתבצעת בגולגולת העכבר. MCA גבעול על ידי קשר או Slipknot באמצעות תפר 9/0. (ב) נציג תמונות של הנגע בקליפת המוח שנוצר על ידי מודל MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> איור 2: כימות אוטם על ידי Cavalieri נפח. (א) נציג תמונות של חלקים במוח צבעוניים Nissl 24 שעות לאחר קשירת MCA קבועה. ההגדלה הגבוהה מציגה את אזור hipocromatic לאחר צביעת Nissl שמזהה את האזור הפגוע (ליבה) לאחר MCAO. פרי-אוטם האזור (PI) מוצג גם. (ב) כימות של האוטם מיוצג כ% Infarcted חצי הכדור (IH%) על ידי שימוש בשיטת Cavalieri בסעיפים מוכתמים-Nissl סדרתי, 24 שעות לאחר MCAO (n = 50 עכברי הנפח ). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> איור 3: כימות Stereological של נויטרופילים באזור infarcted 24 ו -48 שעות לאחר קשירה, תוך שימוש בשיטת Fractionator אופטית. תמונה () נציג של נויטרופילים הסתננו (תאי Ly6G-חיוביים) באזור איסכמי ב 24 שעות לאחר MCAO. תיחום מציג את אזור infarcted. (B, C) ​​דוגמאות למבתר אופטי לכימות נויטרופילים ידי fractionator האופטי. (ד) כימות של נויטרופילים הכולל באזור infarcted ב 24 ו- 48 שעות (n = 4 עכברים). (E)מתאם של מספר הנויטרופילים עם גודל האוטם ב 24 ו -48 שעות לאחר קשירת MCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> איור 4:. ניתוח פיזור dot-עלילת נציג של לויקוציטים המוח המתקבל מנאיבי, זיוף ואיסכמי (24 שעות לאחר MCAO) ההמיספרות על בסיס פרמטרים פיזיים (SSC וFSC) אוכלוסייה של אירועים המבטאות CD11b (אדום) זוהתה בכל הקבוצות. אוכלוסייה זו מגודרת ומאופיינת על פי הביטוי של CD45. תאים המבטאים רמות נמוכות של CD45 (ירוק) היו נוכחים בקליפת מוח איסכמי ולא-איסכמי ותואמים את תאי microglial. בניגוד לכך, תאים המבטאים רמות גבוהות של CD45 (צהובים) היו רקמצא בחצי כדור איסכמי ובקבוצת דמה מידה פחותה. ניתוח נוסף של האוכלוסייה היי CD11b + CD45 מצביע על כך שמונוציטים נויטרופילים (Ly-6G + תאים, כחולים) ופרו-דלקתיים (תאים היי Ly-6C, כתומים) הם תת-אוכלוסיות התאים העיקריות שנמצאו במוח מחלחל 24 שעות לאחר שבץ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> איור 5:. Gating אסטרטגיות כדי לבדל את התושב מתאי מיאלואידית הסתננו ברקמה איסכמית תא CD11b + היה מגודר ראשון לפי עוצמת הקרינה אלוטיפ (). עלילת נקודת נציג של מתלי תא של מוח איסכמי מוצגת בפינה עד-ימנית של הלוח. בבנוסף, ערכים אופייניים למספר הכולל של אירועים ולמספר CD11b + האירועים שנרכשו באמצעות טכניקה זו מוצגים (לא של תאים / חצי הכדור המוח איסכמי;. (א) ניתוח עוצמת CD45 הקרינה של התאים + CD11b מוצג בלוח ב ניתוח עלילת נקודת נציג ביטוי CD45 וCD11b של תת-אוכלוסיית CD11b + מגודר מוצג בפינה עד-ימנית של הלוח. בנוסף, המספר האופייני לתאים היי CD45 lo CD45 רכשו לאונת מוח איסכמי באמצעות טכניקה זו מוצג (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> פרמטרים המשמשים לשיטת Cavalieri </td></tr><tr><td> עובי סעיף (t) </td><td> 30 מיקרומטר </td></tr><tr><td> מטרה </td><td> 10X </td></tr><tr><td> חלק Slice דגימה (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> מרחק בין חלקים </td><td> 600 מיקרומטר </td></tr><tr><td> מרווחי רשת </td><td> 100 מיקרומטר </td></tr></tbody></table> טבלה 1: פרמטרים המשמשים לכימות stereological של רקמת infarcted. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תוצאות </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> אוֹטֵם לֵב </td></tr><tr><td> אזור (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> נפח (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> נפח מתוקן ל במהלך הקרנה (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), מ = 0 </td><td> .068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), מ &#39;= 1 </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), אלפא (q) </td><td> .068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Infarcted חצי כדור </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> המוח יתכן בצקת (כרך שב&quot;ס כרך / המשך) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> טבלה 2: דוגמאות מייצגות של כרכי contralesional, ipsilesional ואוטם בשיטת Cavalieri שימוש בתוכנת חוקר סטריאו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td col<html> = &quot;2&quot; פרמטרים&gt; משמשים לfractionator האופטי תוחלת </td></tr><tr><td> עובי סעיף (TSF) </td><td> 30 מיקרומטר </td></tr><tr><td> מטרה </td><td> 100X </td></tr><tr><td> חלק Slice דגימה (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> ספירת גובה מסגרת </td><td> 40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> ספירת רוחב מסגרת </td><td> 40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> גודל רשת X </td><td> 230 מיקרומטר </td></tr><tr><td> גודל רשת X </td><td> 230 מיקרומטר </td></tr><tr><td> משמר בטוח </td><td> 2 מיקרומטר </td></tr><tr><td> גובה Disector אופטי </td><td> 14 מיקרומטר </td></tr></tbody></table> טבלה 3: פרמטרים המשמשים לכימות stereological של נויטרופילים הסתננו לאחר איסכמיה עם חללית fractionator האופטית על ידי שימוש בתוכנת חוקר סטריאו. <table border="0" cellpadding="0" cellspa</html style=";text-align:right;direction:rtl">cing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> הערכה של נויטרופילים ידי Fractionator האופטי </td></tr><tr><td> מספר דגימת האתרים </td><td> 430 </td></tr><tr><td> לעצב את פקטור </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ סמני ספרה </td><td> 166 </td></tr><tr><td> נויטרופילים הוערכו על ידי Fractionator האופטי </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), מ &#39;= 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), מ &#39;= 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> לוח 4: דוגמא נציג של אומדן נויטרופילים הסתננו לאחר איסכמיה עם חללית Fractionator אופטית על ידי שימוש בתוכנת חוקר סטריאו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> נויטרופילים </td><td> מונוציטים </td><td> Microglia </td></tr><tr><td> נאיבי </td><td> 25863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191.4 </td><td> 19012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> hr 24 Sham </td><td> 24563 ± 5263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1,124 ± 391.5 </td><td> 23734 ± 2,910 </td></tr><tr><td> hr pMCAO 24 </td><td> 47922 ± 23174 </td><td> 4874 ± 748.7 </td><td> 4826 ± 1,345 </td><td> 35395 ± 10833 </td></tr></tbody></table> לוח 5: תוצאות נציג של תאי מיאלואידית נאמדים לאחר איסכמיה עם זרימת גישת cytometry.

Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

אפיון תאי מיאלואידית מוח לאחר שבץ יכול להתבצע על ידי stereology בשיטת fractionator האופטית, או על ידי ניתוח התזרים cytometric של מוח לויקוציטים השעיות. שניהם טכניקות שימושיות לבצע הבחנה phenotypical מדויקת של תת תא מיאלואידית העיקרי נמצאים במוח איסכמי.

Stereological וcytometry זרימת אפיון תת-אוכלוסיות יקוציט במודלים של חולף או קבוע מוחין איסכמיה

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K Views.  Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid.  אפיון תאי מיאלואידית מוח לאחר שבץ יכול להתבצע על ידי stereology בשיטת fractionator האופטית, או על ידי ניתוח התזרים cytometric של מוח לויקוציטים השעיות. שניהם טכניקות שימושיות לבצע הבחנה phenotypical מדויקת של תת תא מיאלואידית העיקרי נמצאים במוח איסכמי. 

Video: Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

היישום של קשירת העורקים התיכון הקבע מוחין העכבר

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

בזמן אמת הדמיה דיגיטלית של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל של פגיעה איסכמיה reperfusion (IRI) של השריר Cremaster עכברוש

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

חסימת כלי דם מוחי בלתי הפיך<em&gt; דרך</em&gt; Ligature וחיתוך רוחב זוגי

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

דוגמנות שבץ בעכברים: קרישה קבועה של עורקי דיסטלי התיכון מוחין

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

דגם שבץ טרומבוטיים בהתבסס על היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Performing מוחות תיכונים דיסטלי קבוע עם ספיגה עורקת Common הראש אצל חולדות בנים לחקר קורטיקלי איסכמיה עם נכות קבועה זה

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

עורקי חלוף דגם ספיג תיכון שיתוק של שבץ ילודים אצל חולדות P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.