This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+after+trauma:+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury.">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke.">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li><li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways.">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li><li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression.">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Il modello di ischemia cerebrale introdotto qui dà volumi infarto altamente riproducibili determinati 24-48 ore e 7 giorni dopo MCA legatura da approcci diversi 8,15,17. Questo modello MCAO ha un basso tasso di mortalità (meno dell&#39;1%) rispetto agli altri, riducendo al minimo il numero di animali usati in studi. Un passo fondamentale per ottenere questo basso tasso di mortalità è di mantenere condizioni asettiche adeguate per evitare le infezioni che potrebbero compromettere la sopravvivenza dopo l&#39;induzione ictus. Questo modello MCAO non può essere utilizzato solo come modello MCAO permanente, che è considerato un modello clinico rilevante per la ricerca traslazionale 18, ma anche come un modello transitorio mediante legatura transitoria del CCA e MCA con un cappio e posteriore riperfusione al momento desiderato 19. Questo metodo è stato utilizzato con successo in topi e ratti 17,20. Tutte queste prove indicano che MCAO mediante legatura è un&#39;alta versatile modello di ischemia cerebrale con più applicazioni. A Critical passo di questa tecnica è che richiede un intervento chirurgico invasivo allo stereomicroscopio; craniotomia deve essere eseguita con molta attenzione per non danneggiare la zigomo nonché la MCA. Tuttavia, l&#39;uso di animali sham (che sono sottoposte alla procedura chirurgica ma CCA e MCA legatura non viene eseguita) fornisce uno strumento utile per discriminare effetti dipendenti dalla procedura chirurgica. L&#39;entità del danno cerebrale dopo questa tecnica può essere quantificata mediante diversi metodi. Il nostro protocollo di sezionamento cerebrale, Nissl e successiva stima del volume Cavalieri permette una quantificazione accurata della regione danneggiata e minimizza il numero di topi utilizzati in questo tipo di studi dal sezioni di cervello seriale possono essere utilizzati anche per l&#39;analisi immunoistochimica differente. Per una migliore prestazione di questa metodologia, è fondamentale scegliere i parametri appropriati utilizzati nel software stereologia (Tabella 1), che saranno necessari per la stima the volume delle diverse regioni dalla formula: V = 1 / * SSF un f * t * ΣP i (SSF è la frazione di campionamento fetta, t è lo spessore medio delle sezioni, una f è l&#39;area della spaziatura della griglia e ΣP il numero di punti di colpire la struttura). Il distale MCAO da legatura può essere utile per caratterizzare la leucociti infiltrati e sottopopolazioni di cellule immunitarie 8,13 che partecipano al processo infiammatorio dopo un trauma cerebrale 1-4. Qui, proponiamo due diverse metodologie per la caratterizzazione delle cellule immunitarie del cervello, un approccio stereologica precisa e una citometria a flusso per una migliore caratterizzazione più leucociti sottopopolazioni. Sfruttando sezionamento cerebrale seriale, la quantificazione del numero totale di neutrofili può essere ottenuto mediante il metodo frazionatore ottica 16, che stima il numero totale di cellule dal numero di celle di spirito campionataha sistematica Casualmente campionati (SRS) insieme di spazi imparziali conteggio virtuali che coprono l&#39;intera regione di interesse, nel nostro caso la regione infartuale, con distanza uniforme tra imparziali spazi conteggio virtuali in direzioni X, Y e Z. Questo metodo fornisce uno strumento preciso per stimare il numero totale dei neutrofili nel cervello ischemico in tempi diversi dopo la legatura. Anche se non è stato dimostrato in questo studio, questo protocollo può essere utilizzato anche per la stima delle differenti sottopopolazioni neutrofili dopo ischemia 21 e per una quantificazione accurata di qualsiasi altra popolazione cellulare trovato nel cervello ischemico come altri leucociti infiltrati (monociti / macrofagi) ed anche per la stima neuroni sopravvissuti o anche per neurogenesi quantificazione dopo l&#39;ictus. Il passo più importante per una stima accurata nella zona desiderata è la selezione dei parametri appropriati, come quelli indicati nella Tabella 3 per neutrofili quantificazione nella zona ischemica.Questi parametri saranno utilizzati per il software stereology per calcolare il numero totale di cellule positive (N) utilizzando l&#39;equazione N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / TSF (ΣQ- è il numero totale di cellule contate con frazionatore, SSF è la frazione di campionamento sezione ASF è l&#39;area frazione di campionamento, e TSF è lo spessore frazione di campionamento) 5. Anche se questo metodo è più lento rispetto ad altre tecniche di quantificazione (per esempio, l&#39;analisi di marcatori neutrofili per mg di tessuto, densitometria di immagini rappresentative o numero di neutrofili per campo), ha il vantaggio di essere un imparziale ed una tecnica solida che fornisce una precisa quantificazione del numero di cellule. L&#39;approccio di isolamento leucociti cervello permette una contemporanea identificazione e la quantificazione dei diversi sottotipi di cellule immunitarie senza la necessità di polarizzare il sistema di colorazione in vivo o manipolazioni genetiche. Cell successivo smistamento della p mieloide caratterizzatoopulations o la loro separazione immunomagnetica possono essere utilizzati per molteplici applicazioni a valle, quali ulteriori studi sul gene o espressione della proteina. La caratterizzazione accurata dei neutrofili, monociti e microglia ottenute con questo metodo offre elevata specificità rispetto a metodi esistenti, come gli studi di immunoistochimica, un vantaggio che permette di assegnare funzioni specifiche per le diverse cellule mieloidi che mediano cervello risposta immunitaria innata. Inoltre, può essere ulteriormente esteso per caratterizzare altre popolazioni del cervello con l&#39;etichetta, come via sanguigna macrofagi (CD11b + CD45 + CD68 hi), e può essere applicata per lo studio di altre patologie del sistema nervoso centrale o lesioni. Pertanto questa tecnica fornisce uno strumento essenziale per esplorare l&#39;eterogeneità della risposta infiammatoria nel cervello. Un limite principale di questa tecnica risiede sulla preparazione delle sospensioni leucociti da tessuto cerebrale fresco, che possono alterare lastato di attivazione delle cellule o loro alterazione antigene. Sebbene questa tecnica consente una caratterizzazione qualitativa più dettagliata rispetto agli studi immunoistochimici, fornisce una quantificazione meno accurato basato su isolamento delle cellule. Nonostante ciò, l&#39;efficienza del nostro protocollo di isolamento cellulare è simile ad altre metodologie pubblicato 9 e può essere utilizzato in modo efficiente per rilevare differenze nel numero di cellule immunitarie cerebrali tra controllo e gruppi MCAO o anche tra gruppi MCAO sottoposti a diversi trattamenti 8. Passaggi critici di questo protocollo sono la dissezione dei tessuti, la procedura di interruzione dei tessuti, e la rimozione mielina. Per quanto riguarda la raccolta dei tessuti, un passo normalizzazione può essere incluso (pesando il tessuto raccolto) per evitare la variabilità a causa di diversi spettacoli di dissezione. Inoltre, la normalizzazione tra diversi gruppi MCAO può anche avvenire attraverso volume dell&#39;infarto (precedentemente determinato Magnetic Resonance). Un altro modo per risolvere questo problema è quello di utilizzare tutto l&#39;emisfero ipsilaterale di entrambi i gruppi ischemici e di controllo, o anche utilizzare l&#39;emisfero controlaterale del mouse ischemico come controllo per minimizzare il numero di animali utilizzati. Mentre questo approccio evita differenze tra ogni dissezione, ha uno svantaggio principale; un fattore di diluizione viene aggiunto aumentando il numero totale di cellule, ma non il numero di cellule mieloidi che si trovano esclusivamente nelle aree centrali e peri-infarto della corteccia ipsilaterale. Per quanto riguarda la rottura del tessuto, questo protocollo illustra i passi per la distruzione meccanica delle cellule cerebrali, evitando trattamenti enzimatici e prevenire la superficie antigene di alterazione 9,22, una questione fondamentale per l&#39;ulteriore analisi qualitativa e quantitativa delle sottopopolazioni di cellule infiammatorie. Oltre alla preparazione della sospensione cellulare di interesse, la rimozione mielina da campioni cerebrali è un passo altamente raccomandato per evitare interferenze con oa valleapplicazioni risma, come ad esempio la separazione immunomagnetica o citometria a flusso 23,24. Questo può essere realizzato con metodi diversi, come saccarosio o gradienti di Percoll, o perline anti-mielina. Qui, e in base a precedenti studi che mettono a confronto diversi metodi per l&#39;isolamento delle cellule cerebrali sospensione, interruzione meccanica in combinazione con l&#39;utilizzo Percoll per rimuovere mielina viene utilizzato per migliorare le rese e la vitalità cellulare 25.

Morfologiche, fenotipiche e alterazioni di espressione genica di microglia, così come stravaso e attivazione dei macrofagi e neutrofili ematogene si ritiene di svolgere un ruolo chiave nella cascata fisiopatologico seguente lesione cerebrale 1-4. Questo protocollo prevede due approcci per stimare il numero di diversi sottoinsiemi di cellule mieloidi del cervello ischemico e per svolgere la loro caratterizzazione fenotipica. Inoltre, fornisce anche una descrizione di un modello sperimentale di ischemia cerebrale in topi, che consiste nella legatura transitoria o permanente di entrambi distale dell&#39;arteria cerebrale media (MCA) e l&#39;arteria carotide comune (CCA), compreso il modo di valutare l&#39;infarto con il metodo Cavalieri accurata utilizzando un software stereologica. Il primo approccio per caratterizzare sottogruppi di cellule mieloidi del cervello ischemico è un metodo stereologica basato sull&#39;approccio frazionatore ottica 5. Questo è il piùcomunemente usato sonda stereologica in scienze biologiche e fornisce un elevato grado di precisione con bassi coefficienti di errore 5-7. Questa è la scelta migliore per la quantificazione delle cellule quando il tessuto viene tagliato in sezioni, in quanto evita la polarizzazione sulla stima delle cellule a causa della frammentazione del tessuto in sezioni. Questo metodo è un modo molto potente per caratterizzare i numeri, dinamiche e cambiamenti fenotipici di sottopopolazioni neutrofili infiltrati del tessuto ischemico 8. Il secondo approccio caratterizzazione è basato su protocollo modificato da Campanella e collaboratori 9 che fornisce un modo semplice per isolare cerebrali sospensioni leucociti e caratterizzarli mediante citometria di flusso. In contrasto con tecniche di immunoistochimica convenzionali, citometria a flusso caratterizzazione permette di differenziare tra microglia (CD45 lo CD11b +) e infiltrati cellule mieloidi (CD45 hi CD11b +) in base alla loro difflivelli di espressione di CD45 erente 9-13. Inoltre, monociti pro-infiammatorie (CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi), neutrofili (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) e altri leucociti sottoinsiemi del tessuto ischemico possono distinguere. Questo approccio fornisce un test affidabile e rapido per valutare neuroinflammation in modelli sperimentali di ischemia cerebrale. Tuttavia, il trattamento del tessuto può influenzare lo stato di attivazione e numero delle diverse popolazioni cellulari presenti nel tessuto ischemico fornire una caratterizzazione semi-quantitativa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

Attivazione della microglia, così come stravaso di macrofagi e neutrofili ematogene, si ritiene di svolgere un ruolo fondamentale in lesioni cerebrali dopo l&#39;ictus. Queste sottopopolazioni di cellule mieloidi possono visualizzare diversi fenotipi e funzioni e devono essere distinti e caratterizzati per studiare la loro regolazione e il contributo al danno tissutale. Questo protocollo prevede due diverse metodologie per la caratterizzazione delle cellule immunitarie del cervello: un approccio stereologica preciso e citometria a flusso. L&#39;approccio stereologica si basa sul metodo frazionatore ottica, che calcola il numero totale di cellule in una zona di interesse (cervello infartuata) stimato per il campionamento casuale sistematico. Il secondo approccio caratterizzazione fornisce un modo semplice per isolare sospensioni leucociti cervello e caratterizzare loro mediante citometria di flusso, consentendo la caratterizzazione della microglia, infiltrato monociti e neutrofili del tessuto ischemico. Inoltre, anche details un modello ischemia cerebrale nei topi che colpisce esclusivamente la corteccia cerebrale, generando infarti altamente riproducibili con un basso tasso di mortalità, e la procedura per l&#39;elaborazione del cervello istologica di caratterizzare il volume dell&#39;infarto dal metodo Cavalieri.

Il modello di ischemia cerebrale qui illustrato genera infarti visto esclusivamente nella corteccia senza influenzare il tessuto striatale poiché i rami lenticulostriatal del MCA che irrorano striato non sono occluse (Figura 1). Con Nissl colorazione, la zona danneggiata può essere identificato come zona corticale ipocromica (Figura 2). Questo modello è caratterizzato da volumi infarto altamente riproducibili a 24 ore dopo MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) stimato dal metodo di Cavalieri in sezioni Nissl-colorate (Figura 2). Stima del volume infartuata dal metodo Cavalieri è un approccio accurata con un errore basso che si riflette nel coefficiente di errore (CE) di Gundersen negli emisferi controlesionale e ipsilesionale nonché nella zona infartuata (Tabella 2). Volume del tessuto danneggiato può essere espressa in mm 3, ma anche come% IH utilizzando la formula nella sezione 3.2.13. Inoltre, la stimadel volume totale delle regioni ipsilesionale e controlesionale consente il calcolo dell&#39;indice di edema per correggere il volume infartuata ed evitare una sovrastima del tessuto danneggiato (Tabella 2). Data la trasformazione seriale sezionamento del tessuto cerebrale, questo può essere sfruttato per eseguire una stima accurata del numero totale delle sottopopolazioni di cellule, come neutrofili infiltrate, nella zona ischemica, utilizzando l&#39;approccio Frazionatore ottico (Figura 3 e nella tabella 4) con i parametri indicati nella tabella 3. Questo protocollo stima un totale di neutrofili (cellule Ly6G-positivi) nella zona infartuata di 23.328 ± 3.623 in 24 ore e 82.856 ± 8.143 in 48 ore nei topi dopo pMCAO (Figura 3D). In accordo con gli studi precedenti, infiltrazione di neutrofili è direttamente correlata con la dimensione infartuale (Figura 3E). Stima di tegli numero di neutrofili dal metodo Frazionatore ottico è un approccio preciso con un basso errore che viene riflessa dalla CE di Gundersen (Tabella 4). L&#39;isolamento dei leucociti e citometria a flusso protocollo caratterizzazione permette l&#39;isolamento di 47.922 ± 23.174 cellule mieloidi dalla corteccia dell&#39;emisfero ipsilesionale di topi ischemici. Questo comprende 10-30% degli eventi totali presenti nella sospensione cellulare. La stragrande maggioranza degli eventi catturati utilizzando questo protocollo presente un parametro basso FSC, associati a detriti cellulari (Figura 4). CD11b colorazione dimostra che le cellule CD11b + hanno un valore elevato FSC (figura 4), ​​suggerendo che detriti cellulari non è etichettato con questo marcatore e, come precedentemente indicato, che può essere escluso da ulteriori analisi impostando la soglia a 200 FSC 9. L&#39;importo variabile di detriti cellulari ottenute con questo metodo suggerisce che le differenze sul processo campioneING (sincronizzazione, la conservazione dei tessuti, la temperatura del campione, la rimozione mielina efficiente, etc.) può rappresentare per esso. Inoltre, è necessario anche l&#39;uso di filtri cellulari per evitare la presenza di morsetti cellulari nei campioni; questo passo deve essere fatto prima della colorazione delle cellule. Utilizzando la strategia gating mostrato nella Figura 5, che si basa su CD11b ed espressione CD45, possiamo discriminare tra residenti e cellule mieloidi infiltrate nel tessuto ischemico. Questo CD11b + popolazione aumenta nell&#39;emisfero ischemica quando confrontati con il naif e con il gruppo sham, in cui queste cellule sono per lo più associate ad una bassa espressione di CD45 che indica che la microglia sta proliferando dopo ischemia (Figura 4, Figura 5 e la Tabella 5) . Questa differenza è probabilmente dovuta alla infiltrazione di cellule dalla periferia, come evidenziato dalla comparsa di una sottopopolazione di cellule CD45 + hi CD11b nel cervello ischemico (Figura 4Figura 5 e la Tabella 5), che è il numero basso di ingenuo e nel cervello sham. Il contributo di infiltrati alla popolazione di cellule CD11b + in ischemia cerebrale è un processo molto dinamico 4. Nel modello MCAO legatura, può variare dal 30% al 60% del totale + cellule CD11b seconda delle dimensioni della lesione e del tempo in cui la caratterizzazione è stato fatto. I neutrofili, caratterizzati come cellule Ly-6G +, sono la popolazione più numerose cellule infiltrate trovato a 24 ore dopo MCAO nel cervello ischemico mouse utilizzando questo modello di ischemia cerebrale, in quanto costituiscono il 70-80% del CD11b + CD45 hi. Il resto delle celle sono per lo più una sottopopolazione di CD11b + CD45 hi Ly-6G - hi monociti pro-infiammatori Ly-6C. In questo modello, questa popolazione aumenterà in numero in aree ischemiche cerebrali 24-48 ore dopo MCAO. Figura 1:. Procedura chirurgica per la legatura MCA (A) Dopo retrazione del muscolo temporale, una piccola craniotomia viene eseguita nel cranio mouse. MCA è legatura da un nodo o un nodo scorsoio con un 9/0 sutura. (B) Immagini rappresentative della lesione corticale generata dal modello MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificazione del volume dell&#39;infarto da Cavalieri. (A) Immagini rappresentative della sezioni di cervello Nissl-macchiati 24 ore dopo permanente MCA legatura. L&#39;alto ingrandimento mostra l&#39;area hipocromatic dopo Nissl colorazione cheidentifica l&#39;area danneggiata (core) dopo MCAO. Viene anche mostrato il (PI) regione peri-infartuale. (B) Quantificazione del volume dell&#39;infarto rappresentato come% infartuato Emisfero (% IH) utilizzando il metodo di Cavalieri in sezioni Nissl-colorate seriali, 24 ore dopo MCAO (n = 50 topi ). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Figura 3: quantificazione stereologica di neutrofili nella zona infartuata 24 e 48 ore dopo la legatura, con il metodo Frazionatore ottico. (A) immagine Rappresentante di neutrofili infiltrati (cellule Ly6G-positivi) della zona ischemica in 24 ore dopo MCAO. Mostra delimitazione dell&#39;area infartuata. (B, C) ​​Esempi di un dissettore ottico per neutrofili quantificazione dal frazionatore ottica. (D) Quantificazione di neutrofili totale della regione infartuato a 24 e 48 ore (n = 4 topi). (E)Correlazione del numero di neutrofili con la dimensione dell&#39;infarto a 24 e 48 ore dopo MCA legatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Figura 4:. Rappresentante analisi dot-plot dispersione dei leucociti cerebrali ottenute da emisferi ingenuo, sham e ischemico (24 ore dopo MCAO) sulla base di parametri fisici (SSC e FSC) è stata identificata una popolazione di eventi che esprimono CD11b (red) in tutti i gruppi. Questa popolazione è stato recintato e caratterizzato secondo l&#39;espressione di CD45. Le cellule che esprimono livelli bassi di CD45 (verde) erano presenti nella corteccia ischemica e non ischemica cerebrale e corrispondevano alle cellule microgliali. In contrasto, cellule che esprimono alti livelli di CD45 (giallo) sono stati solotrova nell&#39;emisfero ischemica e in misura minore in gruppo sham. Ulteriori analisi della popolazione hi CD11b + CD45 indica che neutrofili (Ly-6G + cellule, blu) e pro-infiammatori monociti (cellule Ly-6C hi, arancione) sono i principali sottopopolazioni di cellule presenti nel cervello si infiltra 24 ore dopo l&#39;ictus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Figura 5:. Soppressione strategie per differenziare residente da cellule mieloidi infiltrate nel tessuto ischemico CD11b + cellule sono state in primo luogo recintato in base all&#39;intensità isotipo di fluorescenza (A). Un punto plot rappresentante di sospensioni di cellule del cervello ischemico viene mostrata nell&#39;angolo in alto a destra del pannello. InInoltre, i valori tipici per il numero totale di eventi e per il numero di CD11b + eventi acquisiti utilizzando questa tecnica è mostrato (numero di cellule / ischemico emisfero;. (A) CD45 fluorescenza analisi intensità delle cellule CD11b + è mostrato in pannello B. Un&#39;analisi rappresentante dot plot di CD45 e CD11b espressione della gated CD11b + sottopopolazione è mostrata nell&#39;angolo in alto a destra del pannello. Inoltre, il numero tipico di cellule CD45 hi lo CD45 acquisiti per ischemico emisfero cerebrale con questa tecnica è mostrato (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Parametri utilizzati per il metodo di Cavalieri </td></tr><tr><td> Sezione spessore (t) </td><td> 30 micron </td></tr><tr><td> Obiettivo </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Frazione di campionamento Slice (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Distanza tra le sezioni </td><td> 600 micron </td></tr><tr><td> Griglia spaziatura </td><td> 100 micron </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Parametri utilizzati per la quantificazione stereologica del tessuto infartuato. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Risultati </td><td> Controlesionale </td><td> Ipsilesionale </td><td> Infarto </td></tr><tr><td> Area (μm²) </td><td> 151.460.000 </td><td> 155.060.000 </td><td> 22.600.000 </td></tr><tr><td> Volume (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Volume corretto per Nel corso di proiezione (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Coefficiente di errore (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coefficiente di errore (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0.017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coefficiente di errore (Gundersen), alpha (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Infartuato Hemisphere </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Cervello Edema (Ips Vol / Cont Vol) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: esempi rappresentativi di volumi controlesionale, ipsilesionale e infarto con il metodo Cavalieri utilizzando il Software Investigator Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan style = &quot;2&quot;&gt; parametri utilizzati per la colonna di frazionamento di Optical </td></tr><tr><td> Sezione spessore (TSF) </td><td> 30 micron </td></tr><tr><td> Obiettivo </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Frazione di campionamento Slice (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Conteggio Altezza fotogramma </td><td> 40 micron </td></tr><tr><td> Conteggio Larghezza cornice </td><td> 40 micron </td></tr><tr><td> Dimensione della griglia X </td><td> 230 micron </td></tr><tr><td> Dimensione della griglia X </td><td> 230 micron </td></tr><tr><td> Guardia di sicurezza </td><td> 2 micron </td></tr><tr><td> Optical disector Altezza </td><td> 14 micron </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Parametri utilizzati per la quantificazione stereologica di neutrofili infiltrati dopo ischemia cerebrale con la sonda frazionatore ottica utilizzando il Software Investigator Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspaziamento = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Stima di neutrofili dal Frazionatore Optical </td></tr><tr><td> Numero di siti di campionamento </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Forma Factor </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Totale marcatori contato </td><td> 166 </td></tr><tr><td> I neutrofili stimati di Frazionatore Optical </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coefficiente di errore (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> Coefficiente di errore (Gundersen), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: esempio Rappresentante dei neutrofili infiltrati stimati dopo ischemia cerebrale con la sonda Frazionatore ottico utilizzando il Software Investigator Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> I neutrofili </td><td> I monociti </td><td> Microglia </td></tr><tr><td> Ingenuo </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1.523 </td></tr><tr><td> Sham 24 ore </td><td> 24.563 ± 5.263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1.124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2.910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 ore </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4.874 ± 748,7 </td><td> 4.826 ± 1.345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tabella 5: Risultati rappresentativi delle cellule mieloidi stimati dopo ischemia cerebrale con la citometria a flusso approccio.

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Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Cervello cellule mieloidi caratterizzazione seguente ictus può essere eseguita utilizzando il metodo stereologia frazionatore ottica, o da una analisi citofluorimetrica del cervello leucociti sospensioni. Entrambi sono tecniche utili per effettuare un&#39;accurata distinzione fenotipica delle principali sottopopolazioni di cellule mieloidi trovati nel cervello ischemico.

Stereologica e Citometria a Flusso Caratterizzazione dei leucociti sottopopolazioni in modelli di transitori o permanenti Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

15.4K Views.  Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid.  Cervello cellule mieloidi caratterizzazione seguente ictus può essere eseguita utilizzando il metodo stereologia frazionatore ottica, o da una analisi citofluorimetrica del cervello leucociti sospensioni. Entrambi sono tecniche utili per effettuare un'accurata distinzione fenotipica delle principali sottopopolazioni di cellule mieloidi trovati nel cervello ischemico. 