This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에서 소개 뇌허혈 모델은 높은 재현성 경색 볼륨이 24 ~ 48 시간과 다른 접근 방법 8,15,17으로 MCA 결찰 후 7 일 결정 제공합니다. 이 MCAO 모델 연구에 사용 된 동물의 수를 최소화하는 다른 사람에 비해 낮은 사망률 (1 % 미만)을 갖는다. 사망률이 낮은 비율을 얻기 위해 중요한 단계 뇌졸중 유도 후 생존에 손상을 줄 수있는 감염을 방지하기 위해 적절한 무균 상태를 유지하는 것이다. 이 MCAO 모델은 또한 원하는 시간 매듭 후방 재관류 CCA 및 MCA 과도 결찰술 일시적인 모델로서, 병진 연구 18 임상 관련 모델 간주 영구 MCAO 모델로서 이용 될 수 없다 19. 이 방법은 성공적으로 마우스 및 래트 17,20 사용되어왔다. 이 모든 증거는 결찰에 의해 MCAO 여러 응용 프로그램과 뇌경색의 높은 다양한 모델을 나타냅니다. criti이 기술의 CAL 단계는 실체 현미경 침습 수술을 필요로한다는 것이다; MCA뿐만 아니라 광대뼈 손상되지로서 개두술은 매우 신중하게 수행되어야한다. 그러나 가짜 동물의 사용 수술에 의존하는 효과를 구별 할 수있는 유용한 도구가 제공 (수술하지만 CCA와 MCA 결찰을 실시한다 수행되지 않습니다). 이 기술에 따라 뇌 손상의 정도는 다양한 방법에 의해 정량화 될 수있다. 뇌 절편, Nissl 염색 및 카발리 의한 체적의 후속 추정 우리 프로토콜은 손상된 영역의 정확한 정량 분석​​이 가능하며 직렬 뇌 섹션이 또한 서로 다른 면역 분석에 이용 될 수 있기 때문에, 연구의 이러한 유형에서 사용 된 마우스의 수를 최소화한다. 이 방법론의보다 나은 성능이 Stereology를 소프트웨어에 사용 된 적절한 파라미터를 선택하는 것이 중요하다 (표 1) 번째를 추정 할 필요식 상이한 영역의 전자 량 : V = 1 / SSF는 * f를 * t의 *의 ΣP 난 (SSF는 t가 섹션의 평균 두께, 슬라이스 샘플링 분획이고, f는 그리드 간격의 면적이며 ΣP 구조 타격 포인트의 수). 결찰술 원위 MCAO은 백혈구 침윤 및 면역 세포 아 집단 뇌 손상 1-4 다음 염증 과정에 참여하는 8, 13를 특성화하는 것이 유용 할 수있다. 여기서는 뇌 면역 세포 특성화, 정확한 접근법 stereological 나은 여러 백혈구의 아 집단을 특성화 유세포 분석을위한 두 가지 방법을 제안한다. 직렬 뇌 절편을 살려, 호중구의 총수의 정량화 세포 샘플 재치 수의 세포의 총 수를 추정 광학 분별 법 (16)에 의해 달성 될 수있다하 방향 X에 편견 가상 계산 공간 사이의 균일 한 거리와 우리의 경우, 경색 영역을 관심의 전체 영역을 커버 편견 가상 계산 공간의 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 세트, Y 및 Z를이 방법에 대한 정확한 도구를 제공합니다 결찰 후 서로 다른 시간에 허혈성 뇌에 총 호중구 수를 추정한다. 이 본 연구에 도시되지 않았지만,이 프로토콜은 또한 허혈 21 후에 다른 침윤 백혈구 등의 허혈성 뇌에서 발견 된 임의의 다른 세포 집단의 정확한 정량 다른 호중구 개체군의 추정을 위해 사용될 수있다 (단핵구 / 대 식세포) 또한 생존 신경을 추정 또는 뇌졸중 후 신경의 정량. 것들 허혈 영역에서 호중구 부량 표 3에 나타낸 바와 같이, 원하는 영역의 정확한 추정을위한 가장 중요한 단계는, 해당 변수의 선택이다.이러한 매개 변수는 (ΣQ- 함께 카운트 세포의 총 수이고 N = ΣQ- X 1 / SSF X 1 / ASF X 1 / TSF를 수학 식을 이용하여 전체 포지티브 세포 수 (N)를 계산하는 Stereology를 소프트웨어에 사용될 분별, SSF는 ASF 샘플링 면적 분율이고, TSF는 샘플링 분획 두께) (5)이고, 부 샘플링 비율이다. 이 방법론은 다른 정량화 기법보다 느리지 만 (예를 들어, 조직, 대표적인 이미지 또는 필드 당 호중구 수의 밀도 측정의 MG 의한 호중구 마커의 분석), 그것은 공평하고 정확한 제공 고체 기법이 될 수있는 장점을 갖는다 세포 수의 정량. 뇌 백혈구 분리 방식은 바이어스 할 필요 생체 염색 또는 유전자 조작에 의해 시스템이없는 동시 식별 및 여러 면역 세포 아형의 정량화 수 있습니다. 특징 골수 페이지에서 정렬 이후 세포opulations 또는 면역 자기 분리가 이러한 유전자 또는 단백질 발현에 대한 추가 연구 하류 여러 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 방법으로 얻은 호중구, 단핵구 및 미세 아교 세포의 정확한 특성은 면역 조직 화학적 연구, 뇌의 선천성 면역 반응을 매개하는 다른 골수 세포에 특정 기능을 할당 할 수있는 장점으로 기존의 방법에 대해 높은 특이성을 제공합니다. 또한, 추가로 혈액 태어난 식세포 (는 CD11b + CD45 하이 CD68 +)와 같이, 적절한 라벨 다른 뇌 개체군을 특성화하도록 확장 될 수 있으며 다른 CNS 병리 또는 부상의 연구에 적용 할 수있다. 따라서이 기술은 뇌의 염증 반응의 이질성을 탐구하는 필수적인 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 제한을 변경할 수있는 새로운 뇌 조직으로부터 백혈구 현탁액의 제조에 상주세포 또는 항원 변경의 활성화 상태. 이 기술은 면역 조직 화학 연구에 비해보다 상세한 정 성적 특성 분석을 할 수 있지만, 그것은 세포의 분리에 기초하여 덜 정확한 정량화를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 우리 세포 격리 프로토콜의 효율은 다른 출판 방법론 9 유사하고이를 효율적으로 제어하고 MCAO 그룹 사이 또는 심지어 다른 처리 8 실시 MCAO 그룹 사이의 뇌 면역 세포의 수의 차이를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 해부 조직, 조직 파괴 절차 및 미엘린 제거한다. 조직 수집에 대해서, 정규화 단계 인해 상이한 박리 성능에 변동을 피하기 위해 (수집 된 조직을 칭량) &#39;도 포함될 수있다. 또한, 다른 그룹 사이 MCAO 정규화는 경색 량 통해 발생할 수 (미리 자기 R에 의해 결정esonance). 이 문제를 해결하는 또 다른 방법은 허혈성과 대조군의 전체 동측 반구를 사용하거나, 심지어 사용 된 동물의 수를 최소화하는 대조군으로서 마우스의 허혈성 반구 반대측을 사용하는 것이다. 이 방법은 각 절개 차이점을 회피 동안, 주요 단점이있다; 희석 배수는 독점적 동측 피질의 코어 및 경색 주변 영역에있는 골수 세포의 수를 셀의 총 개수를 증가 아니지만 의해 부가된다. 조직 파괴에 대해서는,이 프로토콜은 뇌 세포의 기계적 파쇄 단계 효소 처리를 방지하고 표면 항원 변조 9,22, 염증 세포 개체군의 추가적인 정성 및 정량 분석을위한 필수적인 문제를 방지를 나타낸다. 관심의 세포 현탁액의 제조뿐만 아니라, 뇌 샘플로부터 미엘린 제거 downst와의 간섭을 피하기 위해 추천 단계는이러한 면역 자기 세포 분리 또는 세포 계측법 (23, 24) 흐름으로 연 응용 프로그램. 이것은 여러 가지 방법, 예컨대 수크로오스 또는 퍼콜 구배, 또는 항 미엘린 비드를 사용하여 달성 될 수있다. 여기, 세포 수율을 개선하는 데 사용됩니다 수초를 제거하는 퍼콜 사용과 함께 뇌 세포 현탁액 분리, 기계적 중단을위한 다른 방법을 비교하고 25 생존 이전의 연구를 기반으로.

형태 학적 표현형 및 미세 아교 세포 유전자 발현의 변화뿐만 아니라, 혈관 외 유출 및 haematogenous 식세포의 활성화 및 호중구가 뇌 손상 1-4 다음 병리 생리 캐스케이드에서 핵심적인 역할을 수행 할 것으로 생각된다. 이 프로토콜은 두 가지 방식 허혈성 뇌 골수 세포의 다른 서브 세트들의 수를 추정하고 자신의 표현형을 특성화를 수행하기 위해 제공한다. 또한, 또한, 방법 경색을 평가 포함 원위부 중뇌 동맥 일시적 또는 영구적 결찰 (MCA) 및 총 경동맥 (CCA)로 구성되어 마우스에서 대뇌 허혈 실험 모델의 설명을 제공한다 stereological 소프트웨어를 사용하여 정확한 카발리 법에 의해. 허혈성 뇌의 골수 세포의 서브 세트를 결정하기에 첫 번째 방법은 광학 분별 접근법에 기초하여 5 stereological 방법이다. 이것은 대부분이며일반적으로 생명 과학 분야 stereological 프로브를 사용하고 오류 5-7의 낮은 계수와 높은 정확도를 제공한다. 이 때문에 섹션으로 조직의 분열의 세포 추정에 대한 편견을 피할 수로 조직이, 섹션으로 잘라 때이 세포 정량을위한 최고의 선택입니다. 이 방법은 숫자, 역학과 허혈성 조직 (8)의 침투 호중구 개체군의 표현형 변화를 특징 짓는 매우 강력한 방법입니다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 백혈구 현탁액을 분리 및 유동 세포 계측법에 의해이를 특성화하는 간단한 방법을 제공 캄파넬라 협력자 (9)로부터 개질 된 프로토콜에 기초한다. 종래의 면역 조직 화학 기법과 대조적으로, DIFF에 기초하여 자신의 골수 세포 (CD45 하이는 CD11b +)을 특성화 (LO는 CD11b + CD45) 미세 아교 세포를 구별 허용 유동 세포 계측법 및 침투CD45 9-13의 erent 발현 수준. 또한, 염증성 단구 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G - LY-6C 안녕은), 호중구는 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G +) 및 허혈성 조직의 다른 백혈구 부분 집합 구별 할 수있다. 이 접근법은 뇌 허혈 실험 모델에서 신경 염증을 평가하는 신뢰성 있고 신속한 분석을 제공한다. 그러나, 조직 처리가 활성화 상태와 반 정량적 특성을 제공 허혈성 조직에서 발견되는 다양한 세포 집단의 수에 영향을 미칠 수있다.

<table><tbody><tr><td>Photonic Led F1</td><td>WPI</td><td>571329-8</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Temp Controller&amp;nbsp;</td><td>Panlab&amp;nbsp;</td><td>HB 101/2</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Volvere GX</td><td>NSK</td><td>Ne22L</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Stainless Steel Burrs</td><td>FST</td><td>19007-14</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5/45&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Suture 6/0</td><td>LorcaMarin</td><td>55108</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Suture 9/0</td><td>LorcaMarin</td><td>61966</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Esteve</td><td>571329-8</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Pentobarbital</td><td>Vetoquinol</td><td>570681</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>SM2000R</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Superfrost slides</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>2014-07</td><td>Lab material</td></tr><tr><td>Cresyl violet acetate</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE300</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>XYZ motorized computer stage and controller</td><td>Ludl electronics Products</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Stereo Investigator System</td><td>Microbrightfield</td><td>Version 7.003 software</td><td>Software</td></tr><tr><td>5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>0913X70</td><td>Lab Material</td></tr><tr><td>Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050&amp;nbsp;</td><td>Lab material</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>p1644-100</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifugue</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td><td>BD</td><td>BD 352340</td><td>Lab Material</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3733-500G</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent, mouse</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-575</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD11b-FITC, human and mouse</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-085</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD45-PE, mouse</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-596</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G-APC, mouse</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-936</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128012</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>BD FACS Flow</td><td>BD</td><td>342003</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur; 4-color</td><td>BD</td><td>342975</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>BD Cell Quest Pro Software</td><td>BD</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Treestar inc.</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라 haematogenous 식세포와 호중구의 혈관 외 유출은 뇌졸중 후 뇌 손상에서 중추적 역할을하는 것으로 생각된다. 이 골수 세포 개체군은 서로 다른 표현형 및 기능을 표시하고 구별 할 필요가 있고 조직 손상에 대한 그들의 규제와 공헌을 연구하는 특징으로 할 수 있습니다. 정확한 stereological 방법 및 유세포 분석 :이 프로토콜은 뇌 면역 세포의 특성화를 위해 두 가지 방법을 제공합니다. stereological 체계적인 접근법은 랜덤 샘플링에 의해 추정이자 (뇌 경색)의 영역에서 세포의 총 수를 계산 광학 분별 법에 기초한다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 현탁액 백혈구를 분리 및 미세 아교 세포의 특성 분석을 허용 유세포들을 특성화하는 간단한 방법을 제공하고, 단핵구 및 호중구 허혈성 조직의 침투. 또한, 교리독점적 사망률의 낮은 속도 및 카발리 법으로 경색 량을 특성화 뇌 조직 학적 처리 절차 재현성 경색을 발생, 뇌 피질에 영향을 쥐 뇌허혈 모델 etails.

여기에 도시 뇌허혈 모델 선조체 관개 MCA의 lenticulostriatal 분기 (도 1)에 흡장되지 않으므로 선조체 조직에 영향을주지 않고 단독으로 본 피질 경색을 발생시킨다. Nissl 염색으로, 손상된 영역은 담색 피질 영역 (도 2)로 식별 할 수있다. 이 모델은 Nissl 염색 섹션에서 카발리 에리 방법에 의해 추정 MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) (그림 2) 후 24 시간에서 높은 재현성 경색 볼륨을 특징으로한다. 카발리 법에 의한 경색 부피의 추정 및 contralesional ipsilesional 반구 Gundersen 님의 에러 (CE)의 계수뿐만 아니라 경색 영역 (표 2)에서 반사되는 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 손상된 조직 부피는 3 mm에서뿐만 아니라 섹션 3.2.13에 수식을 이용한 %를 IH로 표현 될 수있다. 또한, 추정ipsilesional contralesional 영역과의 합계 용적의 경색 부피를 보정하고 손상된 조직 (표 2)의 과대 평가를 피하기 위해 부종 지수의 계산을 허용한다. 뇌 조직의 일련 단면 처리 감안 이것은 광학 분별 방법 (도 3 및 표 4)를 사용하여, 허혈 영역에 침투 호중구와 같은 세포의 아 집단의 총 수의 정확한 추정을 수행의 장점을 취할 수 표 3 매개 변수.이 프로토콜은 24 시간과 pMCAO (그림 3D) 후 마우스에서 82,856 ± 8,143 48 시간에 23,328 ± 3,623의 경색 지역에서 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 총 수를 추정하고있다. 이전의 연구와 일치, 호중구의 침윤 직접 경색 크기 (그림 3E)와 관련된다. t 추정광학 분별 법에 의해 호중구의 수는 그 Gundersen 님 (표 4)에 의해 반사되는 CE 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 백혈구 분리 및 특성화 프로토콜을 유동 세포 계측법은 허혈성 마우스의 ipsilesional 반구의 피질에서 47,922 ± 23,174 골수 세포의 분리를 할 수 있습니다. 이 세포 현탁액에있는 이벤트 총 10-30 %로 포함한다. 세포 파편 (그림 4)에 관련이 프로토콜에 존재하는 낮은 FSC 매개 변수를 사용하여 캡처 사건의 대부분. CD11b를 염색으로 CD11b + 세포는 이전에 표시된 바와 같이이 200 9에서 FSC 임계 값을 설정하여 상기 분석에서 제외 될 수 있음을, 세포 파편이 마커로 표지되지 않은 것을 시사하고, (도 4)보다 높은 FSC 값을 가지고 있음을 보여준다. 이 방법으로 얻은 세포 파편의 양에 따라 샘플 과정에 그 차이를 알 수ING (타이밍, 조직 보존, 시료 온도 효율적인 제거 미엘린 등) 그것을 차지하고있다. 또한, 셀 멤브레인의 사용은 시료에서 셀룰러 클램프의 존재를 피하기 위해 필요하다; 이 단계는 이전의 세포 얼룩을 수행해야합니다. CD11b를 발현하고 CD45에 기초도 5에 도시 게이팅 전략을 사용하여, 우리는 허혈성 조직에 침투 거주자 골수 세포를 구별 할 수있다. 허혈성 반구이는 CD11b + 인구 증가는 (도 4,도 5 및 표 5) 순으로 이들 세포의 대부분이 미세 아교 세포는 허혈 후 확산되어있는 것을 나타내는 CD45의 낮은 발현에 관련되는 가짜 그룹과 비교했을 때 . 허혈성 뇌는 CD11b + CD45 하이 셀 모집단의 출현에 의해 입증되는 바와 같이 이러한 차이 (인해 주변으로부터 세포 침윤에도 4 쉽다그림 5와 순진한와 가짜 뇌에서 적은 수이다 표 5). 뇌 허혈는 CD11b + 세포 침윤 인구의 기여는 매우 역동적 인 과정 4이다. 결찰에 의해 MCAO 모델에서, 30 % 내지 병변의 크기 및 특성이 행해졌 시간 따라 합계는 CD11b + 세포의 60 %로 변할 수있다. LY-6G + 세포로서 특성화 호중구, 그들이는 CD11b + CD45의 70-80 %가 포함 같이, 뇌허혈이 모델을 이용하여 허혈성 마우스 뇌 MCAO 이후 24 시간에서 발견되는 가장 많은 침윤 세포 집단이다 하이. LY-6C 하이 염증성 단핵 세포 - 세포의 나머지는 대부분으로 CD11b + CD45 하이 LY-6G의 하위 집단이다. 이 모델에서는, 본 인구 (24)로부터 48 시간 후 MCAO에 허혈성 뇌 영역의 수를 증가시키는 것이다. 그림 1 :. MCA의 결찰 수술 (A) 시간적인 근육의 수축 후에는, 작은 개두술은 마우스 두개골에서 수행된다. MCA는 매듭 또는 9/0 봉합사를 사용하여 매듭 결찰한다. (B) MCAO 모델에 의해 생성 된 대뇌 피질의 병변의 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> 그림 2 : 카발리 에리에 의해 경색 볼륨의 정량화. (A) Nissl 염색 뇌 섹션의 대표 이미지 영구 MCA 결찰 후 24 시간. 높은 배율 Nissl 염색 후 hipocromatic 영역을 보여주는MCAO 후 손상된 영역 (코어)를 식별합니다. 경색 주변 (PI) 영역이 또한 도시되어있다. (B) (N = MCAO 이후, 일련 Nissl 염색 섹션 50 쥐를 24 시간을 카발리 방법을 사용하여 % 경색 반구 (%의 IH)로 표현 경색 량 정량 ). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> 그림 3 : 경색 영역 (24)에서 호중구 및 결찰 후 48 시간의 Stereological 정량화, 광학 분별 방법을 사용. MCAO 후 24 시간에서 허혈 영역에 침투 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 (A) 대표 이미지입니다. 경계 획정은 경색 영역을 보여줍니다. (B, C) ​​광학 분별에 의한 호중구 정량 광 해부학자의 예. (D) (24)의 경색 지역에서 총 호중구의 정량화 및 48 시간 (N = 4 마우스). (E)경색 (24)의 크기와 MCA 결찰 후 48 시간과 호중구의 수의 상관 관계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> 그림 4 :. 물리적 매개 변수 (SSC와 FSC)에 기초 순진, 가짜 허혈성 (MCAO 후 24 시간) 반구에서 얻은 뇌 백혈구의 대표 도트 플롯 분산 분석으로 CD11b (빨간색)을 표현하는 이벤트의 인구는 확인되었다 모든 그룹에서. 이 인구는 CD45의 발현에 따라 게이트 및 특징이었다. CD45 (녹색) 낮은 수준을 발현하는 세포는 허혈 및 비 허혈성 뇌 피질의 존재 및 소교 세포에 맞습니다. 대조적으로, 세포 (노란색) 높은 수준의 CD45를 발현 만했다허혈성 반구와 가짜 그룹의 낮은 정도에서 발견. 는 CD11b + CD45 안녕하세요 인구의 추가 분석 호중구 (LY-6G + 세포, 파랑)과 염증성 단핵구 (LY-6C 안녕 세포, 오렌지)가 주요 세포 뇌에서 발견 소집단 뇌졸중 후 24 시간을 침투 있음을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">제발 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> 도 5 :. 허혈성 조직에 침투 된 골수 세포로부터 상주 차별화 전략 게이팅는 CD11b + 세포는 먼저 이소 타입 형광 강도 (A)에 따른 게이트 하였다. 허혈성 뇌의 세포 현탁액의 대표 도트 플롯은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 에또한,이 기술을 이용하여 취득한 이벤트들의 총 수 및 CD11b를 + 이벤트 수에 대한 일반적인 값은 (도시 아니 셀 / 허혈성 뇌 반구]. (A)는 CD11b + 세포의 CD45 형광 강도 분석을 패널에 나타낸다 게이트는 CD11b + 아군의 CD45와 CD11b를 표현의 B. 대표 도트 플롯 분석은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 또한, 허혈성 뇌 반구 당 획득 CD45 보라 CD45 안녕 세포의 전형적인 수가이 기술을 사용하여 (B)에 도시되어있다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> 카발리 에리 방법에 사용되는 매개 변수 </td></tr><tr><td> 섹션 두께 (t) </td><td> 30 μm의 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> 슬라이스 샘플링 비율 (SSF) </td><td> (1)/ 20 </td></tr><tr><td> 섹션 사이의 거리 </td><td> 600 μm의 </td></tr><tr><td> 그리드 간격 </td><td> 100 ㎛ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 경색 조직의 stereological 정량에 사용되는 매개 변수. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 결과 </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> 경색 </td></tr><tr><td> 지역 (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> 볼륨 (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> 볼륨에 대한 수정 프로젝션 이상 (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;강한&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) m = 0 </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) m = 1 </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) 알파 (Q) </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % 경색 반구 </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> 뇌 Oedema (IPS 권 / 계속 권) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 스테레오 탐정 소프트웨어 사용 카발리 법에 의해, contralesional ipsilesional 경색 부피의 대표적인 예. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td col광학 분별 사용 범위 = &quot;2&quot;&gt; 매개 변수 </td></tr><tr><td> 섹션 두께 (TSF) </td><td> 30 μm의 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> 슬라이스 샘플링 비율 (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> 프레임 높이를 계산 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> 프레임 폭을 계산 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> X 격자 크기 </td><td> 230 μm의 </td></tr><tr><td> X 격자 크기 </td><td> 230 μm의 </td></tr><tr><td> 안전 가드 </td><td> 2 μm의 </td></tr><tr><td> 광학 Disector 높이 </td><td> 14 μm의 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 프로브 분별 뇌허혈 후 호중구 침윤 stereological 정량화에 사용 파라미터. <table border="0" cellpadding="0" cellspa의 cing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> 광학 분별에 의한 호중구의 추정 </td></tr><tr><td> 샘플링 위치의 수 </td><td> (430) </td></tr><tr><td> 형상 인수 </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> 총 마커 카운트 </td><td> (166) </td></tr><tr><td> 광학 분별에 의해 추정 된 호중구 </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 분별 프로브 뇌 허혈 후 예상 침투 호중구의 대표적인 예. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 는 CD11b + </td><td> 호중구 </td><td> 단핵구 </td><td> 미세 아교 세포 </td></tr><tr><td> 소박한 </td><td> 25,863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191.4 </td><td> 19,012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> 샴 24 시간 </td><td> 24,563 ± 5,263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1124 ± 391.5 </td><td> 23,734 ± 2,910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 시간 </td><td> 47,922 ± 23,174 </td><td> 4874 ± 748.7 </td><td> 4826 ± 1345 </td><td> 35,395 ± 10,833 </td></tr></tbody></table> 표 5 : 접근 유동 세포 계측법과 뇌 허혈 후 추정 된 골수 세포의 대표 결과.

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Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.6K 조회수.  Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid.  다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다. 

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Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

마우스의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 중간 대뇌 동맥 Intraluminal 폐색 (MCAO) 모델

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

의학

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

쥐의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 엔도 테린-1 유도 중간 뇌 동맥 폐색 모델

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ischemic in origin and occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA). Currently the only Food and Drug Administration (FDA) approved drug for the treatment of this devastating disease is tissue plasminogen activator (tPA). However, tPA has a small therapeutic window for administration (3 - 6 hr), and is only effective in 4% of the patients who actually receive it. Current research focuses on understanding the pathophysiology of stroke in order to find potential therapeutic targets. Thus, reliable models are crucial, and the MCA occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) is deemed to be the most clinically relevant surgical model of ischemic stroke, and is fairly non-invasive and easily reproducible. Typically the MCAo model is used with rodents, especially with mice due to all the genetic variations available for this species. Here we describe (and present in the video) how to successfully perform the MCAo model (with reperfusion) in mice to generate reliable and reproducible data.

In order to understand the pathophysiology of stroke, it is important to use reliable models. This paper will describe one of the most frequently used stroke models in mice, termed the middle cerebral artery occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) with reperfusion.

마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색 및 재관류 유도 스트로크에 대한 수술 적 접근

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ...

Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be altered by severe brain injury. This is evidenced by the fact that pneumonia is a major cause of mortality in patients who have suffered from ischemic stroke. The goal of this protocol is to describe the use of multicolor flow cytometric analysis to identify 13 types of immune cells in the lungs of mice, including alveolar macrophages, interstitial macrophages, CD103+ or CD11b+ dendritic cells (DCs), plasmacytoid DCs, eosinophils, monocytes/monocyte-derived cells, neutrophils, lymphoid-derived&#160; T and B cells, NK cells, and NKT cells, following ischemic stroke induction by transient middle cerebral artery occlusion. Moreover, we describe the preparation of lung homogenates using a bead homogenization method, to determine the expression levels of 13 different cytokines or chemokines simultaneously by multiplex bead arrays coupled with flow cytometric analysis. This protocol can also be used to investigate the pulmonary immune response in other disease settings, such as infectious lung disease or allergic disease.

This protocol describes the use of flow cytometry to identify the changes in immune cell composition, cytokine profile, and chemokine profile in the pulmonary environment following transient middle cerebral artery occlusion, a murine model of ischemic stroke.

폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 2 배 폐색 마우스 모델

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

Murine Brain 및 Skull Bone Marrow에서 Single-Cell Suspensions 획득

Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only in the brain, but also in the skull. A key step toward analyzing changes in immune cell populations in both the brain and skull bone marrow after brain damage (e.g., stroke) is to obtain sufficient numbers of high-quality immune cells for downstream analyses. Here, two optimized protocols are provided for isolating immune cells from the brain and skull bone marrow. The advantages of both protocols are reflected in their simplicity, speed, and efficacy in yielding a large quantity of viable immune cells. These cells may be suitable for a range of downstream applications, such as cell sorting, flow cytometry, and transcriptomic analysis. To demonstrate the effectiveness of the protocols, immunophenotyping experiments were performed on stroke brains and normal brain skull bone marrow using flow cytometry analysis, and the results aligned with findings from published studies.

저자 스포트라이트: 뇌 허혈 후 복잡한 면역 반응 조사

To investigate the immune response to brain disorders, one common approach is to analyze changes in immune cells. Here, two simple and effective protocols are provided for isolating immune cells from murine brain tissue and skull bone marrow.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only ...