פיתחנו פרוטוקול מוגדר, ניתן לשחזור וותיק עבור רצף RNA קטן וניתוח קריאות מנורמלות באמצעות כלים ביואינפורמטיקה opensource. היתרונות העיקריים של האסטרטגיה שלנו הם שהיא אוספת במדויק microRNAs באמצעות טיהור ג'ל, כי ניתוח ביואינפורמטיקה ניתן ליישם ללא קשר לאופן שבו microRNAs נאספים. רצף תפוקה גבוה של microRNAs יכול לחשוף תובנה לתוך מנגנוני המחלה, עיבוד microRNAs, ואת כימות מדויק של גישות ריפוי גנטי המספקים RNAs קטנים.
הקפד לעבוד בסביבה חופשית RNase ולשמור את כל מוצרי RNA על קרח לאורך כל ההליך. הדמיה של שלבי חיתוך הג'ל תסייע לצופים לזהות את הגודל הנכון של המוצרים הדרושים ליישומים במורד הזרם. לקבלת שלוש רצועות מתאם עיקריות, שלבו 11 מיקרוליטרים של RNA עם 1.5 מיקרוליטרים של חיץ תגובת רצועות T4RNA ללא ATP, מיקרוליטר אחד של פוליאתילן גליקול ו-0.5 מיקרוליטר של שלושה מקשרים עיקריים.
מחממים את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס על תרמוצ'יקלר למשך 30 עד 40 שניות, ולאחר מכן מתקררים על הקרח למשך דקה אחת. מוסיפים מיקרוליטר אחד של T4RNA ligase 2 ו דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. בזמן שהדגימות דגירה, יוצקים ג'ל פוליאצ'יארילאמיד 15%בין 0.8 מילימטר צלחות זכוכית מופרדות ביצוק פלסטיק ומכניסים מסרק.
כאשר הג'ל התגבש, מוסיפים 0.5 5X TBE למיכל ו pipette במרץ לשטוף את בארות של אוריאה שיורית. לאחר טרום הפעלת ג'ל פוליאקרילמיד במשך 25 דקות ב 375 וולט, לטעון את הדגימות משאיר לפחות נתיב אחד בין כל מדגם. לטעון 20 microliters של לפחות שני סטים של סמנים בתבנית סימטרית כדי לעקוב אחר כיוון הג'ל ולהפעיל את הג'ל קבוע 375 וולט.
לאחר 15 דקות, להגדיל קבוע 425 וולט לשאר הריצה ולהפעיל את הג'ל במשך כשעתיים. בסוף הריצה, השתמש מפריד צלחת כדי להסיר את הג'ל מצלחות הזכוכית ולה מניחים את הג'ל על מגן דף פלסטיק. מדללים חמישה מיקרוליטרים של אתידיום ברומיד ב-500 מיקרוליטרים של מים מזוקקים ומוסיפים את הצבע לנתיבי הסמן ממש מעל הסמן הכחול בהיר העליון.
לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את הג'לים מהסמן העליון לתחתון בכל נתיב תחת אור אולטרה סגול ולהעביר את החלקים לריבוע של ארבעה על ארבעה סנטימטרים של סרט איטום מעבדה. חותכים את הג'ל עם כשלושה חתכים אופקית ושני חתכים אנכית כדי לייצר 12 ריבועים קטנים. הוסף 400 microliters של 0.3 כלוריד נתרן טוחן על סרט האיטום ולהנחות את חתיכות ג'ל לתוך 1.5 צינורות סיליקון מיליליטר.
להתסיס את הדגימות על מטורף בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, להעביר 400 microliters של כל על טבעי לצינורות חדשים. מוסיפים מיליליטר אחד של 100%אתנול ומיקרוליטר אחד של 15 מיליגרם למיליליטר גליקוגן קו-ציסטליטר לצינור.
ואז לאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. עבור חמש רצועות קישור עיקריות, סובבו תחילה את הדגימות המופשרות והתינו מחדש את הכדורים במים. לאחר מכן, להוסיף 0.5 microliters של 100 micromolar חמישה מקשר הממשלה, מיקרוליטר אחד של חיץ ליגות T4RNA, מיקרוליטר אחד של 10 מילימולר ATP, ומיקרוליטר אחד של פוליאתילן גליקול לכל מדגם.
מחממים את התגובות ב-90 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לפני הנחתן על קרח. לאחר מכן מוסיפים מיקרוליטר אחד של T4RNA ligase אחד לכל צינור להדרור את התגובות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. עבור שעתוק הפוך, לאסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה resuspend את האוויר מיובש גלולה ב 8.25 microliters של מים ללא גרעין.
הוסף 0.5 microliters של 100 מיקרומולר הפוך תעתיק פריימר וחמישה microliters של 2X הפוך תעתיק תגובה לערבב מערכת סינתזה DNA משלימה. לאחר שלוש דקות ב 42 מעלות צלזיוס, להוסיף 1.5 microliters של אנזים תעתיק הפוך 10X לכל מדגם עבור דגירה 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר. לאחר נטרול, להכין תגובת PCR עם 29.5 microliters של מים, חמישה microliters של חיץ 10X taq, מיקרוליטר אחד של נוקליוסייד טריפוספט, שני microliters של 25 מיקרומולרים קדימה פריימר, שני microliters של פריימר הפוך 25 מיקרומולאר, 0.5 microliters של פולימראז תד, ו 10 microliters של התעתיק ההפוך
לאחר מכן הפעל שתי תגובות PCR. לטיהור ג'ל אגרוז, הכינו ג'ל 4% אגרוז עם אגרוז נמס נמוך והעמיסו 40 מיקרוליטר או יותר של מוצר PCR על הג'ל עם צבע טעינה ו-100 סמני בסיס ו-25 סמני גודל של זוג בסיס. לאחר הפעלת הג'ל, חותכים את הרצועה מעל רצועת 125 זוג הבסיס ולהשתמש בערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.
יש לנער כדי להמיס את רצועת הג'ל במאגר בטמפרטורת החדר לפני השימוש בציוד המתאים לכימות ספריית הרצף הסופית. לאחר מכן השתמש בכלי הביואינפורמטיקה המתאימים למקור פתוח כדי לנתח את נתוני הרצף. בתגובת PCR מייצגת זו על ג'ל אגרוז נמס נמוך, ניתן לראות את רכישת המוצר המשוכפל הנכון בהשוואה למוצר מקשר המשיג ודגימות בלתי רוויות לעומת רוויות.
לאחר יישור סיכות שיער microRNA אנושי, קונקורדנס חזק בין ספירת קריאת microRNA בכל שכפול ניתן לראות. בסך הכל זוהו 306 מיני מיקרו-רנ"א עם המספר הגדול ביותר של קריאות המיפוי למיקרו-רנ"א 122. חשוב לזכור לחתוך את הג'לים בגודל המתאים כדי לאפשר התאוששות מדויקת של microRNAs.
לאחר רצף microRNAs, משתמשים יכולים ליישם ניתוח ביואינפורמטיקה כדי לאפיין את התפלגות microRNAs בתוך הרקמות שלהם עניין. טכניקה זו שימשה כדי לזהות כיצד microRNAs מעובדים אילו קבוצות של microRNAs משתנים בסרטן מסוימים. הקפד לממש טיפול בעת טיפול ברומיד אתידיום וכאשר מסתכלים על הג'לים תחת אור אולטרה סגול.
