עבודה זו נתמכה על ידי סוכנות הידיעות לאומי דה לה משוכלל ונדיר (Jeunes Chercheuses / Chercheurs Jeunes לEFN), Fondation Voir et Entendre וFondation טנקור שולר (מענקים לחוקר צעיר לEFN), המרכז הלאומי דה לה משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS, משרה קבועה לEFN) , והעין הלאומית של המכון הלאומי לבריאות (R01-EY13295 לSCF). בנוסף, Institut de la החזון ממומן על ידי המכון הלאומי דה לה סנטה et de la משוכלל ונדיר Medicale, Université פייר et מארי קירי בפריז 6, המרכז הלאומי דה לה משוכלל ונדיר Scientifique ומחלקת de Paris.

ניסוי בידוד POS זה זמן רב ועשוי לדרוש עד 12 שעות כדי להשלים אם POS מסומנים לפני האחסון. הפרוטוקול הותאם ממאמר שפורסם על ידי RS Molday ועמיתים בשנת 1987 31 ושונים על ידי SC Finnemann ועמיתים בשינה 1997 10. בעלי חיים טופלו על פי האגודה לחקר חזון הצהרת העיניים (Arvo) לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון. פרוטוקולים היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה צ&#39;ארלס דארווין מהפירית ומארי קירי אוניברסיטת פריז-06 והוועדה מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת פורדהם. 1. הכללי Set Up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 80 עיני חזיר או פרה טריות טרי ברגע לאחר ששחט ככל האפשר, ולשמור אותם צונן בחושך. מספק הוראות לנותן ולכן החברה ממשיכה באותה הדרך. פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור 80 עיניים. ללהמשיך עם יותר עיניים ולקבל מניות גדולות יותר (לדוגמא,, מ -160 עיניים), להכפיל את כמויות הפתרון ולבצע 2 סיבובים של ultracentrifugation; דגימות בריכה לאחר מכן בשלב הגבייה (ראו שלב 2.2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקימו על ספסל מנורת safelight האדומה, רפידות סופגים, מגבונים (שולחן חומרים). להכין מאכלי 15 סנטימטר ושקיות לאיסוף פסולת ביולוגיות מסוכנות (חלקי העין שאינה בשימוש, זגוגי ...). ללבוש חלוק מעבדה צמודה, כפפות, מגיני שרוול ומשקפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמצעי זהירות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צמרמורת כל הפתרונות אז לשמור אותם קר בכל הצעדים. שמור את העיניים והדרגות מקוררים על קרח ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העיניים ורקמות נגזרות בחושך ככל האפשר עד שלב האיסוף לאחר ultracentrifugation להימנע photobleaching של פיגמנטים והפסד של הצבע הכתום-ורוד של הצורה הפעילה של photopigments חזותיים. </li></ol></li></ol> 2. פעולות פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות והדרגות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניית טאורין הפשרה באמצעות לחלוטין אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל הפתרונות מפתרונות מניות (טבלת 1, פתרונות מניות) ומערבבים היטב סוכרוז עם מרכיבים אחרים באמצעות stirrer מגנטי לכל פתרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 15 מיליליטר של פתרון הומוגניזציה לריכוז סופי של סוכרוז 20%, 20 מ&quot;מ טריס pH7.2 אצטט, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 10 מ&quot;מ וגלוקוז 5 טאורין מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון סוכרוז 25% לריכוז סופי של סוכרוז 25% (באמצעות 70% מניות סוכרוז), pH 20 מ&quot;מ אצטט טריס 7.2, 10 מ&quot;מ וגלוקוז 5 טאורין מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון סוכרוז 60% לריכוז סופי של סוכרוז 60% (באמצעות אבקת סוכרוז), 20 מ&quot;מ טריס pH7.2 אצטט, גלוקוז 10 מ&quot;מ ו 5 מ&quot;מ טאורין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לשטוף 1 לריכוז סופי של pH 20 מ&quot;מ אצטט טריס 7.2 ו -5 טאורין מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לשטוף 2לריכוז סופי של סוכרוז 10%, pH 20 מ&quot;מ אצטט טריס 7.2 ו -5 טאורין מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לשטוף 3 לריכוז סופי של סוכרוז 10%, pH פוספט נתרן 20 מ&quot;מ טאורין 7.2 ו -5 מ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את יצרנית השיפוע על stirrer מגנטי והכנס בר ומערבב בתא הקרוב ביותר ליציאה שבו פתרון 60% יוכנס. השתמש טיפ pipet P200 חתך שהוצב ביציאה של הצינור כדי להשיג מהירות ליהוק נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עופרת הדרגתיים ליניארי בעדינות על ידי דילול וערבוב תמיסת סוכרוז 60% עם אחד 25% באמצעות 12 מ&quot;ל מכל פתרון (כלומר, סך הכל 6 צינורות עבור 80 עיניים) בצינורות ultracentrifuge טרום צוננים. מערבבים את פתרון סוכרוז 60% בהדרגה-דילול גם. לייצב את מהירות זרימת שיפוע, לשפוך את הפתרון בצורה חלקה ולא מהר מדי. הערה: על מנת לקבל שיפוע רציף, ליניארי, לשמור על פתיחת טיפ pipet תקין על פני השטח של הפתרון לכל formatio השיפועn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הדרגתיים לשבת על קרח סביב 1 hr לייצוב. שמור הדרגתיים מקורר עד טעון. אין לנער את הצינורות כדי למנוע שיבוש של השיפוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף רקמות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות של רקמות תחת אור אדום עמום. קח העין ביד אחת ולתקוע קדמי עם קצה של סכין גילוח, ולהחזיק בעין משם (כדי למנוע התזות; איור 1). השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך את גלגל העין הקדמית ל -2 חצאים (קרנית בתוספת לפחות 5 מ&quot;מ ללובן העין). הסר את העדשה ולהפוך את עיינית מבפנים החוצה, כך שהוא יכול להיות מוחזק על קצה אצבע אחת וכך חושפת את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסכין הגילוח בזווית, בעדינות לגרד הרשתית, ניתוק בקלות ומופיע כשכבת ורדרד, את פני השטח הטפטום ולחתוך בראש עצב הראייה (איור 1). לאסוף את כל הרשתיות ב 2 x 50 בכל המכיל 15 מיליליטר של תמיסת הומוגניזציה על קרח צינורות מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומו רשתיתgenization: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את ההשעיה בתוקף ביד במשך 2 דקות כדי לשבש את שכבות תאים השונות, לשבור קופה את שאר תא יחסי הציבור, קופה הבר וhomogenize ההשעיה הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן 3x דרך שכבה כפולה של גזה נקייה כדי להסיר שברי רקמה גדולים ולאסוף את הזרימה דרך בצינורות 50 מיליליטר נקיים (איור 1). ההשעיה הרשתית להיות די עבה, על מנת למקסם את התשואה, לחץ בעדינות על הגזה לשחרר רקמות מקוטעות שנותרו לאחר כל סינון. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד קולטי אור חיצוני בר מגזר (POS): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להניח את הכנת הרשתית גולמי, סביב 6-7 מ&quot;ל לכל צינור, מעל 6 x 30 צינורות ultracentrifuge מיליליטר כל 24 מיליליטר מכיל טרי מצונן רציף 25 - שיפוע 60% סוכרוז (איור 1). לאזן את הצינורות המתנגדים בהתאם לרוטור כדי לשמש. Ultracentrifuge ב106,000 XG במשך 50 דקות ב 4 ° C. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את רוב הפתרון מעל הרצועה הכתומה-ורוד בשליש העליון של שיפוע על ידי שאיפה (איור 2 א). לאסוף את הלהקה הוורודה-הכתומה עם קצה P1000 חתך לתוך מבחנה. מחק את שאר הנטרול באמצעות אקונומיקה (פסולת ביולוגית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל עם ~ 4 - 5 כרכים של לשטוף קר כקרח פתרון 1. להפריד לתוך צינורות מיליליטר 30 לפי צורך. צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להשליך בזהירות את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי Resuspend ב 10 מיליליטר לשטוף 2 פתרון וספין ב3,000 XG במשך 10 דקות כפי שפורט לעיל. כדורי Resuspend ב 15 מיליליטר לשטוף 3 ספין שוב ב 3000 XG במשך 10 דקות. לשלב השעיות מכמה כדורים כדי להפחית את מספר צינורות צורך לפני צנטריפוגה בWash 2 ולשטוף 3 פתרונות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> POS aliquoting ללא תיוג: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend POS ב10 - 20 מיליליטר DMEM. Predilute 10 μl ב490 DMEM μl (01:50) ולספור מוארך כמו גם POS הסתחרר בתא ספירת תאים (איור 2). חישוב תשואה וריכוז בחלקיקי POS לכל מ&quot;ל. הערה: התשואה משתנה, לרוב בהתאם לגיל והמתח של חזירים / פרות והגודל של העיניים, למשל, הכנה טובה נעה בין 5 - 8 עיניים x 10 9 POS מ -80 חזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט על גמר DMEM הנפח (בדרך כלל 10 - 20 מיליליטר) ולהוסיף סוכרוז להניב ריכוז סופי של סוכרוז 2.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquots בגודל הרצוי, לדוגמא, 5 x 10 7 POS לכל צינור למ&quot;ל 2 resuspension נפח לניסוי 96-גם בגיל 40 μl / טוב. ספין aliquot 1 במשך 5 דקות ב2,300 XG ב RT ולהעריך גודל גלולה. הכן גדלי aliquot שונים להיקפי יישום שונים כמו קופה לא צריכה להיות קפוא ומופשרת פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא aliquots POS ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. הערה: Aliquots יציב במשך חודשים רבים. בידיים שלנו, POS ללא תווית או שכותרתו יכול להיות מאוחסן במשך שנה אחת לפחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג קופה וaliquoting: הערה: אנו משתמשים בדרך כלל FITC לתייג POS לכימות של מבחני phagocytosis, אבל צבעים אחרים עשויים לשמש גם בהתאם לצרכים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון Resuspend 1 10 מ&quot;ג FITC ב2.5 מ&quot;ג / מיליליטר ריכוז בpH 0.1 חיץ קרבונט M Na 9.5 על ידי ערבוב של 2.6 מיליליטר 0.1 M NaHCO 3 pH 8.4 עם 1.4 מיליליטר 0.1 M Na 2 CO 3 pH 11.5 (טבלת 2, פתרונות מניות). סובב לשעה 1 בRT תוך הגנה מפני אור וספין במשך 5 דקות במהירות המרבית כדי גלולה מוצקי FITC שאינו resuspended. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה POS ב 10 מיליליטר של לשטוף 3 פתרון (או DMEM) ולהוסיף 2 מיליליטר של תמיסת FITC עבור 80 עיניים. אחסן שאריות FITC הקפוא ב -80 ° C. סובב לפחות 1.5 שעות ב RT. להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף POS שכותרתו פעמיים באמצעות לשטוף פתרון 3 כמפורט בסעיף 2.3.4, ולאחר מכן פעם או פעמיים בDMEM עד כמעט ולא FITC חופשי נתפס בf supernatantraction. Resuspend POS בDMEM והמשך כלקופה ללא תווית לספירה וaliquoting (סעיף 2.4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקופה בניסויים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> POS הפשרה בRT, ולשמור אותם בחושך ככל האפשר אם הם fluorescently שכותרתו. ספין במשך 5 דקות ב2,300 XG ב RT. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend מייד בנפח המתאים של פתרון assay כפי שהוכתב על ידי הניסוי. במקרה של זמנים שונים של אתגר POS, חנות resuspended POS ב RT בחושך בין נקודות זמן לכמה שעות. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

שלושה שלבים או תנאים חיוניים לטיהור מותאמת: איכות ליהוק שיפוע ומניפולציה צינורות שיפוע עדינה, שמירה על רקמות מצוננות ובחושך עד שלב האיסוף, כוח של טלטול של homogenates הרשתית להשיג בידוד POS ראוי משאר יחסי הציבור תא. אם כמה בעיות מתעוררות ברואה הלהקה הכתומה כראוי, הם ככל הנרא...

ברשתית, ראייה מופעלת על ידי isomerization של מולקולות רגישות לאור הנקראות opsins, לפני שהפך לאות שניתן להעביר בין הנוירונים עד לאזורים החזותיים במוח. מולקולות אלה מוטבעים בערימות של דיסקים קרומיים הדומים פנקייק, המהווה את החלקים החיצוניים קטע של תאי קולטי אור (PRS). נתון חשיפה מתמדת לאור ולכן רמות ניכרות של סטרס חמצונים, הפורטוריקנים ברציפות לחדש מגזרים החיצוניים שלהם כדי להגביל את נזק חמצוני פוטנציאלי. מגזרים חיצוניים קולטי אור נמצאים בקשר הדוק עם microvilli הפסגה של התאים השכנים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). תאי RPE מהווים חלק החיצוני של מחסום הדם-רשתית ולהבטיח שורה ארוכה של משימות שהם חיוניים לבריאות קולטנית אור ופונקצית 1, כגון מרווה קרני אור באמצעות פיגמנטים המלנין, מחדש isomerization של רשתית מרכיב opsin photoreactive, חומרים מזינים ומתן growth גורמים, משתתף ברשות המטבוליט יחסי הציבור. בנוסף, תאי RPE לחסל בילו POS ולמחזר מרכיביהם, כיבוש יומי שמוסדר על ידי מקצב צירקדי ברשתית יונקים 2,3. האישור של קופה סככה הוא הכרחי להישרדות יחסי ציבור. כאשר הוא ביטל לחלוטין, לצבור פסולת קופה והפורטוריקנים להידרדר גורמים 4,5 אובדן ראייה מהיר. אם הפרופיל הקצבי הולך לאיבוד והוחלף על ידי פעילות מתמדת, פגמי יחסי הציבור והרשתית לצבור עם גיל 6. לכן, חשוב מאוד לאפיין את הרגולציה המולקולרית של phagocytosis הרשתית במבחנה כדי להבין פנוטיפים הקשורים לבעיות בתפקודה. מעניין, את המנגנון המולקולרי בתאי הרשתית הוא מאוד דומה לזה המשמש על ידי מקרופאגים כדי לנקות תאים אפופטוטיים ושניהם תלויים בהכרה של phosphatidylserine נחשף בפסולת phagocytic 7-9. ובכל זאת, תאי הרשתית ומקרופאגים להסדיר phagocytosis שונה, כמו מקרופאגים לבחור לחיסול מיידי של תאים אפופטוטיים בזמן מפגש בזמן שתאי RPE בקצב לבלוע POS רק פעם ביום למרות הקשר הקבוע שלהם עם מגזרים חיצוניים. הדבר מצביע על מנגנוני רגולציה ספציפיים שעדיין אינם מובנות במלואו. רב של המולקולות מעורבות במכונות phagocytic הרשתית זוהו או תוקף הודות לשימוש בקופה מבודדת ומבחני phagocytosis תרבית תאים. קולט integrin alphavbeta5 ממוקם על פני תא פסגת הרשתית, בתיאום עם יגנד MFG-E8, נקשר באופן ספציפי ל10-12 POS, אשר לאחר מכן הם הפנימו באמצעות קולטן טירוזין קינאז MerTK 13-15. קולט נבלות CD36 הוכח להשתתף בצריכת קופה ולהשפיע על המהירות שלו 16,17, ועשוי לשמש כחיישן של פוספוליפידים חמצון על פני השטח POS 18. הפנמה צריכה הגיוס של שלד תא-התחת F- אקטיןחלבוני ociated כגון Annexin 2 19, שרירן II 20 ושרירן VIIA 21,22. POS Native או מתחמצן במבחנה גם מנוצלים להבין פנוטיפים הזדקנות של תאי RPE in vivo קשורים להצטברות של POS מתעכל בצורה גרועה חמצון 23-28. הדור של תאי RPE שמקורם בתאי גזע יזם בקשה חדשה לקופה מבודדת המשמשים להוכחה פונקציונלי של תאים לפני שהם מושתלים לבעלי חיים או חולים 29,30,27. תואר לראשונה על ידי Molday ועמיתים בשינה 1987 31, הפרוטוקול לבידודה של קופה שור משלב צעד ultracentrifugation של homogenates רשתית במילויי סוכרוז רציפים עם תצפית של המראה הכתום האופייני לphotopigment רשתית מולבן (ביצוע 11- רשתית cis). בעבר 10 השנים, בשל אמצעי זהירות שננקטה על מנת לצמצם את הסיכון של מחלת פרה משוגעת, שימוש בעיניים חזיריות הפכו increasingly בולט. הפרוטוקול המתואר כאן מראה כיצד להשיג כמויות גדולות של POS מחזירי או עיני שור שניתן aliquoted ומאוחסנים לפרקי זמן ממושכים. זו מבטלת את הצורך להכין POS מעיני מכרסם, המחייב שימוש במספר רב של בעלי חיים להכנת POS וassay 32,33,21,22. בנוסף, פרטים על תיוג POS לפני האחסון באמצעות מולקולות ניאון ניתנים, לכמת ולחזות POS באופן פשוט ובר-השוואה ליישומים מסוימים בהשוואה לקופת תיוג לאחר assay phagocytosis 32,10. לכן, מניות הגדולות אלה מאפשרים לשחזור וקלות שימוש בסוגים רבים ושונים של ניסויים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

ניתוח של אחד מתפקידיה החיוניים של אפיתל של רשתית פיגמנט (RPE) תאים, phagocytosis של שברי דיסטלי גילאים בילו של מגזרים חיצוניים קולטי אור (POS) יכול להתבצע במבחנה. מגזרים חיצוניים קולטי אור עם ערימות של דיסקים קרומיים המכילים את מכונות phototransduction מתחדשות ללא הרף ברשתית. POS בילה בוטלו מדי יום על ידי תאי RPE. מכרסמים חזירי / שור ותאי RPE אנושיים, להכיר POS ממינים שונים באופן דומה. כדי להקל על ביצוע סדרה גדולה של ניסויים עם שונות קטנות, מלאי גדול של קופה יכולה להיות מבודד מעיניים חזיריות ומאוחסן קפוא בaliquots. פרוטוקול זה מנצל את המאפיין של photopigments המציג צבע כתום כאשר כל הזמן בחושך. תחת אור אדום עמום, רשתיות נאספים במאגר מeyecups פתח לחתוך בחצי. ההשעיה תא הרשתית הומוגני, מסונן והועמסה על שיפוע סוכרוז רציף. לאחר CENtrifugation, POS נמצא בלהקה בדידה בחלק העליון של השיפוע שיש לו צבע כתום אופייני. POS נאסף אז, הסתובב, resuspended ברצף במאגרים לשטוף, נספר וaliquoted. קופה השיגה בדרך זו יכולה לשמש למבחני phagocytosis וניתוח של הפעלת חלבון, לוקליזציה או אינטראקציה בזמנים שונים לאחר אתגר POS. לחלופין, POS יכול להיות מתויג עם fluorophores, דואר. G., FITC, לפני aliquoting לכימות שלאחר מכן הקרינה של POS מחייב או בליעה. יישומים אפשריים נוספים כוללים שימוש באתגר קופה או קופה שונה בשילוב עם תנאי לחץ כדי לחקור את ההשפעה של סטרס חמצוני או הזדקנות על תאי RPE.

השילוב של השיפוע סוכרוז ליניארי וultracentrifugation מאפשר ההפרדה של המרכיבים השונים של ההשעיה הרשתית על ידי צפיפות. תאי פסולת ורשתית רשתית גדולים יותר כבדים לשקוע או קרוב לתחתית של השיפוע (איור 2 א). קופה קלה יותר וקלים יותר תאים בודדים או פסולת תא מהרשתית להעביר להק?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Video: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

דור של Lymphocytic microparticles וזיהוי של Proapoptotic השפיעו על תאי אפיתל Airway

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...