وأيد هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية للبحوث (ناطقون Chercheuses / ناطقون Chercheurs إلى EFN)، مؤسسة VOIR آخرون التورية ومؤسسة بيتنكور Schueller (المنح يونغ محقق لEFN)، المركز الوطني للبحث العلمي (CNRS، موقف دائم للEFN) ، ومعهد العين الوطني من المعاهد الوطنية للصحة (R01-EY13295 إلى SCF). بالإضافة إلى ذلك، يتم تمويل معهد دي لا الرؤية من قبل المعهد الوطني للسانتيه آخرون للبحوث ميديكال، جامعة بيير وماري كوري-باريس 6، المركز الوطني للبحث العلمي وزارة باريس.

هذه التجربة العزلة POS وقتا طويلا وتتطلب قد تصل إلى 12 ساعة لإكمال إذا وصفت POS قبل التخزين. وقد تم تكييف البروتوكول من ورقة نشرتها RS Molday وزملاؤه في عام 1987 31 و تعديلها من قبل SC Finnemann وزملاؤه في عام 1997 10. وقد تم التعامل مع الحيوانات وفقا للجمعية للبحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية. تم استعراض البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات داروين تشارلز من جامعة بيير وماري كوري-باريس 06 واللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة فوردهام. 1. عامة تعيين لأعلى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على 80 خنزير أو بقرة عيون جديدة طازجة بمجرد بعد الذبح ممكن والاحتفاظ بها مبردة في الظلام. تقديم الإرشادات لمقدم وبالتالي فإن الشركة تشرع بنفس الطريقة. تم تحسين هذا البروتوكول لمدة 80 العينين. إلىالمضي قدما في المزيد من عيون والحصول على أسهم أكبر (على سبيل المثال، من 160 العينين)، مضاعفة كميات حل وأداء 2 جولات من تنبيذ فائق. عينات تجمع في وقت لاحق في خطوة جمع (راجع الخطوة 2.2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد على مقاعد البدلاء المصباح safelight الأحمر، ومنصات ماصة، وتقضي (الجدول المواد). إعداد أطباق 15 سم وأكياس واقية لجمع النفايات (أجزاء العين غير المستخدمة، زجاجي ...). ارتداء ضيقة labcoat، والقفازات، حماة كم ونظارات واقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتياطات: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البرد جميع الحلول ثم الاحتفاظ بها البرد خلال كل الخطوات. إبقاء العينين والتدرجات المبردة على الجليد قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء العينين والأنسجة المشتقة في الظلام قدر الإمكان حتى الخطوة جمع بعد تنبيذ فائق لتجنب photobleaching من الأصباغ البصرية وفقدان اللون البرتقالي الوردي من النموذج النشط من photopigments. </li></ol></li></ol> 2. تطبيقات بروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول والتدرجات: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأسهم التورين ذوبان الجليد تماما يستخدم حمام الماء 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جميع الحلول من الحلول الأسهم (الجدول 1، الحلول المالية) وتخلط جيدا السكروز مع المكونات الأخرى باستخدام محرك مغناطيسي لكل حل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 15 مل من محلول تجانس لتركيز النهائي من 20٪ سكروز، تريس 20 ملم pH7.2 خلات، 2 مم MgCl 2 و 10 ملي الجلوكوز و 5 ملي التورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول السكروز 25٪ إلى تركيز النهائي من 25٪ سكروز (باستخدام الأسهم السكروز 70٪)، و 20 ملي خلات تريس درجة الحموضة 7.2، 10 ملي الجلوكوز و 5 ملي التورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول السكروز 60٪ إلى تركيز النهائي من 60٪ سكروز (باستخدام مسحوق السكروز)، تريس 20 ملم pH7.2 خلات، الجلوكوز 10 ملم و 5 ملي التورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل غسل 1 إلى تركيز النهائي من 20 ملي خلات تريس درجة الحموضة 7.2 و 5 ملي التورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل غسل 2إلى تركيز النهائي من 10٪ سكروز، 20 ملي خلات تريس درجة الحموضة 7.2 و 5 ملي التورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل غسل 3 إلى تركيز النهائي من 10٪ سكروز، 20 ملي فوسفات الصوديوم الهيدروجيني 7.2 و 5 ملي التورين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثابت صانع التدرج على محرك مغناطيسي وإدراج شريط ضجة في الغرفة الأقرب للخروج حيث سيتم إدراج حل 60٪. استخدام قطع P200 طرف الماصة وضعها في الخروج من الأنابيب لتحقيق سرعة الصب المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلقي التدرجات الخطية بدقة عن طريق تمييع واثارة الحل السكروز 60٪ مع 25٪ في واحد باستخدام 12 مل من كل حل (أي مجموع 6 أنابيب لل80 العينين) في أنابيب نابذة فائقة السرعة قبل المبردة. تحريك تمييع تدريجيا 60٪ محلول السكروز بشكل جيد. ثابت سرعة تدفق التدرج، وسكب الحل بسلاسة وليس بسرعة كبيرة. ملاحظة: من أجل الحصول على المستمر، الانحدار الخطي، والحفاظ على افتتاح طرف الماصة الحق على السطح من الحل لالتشكل التدرج بأكملهن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للالتدرجات الجلوس على الجليد لمدة حوالي 1 ساعة لتحقيق الاستقرار. إبقاء التدرجات المبردة حتى تحميلها. لا يهز أنابيب لمنع الفوضى من التدرج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأنسجة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأنسجة تحت ضوء أحمر خافت. تأخذ العين في يد واحدة وكزة الجبهة مع حافة شفرة حلاقة في حين الضغط على العين بعيدا (لتجنب الرش، الشكل 1). استخدام شفرة حلاقة لخفض مقلة العين الأمامية إلى 2 نصفين (القرنية بالإضافة إلى 5 مم على الأقل في الصلبة). إزالة العدسة والوجه فنجان العين الداخل الى الخارج بحيث يمكن عقد على مدى غيض من إصبع واحد وبالتالي تعريض شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام شفرة حلاقة في زاوية، وكشط بلطف شبكية العين، فصل بسهولة وتظهر على شكل طبقة وردي، قبالة سطح بساط وقطع على رأس العصب البصري (الشكل 1). جمع كل شبكية العين في 2 × 50 مل أنابيب تحتوي كل منها على 15 مل من محلول التجانس على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وطي الشبكيةgenization: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز تعليق بقوة باليد لمدة 2 دقيقة من أجل تعطيل طبقات مختلفة من الخلايا، وكسر POS قبالة بقية الخلية PR، جزء POS والتجانس تعليق شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح 3X من خلال طبقة مزدوجة من الشاش النظيف لإزالة شظايا الأنسجة الكبيرة وجمع من خلال تدفق في نظيفة 50 مل أنابيب (الشكل 1). تعليق الشبكية يجري سميكة جدا، لتعظيم العائد، اضغط بلطف على شاش للافراج عن الأنسجة مجزأة المتبقية بعد كل الترشيح. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبصرة الخارجي جزء جزء (POS) العزلة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف شبكية العين الإعدادية الخام، حوالي 6-7 مل لكل أنبوب، أكثر من 6 × 30 مل أنابيب نابذة فائقة السرعة تحتوي كل منها على 24 مل من الطازجة المبردة المستمر 25 - 60٪ السكروز التدرج (الشكل 1). موازنة أنابيب معارضة بما يتناسب مع الدوار لاستخدامها. نابذة فائقة السرعة في 106،000 x ج لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أكثر من حل فوق الفرقة البرتقالي الوردي في الثلث العلوي من التدرج بواسطة الشفط (الشكل 2A). جمع الفرقة البرتقالي الوردي مع قطع P1000 طرف في كوب. تجاهل الباقي بعد تحييد استخدام التبييض (النفايات البيولوجية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع مع ~ 4-5 كميات من الجليد الباردة غسل 1 الحل. فصل في العديد من 30 مل أنابيب حسب الحاجة. الطرد المركزي في 3،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل بعناية طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات resuspend في 10 مل غسل 2 حل وتدور في 3،000 x ج لمدة 10 دقيقة على النحو المفصل أعلاه. الكريات resuspend في 15 مل غسل 3 وتدور مرة أخرى في 3،000 x ج لمدة 10 دقيقة. الجمع بين الايقاف من عدة الكريات للحد من عدد من الأنابيب اللازمة قبل الطرد المركزي في غسل 2 و 3 اغسل الحلول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> POS aliquoting دون وضع العلامات: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend POS في 10-20 مل DMEM. Predilute 10 ميكرولتر في 490 DMEM ميكرولتر (01:50) والعد ممدود وكذلك POS هامت فيغرفة الفرز الخلية (الشكل 2B). حساب المحصول والتركيز في جزيئات POS لكل مليلتر. ملاحظة: يختلف العائد، وهذا يتوقف في الغالب على سن وسلالة من الخنازير / الأبقار وحجم العينين، على سبيل المثال، التحضير الجيد يتراوح بين 5 - 8 عيون × 10 9 POS من 80 خنزير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قرار بشأن حجم DMEM النهائي (عادة 10-20 مل)، وإضافة السكروز أن تسفر عن تركيز النهائي من 2.5٪ سكروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد aliquots من الحجم المطلوب، على سبيل المثال، 5 × 10 7 نقاط البيع في أنبوب لحجم إعادة تعليق 2 مل لإجراء تجربة 96-جيدا في 40 ميكرولتر / جيد. تدور 1 قسامة لمدة 5 دقائق عند 2،300 x ج في RT وتقييم حجم بيليه. إعداد الأحجام قسامة مختلفة لحجم الطلب المختلفة ونقاط البيع يجب أن لا يتم تجميد وإذابة مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد مأخوذة POS في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. ملاحظة: مأخوذة مستقرة لعدة شهور. في أيدينا، الخالي من الملصقات أو المسمى POS يمكن تخزينها لمدة سنة واحدة على الأقل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العلامات POS وaliquoting: ملاحظة: نحن عادة استخدام FITC لتسمية POS لالكمي لفحوصات البلعمة، ولكن يمكن استخدام الأصباغ الأخرى كذلك تبعا للاحتياجات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend 1 10 ملغ FITC قارورة في 2.5 ملغ / مل تركيز في 0.1 M نا عازلة كربونات درجة الحموضة 9.5 عن طريق خلط 2.6 مل 0.1 M NaHCO 3 درجة الحموضة 8.4 مع 1.4 مل 0.1 M نا 2 CO 3 درجة الحموضة 11.5 (الجدول 2، الحلول المالية). تناوب لمدة 1 ساعة على RT مع حماية من الضوء وتدور لمدة 5 دقائق على السرعة القصوى لتكوير المواد الصلبة FITC غير معلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية POS في 10 مل من غسل 3 حل (أو DMEM) وإضافة 2 مل من محلول FITC 80 العينين. تخزين FITC بقايا المجمدة في -80 ° C. تدوير للا يقل عن 1.5 ساعة على RT. يحفظ بعيدا عن الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل POS المسمى مرتين باستخدام غسل 3 الحل كما هو موضح في القسم 2.3.4، ثم مرة واحدة أو مرتين في DMEM حتى يكاد لا ينظر مجانا FITC في و طافraction. في resuspend POS في DMEM والمضي قدما على النحو للPOS الخالي من الملصقات لالعد وaliquoting (القسم 2.4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن طريق نقاط البيع في التجارب: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> POS ذوبان الجليد في RT، والاحتفاظ بها في الظلام قدر الإمكان إذا كانت Fluorescently المسمى. تدور لمدة 5 دقائق عند 2،300 x ج في RT. نضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend فورا في حجم مناسب من حل الفحص وفقا لما تمليه التجربة. في حالة أوقات مختلفة من التحدي POS، معلق متجر POS في RT في الظلام بين نقاط الوقت لعدة ساعات. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

ثلاث خطوات أو شروط حاسمة لتنقية الأمثل: نوعية الصب التدرج وحساسة أنابيب التدرج التلاعب، وحفظ الأنسجة المبردة وفي الظلام حتى الخطوة جمع وقوة اهتزاز الخليط الشبكية للحصول على العزلة POS المناسبة من بقية PR الخلية. إذا ظهرت بعض القضايا في رؤية الفرقة البرتقال بشكل صحيح، ?...

في شبكية العين، يتم تشغيل الرؤية من خلال المماكبة من الجزيئات حساس يسمى opsins، قبل أن يتم تحويلها إلى إشارة التي يمكن أن تنتقل بين الخلايا العصبية تصل إلى المناطق البصرية في المخ. هي جزء لا يتجزأ هذه الجزيئات في أكوام من الأقراص غشائي تشبه الفطائر التي تشكل أجزاء الجزء الخارجي من خلايا مستقبلة للضوء (PRS). التعرض للالتعرض المستمر للضوء وبالتالي مستويات كبيرة من الإجهاد التأكسدي، المستفيدين الرئيسيين تجديد مستمر فئتها الخارجية للحد من الضرر التأكسدي المحتملين. مبصرة شرائح الخارجي هي على اتصال وثيق مع زغيبات قمية من شبكية العين الصباغ الظهارية (RPE) الخلايا المجاورة. تشكل الخلايا RPE الجزء الخارجي من الجدار الدم في شبكية العين وتضمن العديد من المهام التي تعتبر حاسمة بالنسبة لصحة خلايا مستقبلة للضوء وظيفة 1، مثل التبريد أشعة الضوء عبر أصباغ الميلانين، وإعادة المماكبة للphotoreactive الشبكية المكون أوبسين، وتوفير المواد الغذائية وزrowth العوامل، والمشاركة في التخلص PR الأيض. وبالإضافة إلى ذلك، والقضاء على الخلايا RPE قضى POS وإعادة تدوير مكوناتها، وهو الاحتلال اليومي الذي ينظمه إيقاع الساعة البيولوجية في شبكية العين الثدييات 2،3. تخليص سقيفة POS ضروري جدا من أجل البقاء PR. عندما يتم إلغاؤها تماما، POS الحطام تتراكم وتتحول المستفيدين الرئيسيين مما تسبب السريع فقدان الرؤية 4،5. في حالة فقدان الملف الشخصى الإيقاعي ويحل محله النشاط المستمر، والعيوب العلاقات العامة وRPE تتراكم مع تقدم العمر 6. ولذلك، فمن المهم جدا أن تميز التنظيم الجزيئي للRPE البلعمة في المختبر من أجل فهم الظواهر مرتبطة الخلل فيها. ومن المثير للاهتمام، والآلات الجزيئية في الخلايا RPE هي مشابهة جدا لتلك المستخدمة من قبل الضامة لمسح الخلايا أفكارك وكلاهما يعتمد على الاعتراف فسفاتيديل تعرض على الحطام أكلة 7-9. لا يزال، والخلايا RPE والضامة تنظم درجة الحموضةagocytosis بشكل مختلف، كما الضامة يختار القضاء الفوري على الخلايا أفكارك في وقت اللقاء في حين أن الخلايا RPE تبتلع بشكل متوازن POS مرة واحدة فقط في اليوم على الرغم من الاتصال بهم الدائم مع شرائح الخارجي. وهذا يشير إلى آليات التنظيم المحددة التي لا تزال غير مفهومة تماما. وقد تم تحديد العديد من الجزيئات المتورطين في الآلات RPE أكلة أو التحقق من صحتها وذلك بفضل استخدام POS معزولة وثقافة الخلية المقايسات البلعمة. مستقبلات alphavbeta5 إنتغرين تقع في RPE سطح الخلية القمية، وذلك بالتنسيق مع يجند لها مبدعين-E8، يربط خصيصا لPOS 10-12، والتي يتم المنضوية عبر MerTK التيروزين كيناز مستقبلات 13-15. وقد تبين أن زبال مستقبلات CD36 للمشاركة في تناول POS والتأثير سرعته 16،17، ويمكن أن تكون بمثابة جهاز استشعار من الدهون الفوسفاتية أكسدة على السطح POS 18. تدخيل يحتاج تجنيد F-أكتين الهيكل الخلوي الحمارالبروتينات ociated مثل annexin 2 19، الميوسين II 20 وميوسين السابع-أ 21،22. وتستخدم POS الأصلي أو تتأكسد في المختبر أيضا لفهم الظواهر شيخوخة الخلايا RPE في الجسم الحي مرتبطة تراكم سيئة هضمها POS أكسدة 23-28. وقد بدأ جيل من الخلايا RPE المستمدة من الخلايا الجذعية تطبيق جديد لPOS معزولة التي تستخدم لإثبات ظائف الخلايا قبل أن تنقل إلى الحيوانات أو المرضى 29،30،27. وصف لأول مرة من قبل Molday وزملاؤه في عام 1987 31، وبروتوكول لعزل POS البقري يجمع خطوة تنبيذ فائق من الخليط الشبكية على التدرجات السكروز مستمرة مع ملاحظة ظهور اللون البرتقالي المميز للصباغ متبدل بالضوء في الشبكية غير مقصور (تحمل 11- الشبكية CIS). في السنوات ال 10 الماضية، وذلك بسبب الاحتياطات المتخذة من أجل تقليل خطر مرض جنون البقر، أصبح استخدام عيون الخنزير increasiأبرز ngly. بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيفية الحصول على كميات كبيرة من POS من الخنازير أو عيون البقر التي يمكن aliquoted وتخزينها لفترات طويلة من الزمن. هذا يلغي الحاجة إلى إعداد POS من أعين القوارض، الأمر الذي يتطلب استخدام عدد كبير من الحيوانات في إعداد POS وفحص 32،33،21،22. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إعطاء تفاصيل عن وضع العلامات POS قبل التخزين باستخدام جزيئات الفلورسنت، لتحديد وتصور POS بطريقة مبسطة وقابلة للمقارنة لبعض التطبيقات مقارنة مع وضع العلامات POS بعد الفحص البلعمة 32،10. لذلك، هذه مخزونات كبيرة تسمح للاستنساخ وسهولة الاستخدام في العديد من أنواع مختلفة من التجارب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

تحليل واحدة من الوظائف الحيوية للشبكية العين الظهارية الصباغ (RPE) خلايا، والبلعمة من قضى شظايا البعيدة هرمة مبصرة شرائح الخارجية (POS) لا يمكن أن يؤديها في المختبر. مبصرة شرائح الخارجي مع أكوام من أقراص غشائي تحتوي على ماكينات phototransduction تتجدد باستمرار في شبكية العين. يتم استبعاد POS أمضى يوميا من قبل خلايا RPE. القوارض، الخنازير / البقري والخلايا RPE الإنسان تعترف POS من مختلف الأنواع بطريقة مماثلة. لتسهيل أداء سلسلة كبيرة من التجارب مع تقلب قليلا، ومخزون كبير من نقاط البيع يمكن عزلها عن عيون الخنزير وتخزينها المجمدة في مأخوذة. هذا البروتوكول يستفيد من خاصية photopigments يتم عرضها على اللون البرتقالي عندما أبقى في الظلام. تحت ضوء أحمر خافت، يتم جمع الشبكية في منطقة عازلة من eyecups افتتح في قطع نصفين. والمتجانس تعليق خلية شبكية العين وتصفيتها وتحميلها على التدرج السكروز المستمر. بعد CENtrifugation، POS تقع في نطاق منفصلة في الجزء العلوي من التدرج الذي يحتوي على لون برتقالي مميز. ثم يتم جمع نقاط البيع، نسج، معلق بالتتابع في مخازن غسل، وعدها aliquoted. POS التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لفحوصات البلعمة وتحليل تفعيل البروتين، وتوطين أو التفاعل في أوقات مختلفة بعد التحدي POS. بدلا من ذلك، POS يمكن المسمى مع fluorophores، والبريد. ز.، FITC، قبل aliquoting لالكمي مضان لاحق من POS ملزمة أو الغمر. وتشمل التطبيقات الممكنة الأخرى استخدام تعديل POS أو POS التحدي جنبا إلى جنب مع ظروف الإجهاد لدراسة تأثير الإجهاد التأكسدي أو الشيخوخة على خلايا RPE.

مزيج من الانحدار الخطي السكروز وتنبيذ فائق يسمح للفصل المكونات المختلفة من تعليق الشبكية التي كتبها الكثافة. خلايا الحطام وRPE أكبر الشبكية الثقيلة تغرق أو بالقرب من أسفل التدرج (الشكل 2A). أخف وزنا POS والخلايا الفردية أخف وزنا أو الحطام خلية من الشبكية تهاجر ا...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

واسع النطاق تنقية لحم الخنزير أو البقر مبصرة الخارجي قطاعات للالبلعمة فحوصات على خلايا الشبكية صبغات الظهارية

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Video: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

جيل من الليمفاوي المجهرية الدقيقة وكشف لهم تأثير Proapoptotic على الخلايا الظهارية مجرى الهواء

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

البلعمة فحص الخلايا الخلوية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

القائم على التدفق الصفحي فحوصات للتحقيق في تجنيد الكريات البيض على خلايا الأوعية الدموية مثقف والصفائح الدموية ملتصقة

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

عزل الخلايا الظهارية اللعابية من الغدد اللعابية البشرية للنمو في المختبر كما ساليسفيرس أو الطبقات الأحادية

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...