This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.

הערה: הבחירה של חומר מוצא עלה וסטנדרטיזציה של תנאי גידול צמחים היא קריטית כגורמים אלה יכולים להשפיע על האיכות, השתנות ותשואה של AWF (איור 1) באופן משמעותי. פרמטרים לשקול מוצגים בלוח 1 והם דנו בפירוט רב יותר בדיון. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פרמטר </td><td colspan="3"> standardizations דוגמא </td></tr><tr><td></td><td> vulgaris Phaseolus </td><td> Solanum lycopersicum </td><td> thaliana ארבידופסיס </td></tr><tr><td> טיפוס עלה </td><td> עלים אמיתיים הראשונים, הרחיבו באופן מלא, בריא </td><td> עלים 2 nd ו-3 מתחילים מלמטה, 4 עלונים הגדולים ביותר שצולמו עלון הפסגה אינו משמש להפקת אפופלסט </td><td> עלים שושנה הרחיבו באופן מלא </td></tr><tr><td> גיל צמח </td><td> 21 ימים </td><td> 7-9 שבועות </tד&gt; <td> 7 שבועות </td></tr><tr><td> שעה ביום </td><td> אמצע תקופת אור (12:00) </td><td> אמצע תקופת אור (12:00) </td><td> אמצע תקופת אור (12:00) </td></tr><tr><td> הידרציה </td><td> כל הצמחים שהושקו 1 שעה לפני קציר גם </td><td> כל הצמחים שהושקו 1 שעה לפני קציר גם </td><td> כל הצמחים שהושקו 1 שעה לפני קציר גם </td></tr><tr><td> אור </td><td> 16 שעות אור, 400 מ &#39;μmol -2 שניות -1 </td><td> 16 שעות אור, 400 מ &#39;μmol -2 שניות -1 </td><td> 10 שעות אור (יום קצר) משבוע 2, 400 מ &#39;μmol -2 שניות -1 </td></tr><tr><td> לחות </td><td> 70% </td><td> 70% </td><td> 70% </td></tr><tr><td> טמפרטורה </td><td> אור C ° 22, 18 ° C כהה </td><td> אור C ° 22, 18 ° C כהה </td><td> 21 ° C </td></tr></tbody></table> 1. דוגמאות שולחן של parame הסטנדרטיters לעלים משמשים בעקירות AWF. נוזל כביסה 1. יצירת אפופלסט הערה: במהלך materila מסוכן פרוטוקול זה inculding פתוגנים חיידקים מעלים נגועים לא צריכה להיות נשטפת לביוב; יש להשתמש בנהלי רשות ולא ראויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מכשירים הבוסס על גודל עלה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור עלים קטנים יותר (למשל, ארבידופסיס, שעועית) באמצעות מזרק מחטים. השתמש בבקבוק ואקום לחדור עלים כי הם גדולים מדי כדי להתאים במזרק. השתמש בשיטת בקבוק הוואקום לחדור עלים מרובים בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק עלים כי הם גדולים מדי לשיטת החדירה זמינה לחלקים קטנים יותר באמצעות סכין גילוח. חלקי עלה לשטוף ביסודיות לחתוך במים מזוקקים לפני הסתננות להסרת מזהמי cytoplasmic שלהפריש מהתאים פגועים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדירה ליף באמצעות מזרק 60 מיליליטר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את העלה ממפעל בפטוטרת באמצעות סכין גילוח. לעלי מתחם כגון עגבניות, לנתק את העלונים בpetiolule. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העלים טריים נכרת על ידי טבילה במים מזוקקים להסרת מזהמי משטח עלה. ייבש את העלים בעדינות על ידי סופג עם רקמה או נייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשקל עלה לפני החדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלגלים בזהירות ו / או לקפל את העלה לתוך מזרק 60 מ&quot;ל ולמלא את המזרק עם מים מזוקקים (ניתן להשתמש בנוזלי חדירה אחרים, ראו דיון). הוצא את כל אוויר שבתוך המזרק תוך הפחתת הבוכנה לכ סימן 40 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את קצה המזרק עם או אצבע עטויה בכפפה או חתיכת Parafilm, ולאחר מכן ליצור לחץ שלילי בתוך המזרק ידי משיכת הבוכנה כלפי חוץ כדי סימן 60 מיליליטר. לאט לאט לשחרר את הבוכנה. הערה: מהירות שחרור הלחץ עלול לגרום לתמוגה תא וזיהום cytoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את קצה המזרק ולהוציא את כל אוויר, אז replug הקצה והעיתונותמטה נוסף על הבוכנה כדי ליצור סכום צנוע של לחץ חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.2.5 - 1.2.6 עד העלה הוא שחדר באופן מלא, כפי שניתן לראות בצבע הכהה של האזורים שחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העלים מהמזרק. בעדינות אך ביסודיות למחוק את העלה עם נייר סופג כדי להסיר נוזל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשקל של העלה שחדר. חשב את ההבדל במשקל לפני ואחרי החדירה שמדמה את חדירת הנפח מקרוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלה חדירת בקבוק ואקום: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את העלה מהמפעל בפטוטרת באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העלים טריים נכרת על ידי טבילה במים מזוקקים להסרת מזהמי משטח עלה. ייבש את העלים בעדינות על ידי סופג בנייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשקל עלה לפני החדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העלה (או משאיר אם חדירת עלים מרובים) בשיתוף בקבוק זרוע 250 מיליליטר או גדולים יותר בצדntaining מים מזוקקים (ניתן להשתמש בנוזלי חדירה אחרים, ראו דיון). באופן מלא לכסות את העלים עם הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת ואקום לבקבוק. בעדינות להתסיס כדי לשחרר את בועות האוויר מהעלים. לאט ובזהירות לשחרר את הוואקום. הערה: מהירות שחרור הוואקום עלולה לגרום תמוגה תא וזיהום cytoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.3.5 עד העלה הוא שחדר באופן מלא, כפי שניתן לראות בצבע הכהה של האזורים שחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העלים מהבקבוק. בעדינות אך ביסודיות למחוק את העלה עם נייר סופג כדי להסיר נוזל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשקל של העלה שחדר. חשב את ההבדל במשקל לפני ואחרי החדירה שמדמה את חדירת הנפח מקרוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור של AWF ידי צנטריפוגה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העלה על פיסת 4 אינץ &#39;(10 סנטימטרים) Parafilm הרחב. באמצעות קצה פיפטה 5 מיליליטר (או אובייקט בגודל דומה),להפשיל את העלה בתוך Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את העלה מגולגל עם קצה פיפטה לתוך מזרק 20 מיליליטר. מקם כל קצות עלים חתוכים כלפי מעלה. הכנס את המזרק לתוך צינור פוליאתילן או פוליקרבונט 50 מיליליטר נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המזרק בתוך הצינור למשך 10 דקות XG ב 1000 בהרוטור דלי מתנדנד על 4 מעלות צלזיוס. הערה: בדיקה חזותית של העלים הבאים צנטריפוגה צריכה לחשוף כי הרוב המכריע של נוזל החדירה כבר גורש. כתמים ירוקים כהים מצביעים על כך שנדרש זמן נוסף צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה AWF התאושש לתוך צינורות 1.5 מיליליטר טריים. הערה: הנפח של AWF צריך כ להתאים את חדירת הנפח לעלה ש; אם הנפח הוא פחות זמן צנטריפוגה נוסף או נדרשת מהירות צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות AWF ב 15,000 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את כל תאים או חלקיקים. לחלופין, להעביר את AWF דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לרםve תאים וחומר חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה supernatant לתוך צינור טרי. שמור על דגימות קרח עד אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את דגימות AWF ב -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. מבחני לcytoplasmic זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את דגימות AWF על קרח כדי למזער את התגובות אנזימטיות (למשל, proteolysis) ולבצע את מבחני מייד לאחר צעדי צנטריפוגה הם מוחלט. הערה: למבחני המטבוליט, דגימות יכולות להיות קפוא מייד לאחר חילוץ ומאוחסנות ב -80 ° C עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לdehydrogenase malate סטנדרטי (MDH) פרוטוקול assay לראות 15; אחרת השתמש בערכת assay MDH זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לdehydrogenase גלוקוז-6-פוספט הסטנדרטי (G6PDH) פרוטוקול assay לראות 16; אחרת השתמש בערכת assay G6PDH זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכימות של מטבוליטים cytoplasmic כגון גלוקוז-6-פוספט (G-6-P) להשתמש GC-MS כפי שתואר בשלב 5 </strong&gt;. אחרת, השתמש בערכה זמינה מסחרי עבור assay הישיר של G-6-P. </li></ol> 3. חישוב אפופלסט דילול פקטור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני כרכים של נוזל החדירה בשימוש מעל בשלב 1.2.4 או 1.3.4 (למשל מים מזוקקים,). להוסיף אבקה ארגמן אינדיגו לפתרון אחד לריכוז סופי של 50 מיקרומטר, תוסיף דבר לאחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה ב 610 ננומטר (OD 610) של 200 μl של פתרון החדירה ארגמן אינדיגו עם קורא צלחת. תקן ערך זה על ידי הפחתת OD 610 של 200 μl של פתרון חדירה ללא ארגמן אינדיגו. להחליף ערך תיקן את זה כOD 610infiltrate למשוואה להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע לפחות שלוש חדירות עלה לשכפל כאמור לעיל (שלב 1.2 או 1.3) עם פתרונות החדירה שניהם (עם ובלי ארגמן אינדיגו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החדירה, rinse העלים במים מזוקקים כדי להסיר כל נוכחים ארגמן אינדיגו שנותרו על המשטחים החיצוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בצנטריפוגה כאמור לעיל (שלב 1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את OD הממוצע 610 של 200 μl של עקירות AWF ארגמן אינדיגו. תקן ערך זה על ידי הפחתת OD 610 הערך הממוצע של 200 μl של AWF החופשי ארגמן אינדיגו. להחליף ערך תיקן את זה כOD 610AWF למשוואה להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הגורם לדילול (כלומר, לקפל דילול) מערכי הספיגה תיקנו כ: גורם לדילול אפופלסט = OD 610infiltrate / (610infiltrate OD - OD 610AWF) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערכי ריכוז או פעילות כפל מAWF על ידי גורם הדילול להעריך את הריכוז / פעילות בנוזל apoplastic בPlanta. </li></ol> 4. ריכוז של AWF לחוזק מלא על ידי ייבוש בהקפאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ההקפאה-היבש וllow זה להתייצב בטמפרטורה ובלחץ העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה את הכמות הרצויה של דגימות AWF טריות או מאוחסנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ את הדגימות באופן שווה בין 2 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכינון מחדש נפח: הכינון מחדש נפח = נפח לפני גורם לדילול ייבוש בהקפאה / אפופלסט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המכסים סגורים, להקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הצינורות קפואים לכלי הקפאת ייבוש מצוננים אחד או יותר. בעת העברת הצינורות, להחליף את המכסה עם אחד שכבר נקב באמצעות חפצים חדים כדי לאפשר חילוף גזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את כלי להקפאה-היבש וLyophilize הדגימות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגימות מהמכונה ולגבש מחדש את AWF על ידי הוספת הכמות המחושבת של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את מכסה unpierced ולאחסן הדגימות ב -80 ° C. </li></ol> 5. המטבוליט ניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסת 17 &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl פיפטה של ​​AWF לתוך צינור 1.5 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 μl של מתנול המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר ribitol כסטנדרט פנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 11,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 700 μl של supernatant לצינור 1.5 מיליליטר טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 375 μl של כלורופורם ומערבולת קרים במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של DH 2 O ו מערבולת למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 2200 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 150 μl של השכבה העליונה המימית לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש, ולאחר מכן לייבש את הדגימות לחלוטין ברכז ואקום ללא חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הדגימות ב -30 μl של פירידין המכילות 20 מ&quot;ג / מיליליטר hydrochloride methoxyamine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 70 מעלות צלזיוס בזמן טלטול נמרץ לשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של MSTFA (trifluoroacetamide N-methyl-N- (trimethylsilyl)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס בזמן הרעד במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות לGC-MS compצלוחיות זכוכית atible. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח GC-MS של הדגימות. עיין Lisec et al. 2009 17, לפרטים על התקנת ציוד GC-MS וביצועים. </li></ol>

<ol>
	<li>Felle, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+pH+during+low-oxygen+stress+in+barley.">Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley.</a> Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).</li><li>Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-M&#252;ller, J., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arbuscular+mycorrhization+by+apoplastic+invertases:+enhanced+invertase+activity+in+the+leaf+apoplast+affects+the+symbiotic+interaction.">Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction.</a> The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).</li><li>Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transpiration+rate.+An+important+factor+controlling+the+sucrose+content+of+the+guard+cell+apoplast+of+broad+bean.">Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean.</a> Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).</li><li>Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+the+plant+apoplast+by+plant+pathogenic+bacteria.">Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria.</a> Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).</li><li>Rico, A., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+uses+constitutive+and+apoplast-induced+nutrient+assimilation+pathways+to+catabolize+nutrients+that+are+abundant+in+the+tomato+apoplast.">Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).</li><li>Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nutrient+supply+of+pathogenic+fungi;+a+fertile+field+for+study.">The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study.</a> Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).</li><li>Brunner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+plants+and+animals:+emerging+parallels+between+the+recognition+of+general+elicitors+and+pathogen-associated+molecular+patterns.">Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).</li><li>Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+leaf+scald+(Xanthomonas+albilineans)+on+polyamine+and+phenolic+acid+metabolism+of+two+sugarcane+cultivars.">Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars.</a> European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).</li><li>Mill&#225;n, A. F., Morales, F., Abad&#237;a, A., Abad&#237;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+iron+deficiency+on+the+composition+of+the+leaf+apoplastic+fluid+and+xylem+sap+in+sugar+beet.+Implications+for+iron+and+carbon+transport.">Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport.</a> Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).</li><li>Dragi&#353;i&#263; Maksimovi&#263;, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filter+strip+as+a+method+of+choice+for+apoplastic+fluid+extraction+from+maize+roots.">Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots.</a> Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).</li><li>Baker, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+standard+technique+for+improved+quantitative+analysis+of+apoplastic+metabolites+in+tomato+leaves.">An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).</li><li>Nouchi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+difficulties+in+collecting+apoplastic+fluid+from+rice+leaves+by+the+infiltration-centrifugation+method.">Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).</li><li>Boudart, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+proteins+in+apoplastic+fluids+of+Arabidopsis+thaliana+rosettes:+identification+by+mass+spectrometry+and+bioinformatics.">Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics.</a> Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).</li><li>Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+infiltration-centrifugation+technique+appropriate+for+the+isolation+of+apoplastic+fluid?+A+critical+evaluation+with+different+plant+species.">Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species.</a> Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).</li><li>Bergmeyer, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malate+Dehydrogenase.">Malate Dehydrogenase.</a> Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).</li><li>Lohr, G. W., Waller, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+Dehydrogenase.">Glucose-6-phosphate Dehydrogenase.</a> Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).</li><li>Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatography+mass+spectrometry-based+metabolite+profiling+in+plants.">Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants.</a> Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).</li><li>Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+and+bound+apoplastic+activity+for+peroxidase,+beta-d-glucosidase,+malate+dehydrogenase,+and+nonspecific+arylesterase,+in+barley+(Hordeum+vulgare+L.)+and+oat+(Avena+sativa+L.)+primary+leaves.">Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves.</a> Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).</li><li>Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+tobacco+leaf+apoplast+proteome+in+response+to+salt+stress.">Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress.</a> Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).</li><li>Shabab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+effector+protein+AVR2+targets+diversifying+defense-related+Cys+proteases+of+tomato.">Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato.</a> Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).</li><li>Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutes+in+the+free+space+of+growing+stem+tissues.">Solutes in the free space of growing stem tissues.</a> Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).</li><li>Husted, S., Schjoerring, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+pH+and+ammonium+concentration+in+leaves+of+Brassica+napus.">Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus.</a> L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).</li><li>Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+converts+indigo+carmine+to+isatin+sulfonic+acid.">Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).</li><li>Bournonville, C. F. G., D&#237;az-Ricci, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+superoxide+in+plant+leaves+using+a+modified+NBT+staining+method.">Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method.</a> Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).</li><li>Speer, M., Kaiser, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+relations+of+symplastic+and+apoplastic+space+in+leaves+from+Spinacia+oleracea+L.+and+Pisum+sativum+L.+under+salinity.">Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity.</a> Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

אופטימיזציה של מקור רקמות הצמח וריאציה ביולוגית וטכנית יכולה להיות גדולה בעת ביצוע אפופלסט עקירות, ובכך זרימת עבודה סטנדרטית מאוד מועילה להגדיל המשכיות בניסויים (איור 1). חשוב לציין, המקור של רקמות צמח חייב להיות אחיד, כולל טיפוס עלה, גיל עלה, צמיחה / תנאים סביבתיים ושעה ביום (טבלת 1). הבדלים גדולים קיימים בקלות שבה עלים שונים הסתננו וAWF התאושש לאחר מכן על ידי צנטריפוגה; הבדלים אלה מתואמים עם מספר הפיוניות, גודל צמצם והתנגדות mesophyll 12,14. גם בקרב זנים שונים של פ vulgaris יש הבדלים גדולים בקלות ובתשואה של הליך מיצוי AWF; לעלי דוגמא למגוון Tendergreen משמש כאן הם נוחים יותר למיצוי AWF שימוש בשיטה זו מוונדר הזן הקנדי. בתוךפ vulgaris העלים האמיתיים הראשונים הם הגדולים ביותר והקלה ביותר לחדור, מה שהופך אותם הבחירה הברורה עבור עקירות apoplastic. Apoplastic האוויר ומים בנפח הוכח להשתנות עם גיל עלה בכמה מינים שמובילות להבדלים בextractability AWF 12,14. בפ vulgaris, העלים מבוגרים הפכו באופן משמעותי יותר קשה לחדור ותניב פחות AWF על צנטריפוגה; לכן עלים נקצרו כאשר הם הגיעו לרחבה מלאה. עלים שקשה לחדור לאחר מכן דורשים מהירויות גבוהות יותר צנטריפוגה להתאושש AWF. אחד ולכן צריך להקרין כמה סוגי עלים שונים וזנים בזהירות לפני שתחליט על מקור רקמה לעקירות AWF בקנה מידה גדולה. תנאי גידול צמחים גם חייבים להיות אחידים ככל האפשר במסגרת הניסוי. השימוש בארונות צמיחה עדיף מאחר שהם מאפשרים לחות עולה בקנה אחד, טמפרטורה וניהול תאורהגדודי עוצמת t להישמר. הקציר של עלים תמיד צריך להתרחש באותו הזמן של יום, כי הריכוזים של מטבוליטים, אנזימים, וכו &#39;משתנים לאורך המחזור 14 היומי. לבסוף, על מנת להבטיח כי המפעל משאיר לכולם יש לחץ turgor דומה, צריכים להשקות את הצמחים לפני זמן קצר (~ שעה 1) הקציר. אופטימיזציה של חדירת העלה וצנטריפוגה זיהום cytoplasmic לא רצוי של AWF בשל תמוגה תא חלקית יגרום אם הלחץ המכני שבם נתקל התאים גבוה מדי במהלך שלבי חדירה או צנטריפוגה. לכן, את ההליך לסוג עלה נתון צריך להיות trade-off בין מותאם למקסם את התשואה ולהקטין את זיהום cytoplasmic של AWF. בכל המקרים, יש להשתמש במהירות צנטריפוגה הנמוכה ביותר בה ניתן לשחזר AWF כדי למנוע הפרעה מכאנית אפשרית של תאי העלה. אופטימיזציה של centrifuמהירות gation צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל סוג עלה ידי ניטור הנפח התאושש ואפופלסט זיהום על פני טווח של מהירויות צנטריפוגה. זה נצפה כי פעילות אנזים סמן, כגון MDH, G6PDH ואיזומראז גלוקוז-פוספט, יישאר נמוך עד כוח צנטריפוגלי סף היא עלתה, ומעליו הפעילויות אלה יגדלו במהירות, ככל הנראה עקב דליפת cytoplasmic 9,12,14. השימוש בParafilm לתמיכה במהלך שלב צנטריפוגה, כפי שציין בייקר et al. 2012 11, יכול לשפר את היעילות של מיצוי AWF ועשוי למזער את הנזק מכאני ללהב העלה שנגרם על ידי קיפול ודחיסה מוגזמים. יתר על כן, השימוש בParafilm משפר הדמיה של העלה לאחר צנטריפוגה כאשר יש לבחון את העלה לנזק ושלמות של חילוץ AWF. 12 Nouchi לתאר אופטימיזציה של התאוששות AWF מחלקי עלה אורז קיצוץ, שהם דifficult לחדור ודורש מהירויות צנטריפוגה גבוהות כדי לאסוף AWF בגלל הפתחים הפיוניות הקטנים שלהם. השתפר הרטבה של פני השטח העלה האורז, או על ידי presoaking את העלים במים מזוקקים או התוספת של חומרים פעילי שטח לנוזל ההסתננות, אפשר את תהליך החדירה. מהירות גבוהה יותר צנטריפוגה (6000 XG) שימשה גם תוך ניטור לזיהום apoplastic 12. בעת שימוש בחלקי עלה לחתוך תמיד יש את הסיכון שזיהום cytoplasmic יהיה נפוץ יותר אפילו עם כביסה נרחבת של אתרי הפצע; ולכן צריכים לשמש רק עלים לחתוך במידת צורך. למחקרים רבים במים מזוקקים משמש כנוזל הסתננות 11. עם זאת, תרכובות ניתן להוסיף הנוזל החדירה, כגון מלחים או מאגרים, על מנת לשפר את המיצוי של תרכובות apoplastic מסוימות, במיוחד חלבונים 13. 14 Lohaus העריך את ההשפעה של כוח יוני והאוסמוטי on הרכב AWF התאושש ומצא אותם להיות זניח. שינויים ב- pH של מדיום ההסתננות, לעומת זאת, עשויים להשפיע על הרכב AWF 14. טיפול ואחסון נכון של נוזל apoplastic חילוץ הוא חשוב. AWF הוכח מכיל שפע של פרוטאזות ואנזימים אחרים 13,20, כמו גם תרכובות אורגניות נדיפות. לכן, כדי להפחית את השינויים בהרכב של AWF לאחר ההחלמה מומלץ לשמור על דגימות קרח או מאוחסן אחר ב -80 ° C. יתר על כן, מבחני האנזימטית של AWF צריכים להתבצע בהקדם האפשרי לאחר החילוץ להגביל איון אנזים בשל proteolysis, דילול ממושך או להקפיא הפשרה. התהליך של חדירה מדלל את נוזל apoplastic וזה לעתים קרובות יש צורך לקבוע את מידת דילול זה. צעד צנטריפוגה יכול גם לדלל את AWF עם מים מתאים תאיים. גורם לדילול הוא זקוקed להעריך in vivo אפופלסט ריכוזים כימיים כאשר מדידות נערכת בAWF. גורם לדילול נחוץ גם להתרכז AWF חזרה לכוח מלא כאשר הוא בשימוש כאפופלסט מחקת מדיום גידול לחיידקים - ובכך התאמה בריכוזי המטבוליט vivo בצורה מדויקת ככל האפשר. כמה וריאציות קיימות בשיטה המתוארת בשלב 4 לקביעת הגורם לדילול AWF על ידי מדידת הדילול של מתחם סמן נוסף לנוזל ההסתננות. לכל שיטות חישוב דילול AWF מניח שנוזל החדירה לא ניכר נספג או מדולל על ידי תאי העלה במהלך תהליך ההחלמה AWF. הנחה זו אומתה בעבר לצעד הסתננות 14 אבל הוא לא מאומתת לצעד צנטריפוגה. מתחם הסמן חייב גם לא ייקלט, מועבר או שונה ואילו באפופלסט. ארגמן Indigo הוא נפוץ ביותר ונבדק ביסודיות של צבעים בשימושלחישובי דילול AWF. ארגמן Indigo מציג הספיגה נמוכה לשרף חילוף קטיון וקירות תא מבודדים והוצג להיות מתאים לחישובי AWF בnapus Brassica, Pisum sativum, Solanum lycopersicum וגליצין מקסימום 11,21,22. עם זאת, בכמה סוגי עלים, למשל, אורז ומלפפון, ארגמן אינדיגו הופיע לא התאושש באופן מלא לאחר חדירה, מה שיוביל להערכה חסרה של הגורם לדילול AWF 12,21. חוסר ההתאוששות של ארגמן אינדיגו יכול להיות בגלל הרגישות שלו למחשוף לsulfonate isatin ידי סופראוקסיד 23, אשר ידוע להיות מיוצר באפופלסט, במיוחד תחת לחץ 24. מחשוף של ארגמן אינדיגו לsulfonate isatin יגרום להפסד של 610 ננומטר הספיגה ב ועלייה ב 245 ננומטר. אם תגובה זו מתרחשת למידה ניכרת באפופלסט, או אם תגובה זו יכולה להיות מעוכבת על ידי התוספת של אוכלי נבלות סופראוקסיד לinfiltratיון נוזל לא נחקר עד כה. dextran הכחול כבר בשימוש במקום ארגמן אינדיגו לכימות של הגורם לדילול AWF באורז משאיר 12, אם כי לא דווחו על יציבותה והתאוששות בAWF. לחלופין, ניתן להשתמש בתרכובות radiolabelled כגון סורביטול [14 C] או סטנדרטים פנימיים לכימות אחרות במקום צבעים והירידה ברדיואקטיביות או ריכוז שנמדד ומשמש לחישוב הגורם לדילול בדרך דומה 11,14,25. מגבלות של הטכניקה כמה אזהרות קיימות לשיטת בידוד AWF ההסתננות-צנטריפוגה. ראשית, הדילול של אפופלסט במהלך החדירה עלול לעורר תגובה מהמפעל. אם תאי העלה סביב לזהות ריכוז מופחת עבור רכיבים מסוימים של נוזל apoplastic, הם עשויים להגיב במפרישים מטבוליטים נוספים, מעוותים את הפרשנות של ריכוזי המטבוליט. בהערכה של בעיה זו זה היה ציין כי לא הזמן ובין החדירה וצנטריפוגה ולא הבדלים מתונים בחוזק היוני של נוזל החדירה השפיע על הרכב של AWF חילוץ 14,22. לכן, כל חפצים וכתוצאה מאפופלסט דילול הם חשבו להיות מינימאליים. חסרון שני הוא שפוטנציאל elution של AWF ידי צנטריפוגה לא ללכוד את כל המולקולות הנמצאות באפופלסט מכמה סיבות. תרכובות מסוימות, בקטיונים וחלבונים מסוימים עשויות להיות קשורים באופן הדוק עם דופן תא מטען השלילי ולא elute עם AWF 13. מולקולות אחרות כגון חלבונים עשויות להיות גדולות מדי לelute ביעילות מתוך אפופלסט במהירויות צנטריפוגה משמשות 14. מיני חמצן תגובתי הם מעמד חשוב של מתחם מיוצר באפופלסט, אבל בשל האופי קצר מועד של תרכובות אלה, ודרישות שלא פורטו לייצור שלהם, יחסי הציבור שלהםesence לא נתפס היטב על ידי מיצוי AWF. זה לא ידוע כמה במדויק AWF מייצג את הרכב בvivo של נוזל אפופלסט ועשוי להשתנות בין מינים. כמה מבחני קיימים כדי לקבוע זיהום cytoplasmic, למרות שאף אחד מתקבל באופן אוניוורסלי. מבחני של אנזימים בעיקר cytoplasmic (למשל, G6PDH, איזומראז פוספט hexose, MDH) יש את היתרון של להיות קל לביצוע אבל לא יכול לתאם גם עם דליפת cytoplasmic 14,18. ההערכה של מטבוליטים cytoplasmic (למשל, פוספטים hexose, כלורופיל) היא אולי מעיד יותר אך פחות הוקמה 11 גם. עם זאת, גם סוג של assay יכול להיות שימושי עבור כימות יחסי של זיהום apoplastic בין דגימות. באופן אידיאלי, יש להשתמש במדידות עצמאיות רבות כדי לאמת את שלמות מדגם AWF. תוך ההכרה במגבלותיו, החדירה-centrifugatiבטכניקה המתוארת כאן נשאר טכניקה פשוטה וחזקה בחקר חלבוני apoplastic, מטבוליטים ראשוניים ומשניים ויונים אורגניים.

<html> אפופלסט המפעל הוא החלל הבין-המקיף את תאי צמח. זוהי סביבה דינמית שבו תהליכים מטבוליים ותחבורה רבים יתקיימו. המרכיב המבני העיקרי של אפופלסט הוא קיר התא, שהתאסף ושונה על ידי אנזימים, חלבונים מבניים ומטבוליטים ממוקמים בתוך אפופלסט. בתאי צמח בריאים אפופלסט בדרך כלל נשמרים במצב חומצי המאפשר חומצות אמינו, סוכרים וחומרים מזינים אחרים כדי להיות מיובאים מאפופלסט אל הציטופלסמה על ידי H + symport 1. במהלך הובלת סוכרוז, מהלכי סוכרוז ממקורות פוטוסינתזה באמצעות אפופלסט וכלי דם להשיפה; סוכרוז מועבר לאחר מכן על ידי פוטנציאל האוסמוטי מתוחזק על ידי invertases apoplastic ביקוע סוכרוז באיברי הכיור 2. סוכרים וחומרים מזינים אחרים יכולים גם להיות מועברים כלפי מעלה ומצטברים בחללים הפיוניות דרך זרם דיות 3. &quot;&gt; אפופלסט גם מייצג נישה סביבתית שבו פתוגנים רבים להקים אורח החיים טפיל שלהם. יש לי פתוגנים מפעל בקטריאלי היכולת להתרבות לצפיפויות גבוהות באפופלסט, שבו הם לגשת דרך פתחים טבעיים כגון הפיוניות או דרך פצעים 4. הריכוז של אמין חומצות ותרכובות חנקן אחרות בעגבניות אפופלסט הוכחו להיות מספיק כדי לתמוך בדרישות התזונתיות של חיידקים פתוגנים ופטריות 5,6. תגובות הגנה ראשוניות לפתוגנים חיידקים להתרחש גם באפופלסט, כלומר הייצור של מיני חמצן מגיבים על ידי peroxidases תאי . וoxidases וחיזוק דופן התא דרך cross-linking וcallose תצהיר 7 דופן תא הצמח עשירה במטבוליטים משתיים בפעילות אנטי-מיקרוביאלי; הטבע ביוכימיים של מטבוליטים משניים אלה משתנה בין מיני 8. כתוצאה מהאמור לעיל, מוזכרed ותהליכים אחרים, נוזל apoplastic עלה מכילים מגוון של חלבונים, סוכרים, חומצות אורגניות, חומצות אמינו, מטבוליטים שניוניים, מתכות וקטיונים אחרים (למשל, Mg 2 +, K +, Na +, 2 + Ca, Fe 2/3 +). הריכוזים מומסים באפופלסט של יורה נשלטים במידה רבה על ידי האיזון של תהליכים המתרחשים בין תחבורת אפופלסט והעצה, והשיפה ציטופלסמה 9. עם זאת, תגובות מטבוליות והתפתחותם של חיידקים גם לצרוך או לייצר מומסים apoplastic. הרכב אפופלסט ידוע שונה בין מיני צמחים וגנוטיפים ובתגובה לשינויים בתנאים סביבתיים כולל אור, תזונה ויוטיים ולחצי אביוטי 9. על ידי לימוד בהרכב אפופלסט וכיצד הוא משתנה, כולל מאפיינים כגון חיזור ופוטנציאל האוסמוטי, pH, מזין / זמינות המטבוליט ופעילות האנזימטית, אחד יכול לקבל תובנות רומן לכיצד צמחים מחדשspond לסביבתם. הבנה או המאפיין את השינויים המולקולריים המתרחשים בפתרון אפופלסט מסובכת כי זה תא במרחב מובנה ודינמי שבו מטבוליטים ו / או יונים עשויים להיות תנודתי, חולפים או הקשורים לקיר התא וקרום פלזמה. יתר על כן, שיטות אנליטיות שונות נדרשות כדי לכסות את מגוון סוגים שונים כימיים של. כדי לחקור את ההרכב של אפופלסט המסיס, נוזל בדרך כלל צריך להיות מופק מהרקמות. מספר שיטות קיימות כדי לחלץ אפופלסט נוזל מרקמות שונות, כולל שיטת רצועת מסנן מוצעת חדש 10, אבל שיטת החילוץ שהוקמה ביותר לעלים היא חדירה-צנטריפוגה. טכניקה זו הוערכה בעבר 11-13 וLohaus et al. 2,001 14 לספק בדיקה יסודית של רבים מפרמטרים הטכניים של השיטה. כפי שמשתמע מהשם, החדירה-centrifuטכניקת gation היא שיטת שני שלבים שבעצם כרוכה החלפת המרחב האווירי apoplastic עם נוזל המימי הסתננות, שמתערבב עם נוזל apoplastic הילידים, ואחרי התאוששות של החדירה / תערובת נוזלי apoplastic ידי צנטריפוגה העדינה של העלים. כנוזל התאושש מדולל ואינו מכיל את כל התרכובות הנמצאות באפופלסט (ראה להלן), נוזל זה ידוע בכינויו אפופלסט נוזל כביסה (AWF), או נוזל כביסה לפעמים אינטר, ולא נוזל apoplastic. טכניקת החדירה-צנטריפוגה היא להרחבה בקלות ומאפשר דגימות AWF יחידים או משולבות של נפח מספיק כדי להיות שנוצרו ונתונים למגוון רחב של טכניקות ביוכימיים ואנליטיות במורד הזרם (לדוגמא, אלקטרופורזה חלבון, מדידת פעילות אנזים, NMR, סוגים רבים של כרומטוגרפיה ומסה ספקטרומטריית). עלה AWF שימושי גם כאפופלסט מחקת מדיום גידול ללימוד האינטראקציה של שנינות חיידקים מפעל התישבותh סביבתם 5. בפרוטוקולים הבאים אנו מתארים כיצד לבצע את טכניקת החדירה-צנטריפוגה באמצעות Phaseolus vulgaris קורות חיים. Tendergreen עלים, ולספק כמה דוגמאות לניתוחים במורד הזרם, עם דגש על metabolomics. חשוב לציין, שיטות להערכת האיכות של AWF מסופקות יחד עם עצות כדי לייעל את ההליך עבור סוגים שונים עלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:291px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Eppendorf Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:291px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:139px;">22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">razor blade</td>
			<td style="width:291px;">Fisher</td>
			<td>12-640&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">60 ml syringe</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">300865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">20 ml syringe</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">4 inch parafilm</td>
			<td style="width:291px;">Bemis</td>
			<td style="width:139px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">side arm flask</td>
			<td>SciLabware</td>
			<td>12972831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">vacuum source</td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">5 ml pipette tips</td>
			<td style="width:291px;">Fisher</td>
			<td>50-813-28&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:309px;">centrifuge</td>
			<td style="width:291px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:291px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">indigo carmine</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">I8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microplate reader</td>
			<td style="width:291px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;">Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">96 well plates</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:291px;">SciQuip</td>
			<td style="width:139px;">Christ Alpha 2-4 LD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microcentrifuge</td>
			<td style="width:291px;">biorad</td>
			<td>166-0612EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">oxaloacetic acid</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-glucose-6-phosphate</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>G7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NADH</td>
			<td style="width:291px;">Roche</td>
			<td>10128023001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MDH assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Biovision</td>
			<td>K654-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">G6PDH assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>MAK015-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">G-6-P assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Biovision</td>
			<td>K657-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">ribitol</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">A5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">methanol</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">chloroform</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">vacuum concentrator</td>
			<td style="width:291px;">Thermor Scientific</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">226904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">394866</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example

אפופלסט הוא תא תאי שונה ברקמות צמח שנמצאת מחוץ לקרום הפלזמה וכולל את דופן התא. תא apoplastic שלי צמחים הוא האתר של מספר תהליכים הביולוגיים חשובים, כולל קיר תא היווצרות, חומרים מזינים סלולריים ספיגת מים ויצוא, אינטראקציות הצמח-endophyte ותגובות הגנה לפתוגנים. שיטת החדירה-צנטריפוגה היא מבוססת היטב כטכניקה חזקה לניתוח הרכב אפופלסט המסיס של מיני צמחים שונים. הנוזל המתקבל בשיטה זו ידוע בכינויו אפופלסט נוזל כביסה (AWF). הפרוטוקול הבא מתאר שיטת חדירת האבק וצנטריפוגה מותאמת להפקת AWF מvulgaris Phaseolus קורות חיים (שעועית הצרפתית). Tendergreen עלים. המגבלות של שיטה זו ואופטימיזציה של הפרוטוקול למיני צמחים אחרים הם דנו. התאוששתי ניתן להשתמש AWF במגוון רחב של experimen במורד הזרםts המבקש לאפיין את ההרכב של אפופלסט וכיצד הוא משתנה בתגובה למינים צמחים וגנוטיפ, התפתחות צמח ותנאים סביבתיים, או כדי לקבוע כיצד מיקרואורגניזמים לגדול באפופלסט נוזל ולהגיב לשינויים בהרכבו.

תוצאות אופייניות לעקירות AWF בוצעו על פ &#39;3 בשבוע הישן הבריא vulgaris קורות חיים. Tendergreen עלים, שימוש במים מזוקקים כמו נוזל החדירה מוצגים בטבלה 2. הצעיר P. העלים vulgaris נוחות לחדירה, ובמהירות צנטריפוגה משמשת כאן (1000 XG) הסרת הרוב של חדירת נוזלים על ידי צנטריפוגה ניתן לראות באופן ישיר כעלים לחזור לצבע הירוק המקורי שלהם. P. משקל טרי עלה vulgaris היה על XG 1.1 הממוצע לפני החדירה והניב 0.5 מיליליטר של AWF למשקל טרי גרם. ריכוז החלבון של AWF היה נחוש להיות 0.18 ± 0.08 מ&quot;ג / מיליליטר באמצעות שיטה ברדפורד סטנדרטית. הגורם לדילול לעלים אלו המחושבים על ידי מדידת דילול ארגמן אינדיגו, היה 2.3 ± 0.3 קיפול. הערכים הנ&quot;ל יכולים להשתנות באופן משמעותי בין מינים וניסויים פיילוט נדרשים על מנת לקבוע את התשואה של AWF לנו טרי עלה גרםight, כמו גם את ריכוז AWF חלבון וגורם לדילול שניתן לצפות לסוג עלה נתון. נזק לשלמות התאים יכול להתרחש גם במהלך שלב החדירה, אם השינויים בלחץ הם מהירים מדי, ובמהלך שלב צנטריפוגה אם הכוח הצנטריפוגלי הוא גבוה מדי. לכן, יש לassay דגימות AWF לסמנים של זיהום cytoplasmic; באופן אידיאלי, מבחני עצמאיים רבים מבוצעים. כאן, התוצאות משלושה מבחני אפשריים מדווחות בטבלה 2. בעקירות מבוצעות היטב של P. vulgaris AWF, G6PDH היה ​​בלתי ניתן לגילוי על ידי assay אנזים סטנדרטי. זה עולה בקנה אחד עם דיווחים אחרים שבו פעילות G6PDH הופכת לגילוי רק מעל כוח הצנטריפוגלי סף 12. בניגוד לכך, רמה בסיסית של פעילות malate dehydrogenase (2.5 U / ml) הייתה להבחין בכל P. דגימות vulgaris AWF באמצעות assay חילוף חומרים סטנדרטי. הגדלת צנטריפוגלי לce מעל סף של 1,000 XG הביא פעילויות MDH מוגברות (תוצאות לא מוצגות). כאפופלסט ממינים אחרים ידוע מכיל פעילות MDH אנדוגני 18, הסכום שזוהה כאן נחשב פעילות apoplastic אמיתית ועליות משמעותיות מעל רמת בסיס זה הוא מעיד על זיהום. מטבוליטים שנחשבים בעיקר cytoplasmic, כגון hexose-6-פוספטים, יכולים לשמש גם כדי להעריך את הזיהום של AWF. כאן, ניתוח GC-MS זוהה אפס או עקבות רמות של G-6-P בעקירות AWF. לעומת זאת, בסעיפי שורש תירס לחתוך, G-6-P אותר לאחר מיצוי AWF בכל מהירויות צנטריפוגה וגדל בריכוז במהירויות גבוהות יותר, המצביע על זיהום cytoplasmic 10. ניתוח המטבוליט ידי GC-MS של פ vulgaris עלה AWF בדרך כלל תשואות 40-60 מטבוליטים לזיהוי ומספר שווה של תרכובות בלתי מזוהות (איור 2). אוחומצות-אורגניות, סוכרים פשוטים, וחומצות אמינו מייצגים את חלק הארי של מטבוליטים לזיהוי, לעומת זאת, מטבוליטים שניוניים צמח גם זוהו ולכמת מ -11 AWF. כמה פסגות דוגמא משיעורי מולקולה השונות אלה מסומנות באיור 2 שיטות אנליטיות במורד הזרם נוספות החלות על דגימות AWF אלה לכמת מולקולות שונות, לדוגמא:. ICP-MS, NMR, HPLC, ספקטרום בליעה אטומי, ספקטרומטר מסת חלבון. מרכיב החלבון של אפופלסט מיוצג גם בAWF כפי שמוצג בג&#39;ל צבעי קומסי SDS-PAGE המוכתם באיור 3. בין תפקידים אחרים, אנזימי apoplastic אחראים לסינתזה של דופן התא ויצירת תגובה תאית מיני חמצן. מחקרי proteomic של AWF ממינים שונים זיהו עשרות חלבונים בודדים והראו כי מרכיב החלבון של אפופלסט מגיב לEnviroלחץ nmental 13,19. באופן אידיאלי תמצית AWF צריכה להיות חופשית מזיהום על ידי חלבוני cytoplasmic כגון Rubisco; עם זאת בפרקטיקה זו היא קשה להשגה. הנוכחות של להקת חלבון Rubisco ב ~ 53 kDa הבא SDS-PAGE מספקת assay איכותי נוסף ליושרה של דגימות AWF. לדוגמא, המדגם הטעון במסלול 2 באיור 3 מכיל כמות גדולה יותר של זיהום Rubisco זה של מסלול 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> Phaseolus vulgaris AWF </td></tr><tr><td> נפח של AWF (ז -1 FW עלה מיליליטר) </td><td> 0.49 ± 0.09 </td></tr><tr><td> קונצרט כלשהו חלבון. (מ&quot;ג מיליליטר -1) </td><td> 0.18 ± 0.08 </td></tr><tr><td> גורם לדילול </td><td> 2.3 ± 0.3 </td></tr><tr><td> פעילות G6PDH (U מיליליטר -1) </td><td&gt; אף זוהו </td></tr><tr><td> Glc-6-P (מ&quot;ג מיליליטר -1) </td><td> אף זוהו </td></tr><tr><td> פעילות MDH (U מיליליטר -1) </td><td> 2.5 ± 0.9 </td></tr></tbody></table> תוצאות אופייניות טבלה 2. לעקירות AWF מפ vulgaris קורות חיים. Tendergreen עלים. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig1highres.jpg" /> איור 1. זרימת עבודה חילוץ אפופלסט תקן. המספרים מתייחסים לצעדים בפרוטוקול. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig2highres.jpg" /> איור 2. דוגמא chromatogram GC-MS של P. Vulgaris קורות חיים. . Tendergreen AWF פסגות דוגמא המטבוליט הממוספר הן: 1-malonate, 2-פוספט, 3-succinate, 4-ידוע, 5-malate, 6-asparagine, 7-ribitol (st הפנימיandard), 8-ציטראט, 9-גלוקוז, 10-אינוסיטול, חומצת 11-caffeic, 12-סוכרוז. <img alt="איור 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig3highres.jpg" width="250" /> איור 3. דוגמא SDS-PAGE Coomassie מוכתם ג&#39;ל של P. Vulgaris תמציות עלה AWF. ג&#39;ל זה מספק השוואה בין מרכיבי החלבון של שתי עקירות AWF שונים בסך של זיהום cytoplasmic על ידי אנזים plastidial שפע Rubisco. לאחר מיצוי AWF שני הדגימות היו נתונים למשקעי חלבון אצטון בעודף של פי 4 (V / V) של אצטון הקר וresolubilized במים בעשירית הנפח המקורי. נתיבים 1 ו -2 מכילים 40 מיקרוגרם של חלבון. הלהקה המתאימה לרשת הגדולה Rubisco (~ 53 KDA) מצויינים על ידי חץ. r M: חלבון סמני משקל מולקולרי.

Watch this Scientific Journal Video about The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example at JoVE.com

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש<em&gt; Vulgaris Phaseolus</em&gt; כדוגמה

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

the-infiltration-centrifugation-technique-for-extraction-apoplastic

Research

JoVE Journal

Biology

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

36.6K Views.  University of Oxford. This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Video: The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

בדיקת חסמים פיזיולוגיים להעברת נגיפי ב כנימות שימוש Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

בדיקת סובלנות ניקוטין ב כנימות באמצעות ניסוי דיאט מלאכותית

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid peptide (A&#946;) and intraneuronal accumulation of hyperphosphorylated tau protein. Because cerebrospinal fluid (CSF) is in direct contact with the extracellular space of the brain, it provides a reflection of the biochemical changes in the brain in response to pathological processes. CSF from AD patients shows a decrease in the 42 amino-acid form of A&#946; (A&#946;42), and increases in total tau and hyperphosphorylated tau, though the mechanisms responsible for these changes are still not fully understood. Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for CSF sampling from the mouse. This extremely gentle sampling technique allows serial CSF samples to be obtained from the same mouse at 2-3 month intervals which greatly minimizes the confounding effect of between-mouse variability in A&#946; or tau levels, making it possible to detect subtle alterations over time. In combination with A&#946; and tau ELISA, this technique will be useful for studies designed to investigate the relationship between the levels of CSF A&#946;42 and tau, and their metabolism in the brain in AD mouse models. Studies in Tg mice could provide important validation as to the potential of CSF A&#946; or tau levels to be used as biological markers for monitoring disease progression, and to monitor the effect of therapeutic interventions. As the mice can be sacrificed and the brains can be examined for biochemical or histological changes, the mechanisms underlying the CSF changes can be better assessed. These data are likely to be informative for interpretation of human AD CSF changes.

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse

Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses in human patients. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for serial CSF sampling from the mouse.

טכניקה אוסף טורי של הנוזל השדרתי מן צ&#39;יסטרנה מגנה על עכבר

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

אפיון מנגנוני ההתנגדות אוכלי עשב: Spittlebugs על Brachiaria Spp. כדוגמה

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

נוהל כדי להעריך את היעילות של flocculants להרחקת מפוזרי חלקיקים מן תמציות צמחים

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...