המחברים מבקשים להודות לסדנת MRC-LMB לייצור חבית אקדח גן המשופר. כמו כן, אנו רוצים להודות לד&quot;ר דוד ר &#39;Hampson באוניברסיטת טורונטו לשימוש בציוד ובמשאבים.

השימוש בבעלי חיים וברקמות של בעלי חיים צריכים להקפיד על אישור וועדה אתי לפי כללים מקומיים ורגולציה. כל הרקמות שהושגו במהלך מחקר זה דבק הנחיות הניסויים בבעלי החיים של MRC-LMB. .1 הכנת מדיה חומרים ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל הפתרונות באמצעות מים Millipore; להשתמש ריאגנטים כיתה אנליטיים בלבד. להכין ולאחסן את כל חומרים כימיים ב RT (אלא אם צוין אחרת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של תמיסת מלח HEPES שנאגר (10 HEPES מ&quot;מ, 120 mM NaCl pH 7.2). לסנן באמצעות יחידת סינון סטרילי 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של תמיסת מלח שנאגר פוספט (PBS; 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 2 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl, pH 7.4). לעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני עצבי על ידי השלמת DMEM (המדיום של הנשר שונה Dulbecco) עם 25 HEPES מ&quot;מ, 10% עגל בסרום עוברי, 30 גלוקוז מ&quot;מ, 1: 100 N2 supplement, 1,100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין; pH 7.2. לסנן עם יחידת סינון סטרילי 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון polyvinylpyrrolidone המניה (PVP) עם 20 PVP מ&quot;ג באתנול 1 מ&quot;ל 100%. Aliquot זה ל1 מ&quot;ל כמויות, הקפאה ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. עובד פתרון הוא 0.05 מ&quot;ג / מ&quot;ל, לכן להוסיף 10 μl של פתרון מניות PVP לכל 4 מ&quot;ל של 100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 0.05 M spermidine במי Millipore; להתאים את pH עד 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון 2% agarose בDMEM (agarose הכיתה אלקטרופורזה 2 גרם ב100 מ&quot;ל DMEM בבקבוק כובע בורג מעוקר). מיקרוגל זה עד agarose נמס. אחסן במקרר 4 ° C. במשך כמה שבועות, במידת צורך. </li></ol> 2 הכנת Organotypic Slices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים C57 שחור 6 עכברים של הגיל הרצוי על ידי CO 2 מחנק אחריו עריפת ראש. הסר את המוח באמצעות קיצוצי גולגולת רוחביים החל משעת מגנום הנקב ומסתיימים באונות הרחה. רם בעדינות את הגולגולת מאחור כדי לחשוף את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך בין אונות הרחה וקליפת המוח הקדמית, ומקורית למוח הקטן. רם בעדינות את החלק מקורי של המוח וחתך את עצבי הראייה. לבסוף, להסיר את המוח ולמקם אותו בצלחת פטרי מלאה שבנאגרה מלוח HEPES הקרים כקרח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לקלף פיא באמצעות מלקחיים קנס; להסיר בזהירות את כלי דם וקרומי מוח סביב המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח הטרי לתוך תבנית נמען קטנה ולכסות אותו עם פתרון agarose מקורר מעט מעל RT. ואז במהירות לקרר את התבנית ל4 ° C על ידי הצבתו על קרח. הערה: תהליך פרוסות במהירות אפשרי כדי למנוע אובדן של יכולת קיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר agarose יש להגדיר (5 - 10 דקות), להסיר את המוח מוטבע agarose מהתבנית (לקצץ במידת צורך), ולאחר מכן להדביק אותו לפלטפורמת vibroslicer. את המקום הזה לחדר vibroslicer מכיל PBS הקר כקרח סטרילי. Disinfect קאמרי vibroslicer לפני בשימוש עם 70% אתנול כדי למזער זיהומים שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את המוח באמצעות vibroslicer נבנה מותאם אישית או שווה ערך מסחרי. רעיון המודל היה לתכנן מבצעה רקמה שיכולה ליצור תנועות אופקיים לקצה הלהב גדולות משרעת ותדירות גבוהה תוך מזעור תנודות אנכיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתדירות התנודה של 90 הרץ, במשרעת של 1.5 - 2.0 מ&quot;מ, והלהב החיתוך ממוקם בזווית של ° 15 למישור האופקי; להגדיר את בלוק ההרכבה מחזיק המוח מוטבע agarose לנוע ב1.7 מ&quot;מ / דקה לכיוון הלהב. לאסוף חלקים (150 מיקרומטר) לתקשורת ותרבות הקרה כקרח המכילה תא (DMEM / סטרפטוקוקוס + 10% FCS). צפו בחיתוך ומניפולציה של פרוסות הרקמה כוידאו נוסף בארסנו ו13 אובריאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את הפרוסות למוסיפה תרבית תאים (0.4 מיקרומטר, בקוטר 30 מ&quot;מ) במגש 6 רב גם עם מד התרבותIA בצד החיצוני של העלון, ודגירה בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: לכדאיות רקמות תקינה, להיות מאוד עדין בעת ​​העברה והמניפולציה של הפרוסות. כמו כן, יותר מדי נוזלים ימנעו את פרוסות organotypic מהקפדה על הקרום של להכניס את המסנן. אם זה יקרה, להסיר את הנוזלים העודפים או צלחת שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות שפרוסות organotypic יכולות להיות מתורבתות במשך כמה שבועות, להמשיך לtransfection לא יאוחר מ -4 ימים לאחר ציפוי לתשואות transfection הטובים ביותר. הערה: כדי למנוע צמיחת יתר גליה בתנאי תרבות לטווח ארוך, ARAÇ שימוש או בסרום בינוני חינם 2. </li></ol> .3 הכנת מיקרו וננו קליעי מצופי DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ננו קליעים באמצעות חלקיקים בקוטר זהב 40 ננומטר. בקצרה, להוסיף 50 μl של 0.05 M spermidine ו10 DNA μl ב1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(pEYFP-N1) ל10 מ&quot;ג של חלקיקי זהב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת סידן וspermidine בתמהיל הפתרוןמכשור במייקרו DNA-זהב חלקיקי הכנה על מנת לסייע במחייב של מולקולות דנ&quot;א לחלקיקי זהב. הערה: הכמות של DNA משמשת לכל מ&quot;ג של נשאי זהב (DLR), צריכה לנוע בין 1 ל 5 מיקרוגרם DNA לכל 1 מ&quot;ג של זהב. יתר על כן, הסכום של חלקיקים נשאים זהב שיהיה ירה לכל מחסנית (MLQ), צריך עצמו נע 0.1-0.5 מ&quot;ג של זהב. יש לנסות DLR וMLQ ומותאם לכל משתמש בהתאם למערכת המסוימת בחקירה, כמו גם הסוג של אקדח חלקיקים וגן בשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעזרת מערבולת תוך הוספה לאט 50 μl של 1 M CaCl 2 בשברים של 10 - 15 μl. בעקבות 5 דקות של מזדמן vortexing, צנטריפוגה XG ב 1000 ל30 שניות לאחר מכן להסיר את supernatant. Resuspend גלולה חלקיקי זהב ב3.5 מ&quot;ל של 0.075 M PVP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר השעיה זו לתוך צינורות (קוטר 2.36 מ&quot;מ פנימי) באמצעות מזרק. הנח את הצינור בתחנת הכנת צינורות. לאפשרחלקיקי זהב להתיישב ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה עם מזרק. סובב את צינורות כדי להתפשט באופן שווה את חלקיקי זהב, שהיו יבש תחת זרימת חנקן קבועה לאחר מכן בשעה 5 ליטר לדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור DNA-כדורים, לחתוך את צינורות באמצעות חותך צינורות ל1 אורכי סנטימטר. כך או להכניס מייד למחסנית אקדח הגן או לשמור (4 ° C) המיובש עד נדרשת. </li></ol> .4 Biolistic Transfection על Organotypic Slices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים בזרימה למינרית סטרילי הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס סוללה 9 V ובעל מחסנית ריק לתוך אקדח גן הליוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את אקדח הגן למכל הליום עם צינור הליום. 2 אש - 3 כדורי סרק (חריצים ריקים) בשעה 50 psi לחצים על צינור הליום והמאגרים באקדח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המחסניות המכילות זהב מצופה דנ&quot;א לתוך מחזיקי המחסנית וטען את בעל לאקדח הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתיר את spacer אקדח הגן ולצרףקנה אקדח הגן הותאם לאקדח הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, מקום להוסיף מסנן המכיל פרוסת organotypic לתוך צלחת פלסטיק סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מפרוסות organotypic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לחץ הגז ב50 psi. הערה: ההגנה על עיניים היא חיונית והגנה על אוזן רצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את אקדח הגן במרחקים המתאימים על ידי שימוש בהרכבה נמדדה ל10 מ&quot;מ. בזהירות לכוון מרכז החבית מעל האזור הרצוי למסירה גנטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הירי, להחליף מוסיף בחזרה לתוך הצלחת שלהם עם תקשורת טרי ולהחזיר אותם לתנאי גידול נורמלים, כלומר, 37 ° C עם 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שסיימתי, לסגור את מיכל הליום, לשחרר את הלחץ מאקדח הגן ולנתק את אקדח הגן מיכל הליום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בעל המחסנית וזורקים את המחסניות ולנקות את אקדח הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הרקמה למורפולוגיה ולחדירה מוצלחת של visuaLizing פרוסות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. אם אתם משתמשים בmicroparticles, באופן שווה לפזר את הזהב; לא צריך להיות שום אזורים צפופים של חלקיקי זהב ראו על הפרוסה. לא ניתן לראות חלקיקים בשל גודלם הקטן כיחידות בודדות על ידי שיטות מיקרוסקופיה קונבנציונליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מרווח הזמן המתאים זמן (בדרך כלל 1 - 2 ימים), לתקן את הפרוסות בparaformaldehyde 4% (PFA) לתצפית במיקרוסקופ. הערה: תיקון בPFA לא תמיד רצויה. הדמיה תא חי להימנע מהצעד הזה. </li></ol> .5 תיקון ויזואליזציה של פרוסות המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר transfection biolistic, לשטוף פרוסות פעמים PBS למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הפרוסות על ידי דוגרים בטריים, 4% הקרח קר PFA ב PBS עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות פעמים PBS למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לחתוך עגול הקרום תומך באמצעות אזמל, מבלי להפריע את הפרוסות רכובים עליהם. שימוש במלקחיים כדי למקם כל תמיכה / פרוסת קרום בשקופית מיקרוסקופ. לנוח organotypפרוסות ic על גבי הקרום על שקופית הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של תקשורת הרכבה אחד על גבי פרוסה ולהוסיף coverslip בעדינות ללא כל כוח ישירות במגע עם פרוסת organotypic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure coverslip עם שכבה דקה של מסמר לכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה פרוסות במיקרוסקופ מתאים. </li></ol> .6 יישומים Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו פרוסות באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה זקוף עם 60X / 1.4 צמצם מספרי (NA) עדשה אובייקטיבית טבילת שמן. הערה: התכונה הבעייתית ביותר של מיקרוסקופ confocal היא בגודל חריר (שנקבע ליום 1 בAU) אשר מסוגל בידוד ואיסוף מטוס של מוקד, ובכך לחסל מחוץ לפוקוס &#39;ערפל&#39; בדרך כלל נראה עם מדגם ניאון. פרטים קטנים לעתים קרובות מוסתרים על ידי אובך זה ולא ניתן לאתרם במיקרוסקופ nonconfocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לייזר ארגון לגל עירור של 488 ננומטר ולייעל לאוסף שלהםאור itted בלהקת ננומטר 500-520. בדרך כלל, לאסוף תמונות ב1,024 x 1,024 פיקסלים ועם ערימות של z-חלקים ב0.5 מיקרומטר מרווחים להקיף את כל רוחבו של כל תא עצב שנותח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את המבנה של הגרעין, דלפק להכתים תאים אלה עם DAPI (גל עירור להגדיר ב405 אור ננומטר והפליטה שנאסף בין 420-4 40 ננומטר). לבסוף, לבחינת הקרינה אדומה, להגדיר את הלייזר ב561 ננומטר לעירור ו565-620 ננומטר לפליטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, לרכוש תמונות על ידי שימוש בזום 4X סריקה שכיסה שטח של 57.6 מיקרומטר 2; גודל תמונה היה באזור של 1,024 x 1,024 פיקסלים. רשומות ערימות של z-סעיפים ב0.5 מיקרומטר מרווחים ותחזיות של 5 - 8 מסגרות משולבות. </li></ol>

<ol>
	<li>Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells.">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Biotechnology. 24, 384-386 (1987).</li><li>Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+culture+from+the+adult+mouse+brain:+a+versatile+tool+for+translational+neuropsychopharmacology.">Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacolog., &amp; Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).</li><li>Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slices:+a+model+to+study+the+neurovascular+unit+micro-environment+in+epilepsies.">Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11 (2013).</li><li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+a+century+of+neuron+culture:+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices.">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2013).</li><li>Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+testing+neuroactive+drugs+-+link+between+in-vitro+and+in-vivo+experiments.">Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments.</a> Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).</li><li>Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+factors+regulating+axon+growth+between+the+cortex+and+spinal+cord+in+organotypic+co-cultures:+effects+of+age+and+neurotrophic+factors.">Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors.</a> J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).</li><li>Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+innervation+of+cerebral+cortex+in+organotypic+slice+cultures:+sustained+basal+forebrain+and+transient+striatal+cholinergic+projections.">Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections.</a> Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).</li><li>Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Cerebellar+Slice+Cultures+Exposed+to+Bilirubin+Evidence+Reactive+Gliosis,+Excitotoxicity+and+Impaired+Myelinogenesis+that+Is+Prevented+by+AMPA+and+TNF-alpha+Inhibitors.">Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors.</a> Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).</li><li>Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+develop+axonal+projections+to+their+target+areas+in+organotypic+co-cultures+of+the+ventral+mesencephalon+and+the+striatum/prefrontal+cortex.">Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex.</a> Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).</li><li>Mingorance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Nogo+and+Nogo+receptor+during+the+development+of+the+entorhino-hippocampal+pathway+and+after+adult+hippocampal+lesions.">Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).</li><li>Arsenault, J., O'Brien, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+heterologous+transfection+of+viable+adult+organotypic+brain+slices+using+an+enhanced+gene+gun.">Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun.</a> BMC Research Notes. 6, 544 (2013).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li><li>Laywell, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-astrocyte+transition:+phenotypic+fluidity+and+the+formation+of+hybrid+asterons+in+differentiating+neurospheres.">Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres.</a> J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).</li><li>Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+neural+stem+cell+markers+suggests+the+occurrence+of+dedifferentiation+in+regenerating+spinal+cord.">Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord.</a> Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).</li><li>Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun:+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue.">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li><li>Brien, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+spines+on+the+dendrites+of+Purkinje+cells.">Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).</li><li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-biolistics:+a+method+of+biolistic+transfection+of+cells+and+tissues+using+a+gene+gun+with+novel+nanometer-sized+projectiles.">Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles.</a> BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).</li><li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistic+labeling+of+neuronal+cultures+and+intact+tissue+using+a+hand-held+gene+gun.">Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun.</a> Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).</li><li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+LDH+assay+for+assessing+nanoparticle+toxicity.">Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity.</a> Toxicology. 287, 99-104 (2011).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).</li><li>Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell+damage+in+organotypic+hippocampal+slice+culture+from+adult+mouse:+a+potential+model+system+to+study+neuroprotection.">Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection.</a> Brain Research. 1385, 68-76 (2011).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PloS One. 7, 45017 (2012).</li><li>Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+DNA/Gold+Nanoparticle+Encapsulated+in+Calcium+Phosphate.">Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 647631 (2011).</li><li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles.">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Appl Phys Lett. 87, 014103 (2005).</li><li>Meijering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+tracing+in+perspective.">Neuron tracing in perspective.</a> Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).</li><li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+axon-attached+recording+with+fluorescent+patch-clamp+pipettes+in+brain+slices.">Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices.</a> Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+'DiOlistic'+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+the+central+nervous+system+after+intracerebroventricular+injection+of+adeno-associated+viral+vectors+in+neonatal+and+juvenile+mice.">Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice.</a> Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).</li><li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+protease-cleaved+SNARE+fragments+induce+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells.">Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells.</a> Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).</li><li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+the+botulinum+type+A+protease+to+growth+factors+and+neuropeptides+allows+selective+targeting+of+neuroendocrine+cells.">Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells.</a> Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).</li></ol>

Dr. John A. O'Brien holds patents for the improved gene gun barrel. US patent number 10/380,452 and European patent Number 01974517.3.

הפרוטוקול מתאר גישות כדי לספק צבעים וחומרים גנטיים לפרוסות organotypic מבוגרות באמצעות אקדח גנים משופר. בעיקרו של דבר, הסוגים של צבעים והמגוון הרחב של גנים אפשריים לעשות בשיטה זו רבת פנים ונוחים לענות למגוון רחב של שאלות ביולוגיות. שיטת הצגת regioselective משמשת, במקרה זה לאזור מסוים במוח, פותחת אפיקים חדשים לניסויים כאפנון גן Heterologous של אזורים מקומיים בתוך ארכיטקטורה רלוונטית מבחינה ביולוגית לא היה בקלות אפשרית לפני. יש לנו נקבעו בעבר כי שיטה זו ניתן להשתמש בפרוסות organotypic מבוגרות, שבו סינפסות בוגרות נוצרות באופן מלא, כפי שהראה הישרדות תא משופרת וביטוי גני Heterologous לשבועות רבים 13. עם כניסתו של תנאים חדשים ומשופרים תרבות למוח של יונקים, כמו גם רקמות אחרות, השימוש במודולציות גנטית regioselective תהפוך שימושית יותר ויותר עבור מגוון רחב של biocheמיכל ניתוחים. כפי שמדגישים כאן ובעבר הוזכר על ידי אחרים 24, גורמים רבים ושונים יכולים בקלות להשפיע על הדיוק והמהימנות של מסירת biolistic. ראשית, הכנת חלקיקי הזהב קשור לצבעים או DNA חייב להיות מאוזנת במידה מספקת כדי למנוע הצטברות וכדי להקל על גירוש מטען מחסנית. סידן וspermidine בפתרון חלקיקי מיקרו DNA-זהב יכולים לסייע המחייב של מולקולות דנ&quot;א לחלקיקי זהב. היכולת לחלקיקים לחדור את התאים תחת לחץ מופחת נקבעה בעבר 17. שנית, אקדח הגן חייב להיות מותקן יציב ככל האפשר עם הזווית ומרחק הנכונים. מד לחץ אמין הוא גם הכרחי לשחזור, כדי לשמור על שלמות רקמה, וכדי להאיץ כראוי חלקיקי זהב למטרות שלהם נועדו. ואכן, המרחק, הכיוון, והיציבות של הציוד גם גורמים מכריעים לtargeting ודיוק של משלוח regioselective. כמבנים מוחיים אלה הם קטנים מאוד, שינויים קלים בזווית הירי יכולים היו בקלות להפוך את ההליך כולו פחות אמין. ולבסוף, ההכנה והתחזוקה של פרוסות organotypic קיימא כבר כרוכה בקשיים במשך עשורים רבים עדיין פרוטוקולים בשפע ואמינים לבעלי חיים שונים, אזורים במוח, גילים וcocultures זמינים כעת 2,4,25,26. נהלים אלה צריכים להיות לפני הגשת הרקמות לפרוצדורות biolistic-מותאם משתמש. זה יותר בקלות יאפשר למשתמש להעריך את השפעתה של חלקיקי biolistic וההשפעה של הגן Heterologous על התרבויות שלהם unbiasedly. לשם כך, השימוש בגני ניאון כגון EYFP וEGFP יכולים גם מאפשרים למשתמש רומן כדי לבדוק את דיוק המיקוד וגם לבצע את הכדאיות הסלולרית דרך ביטוי גני Heterologous על פני תקופה ממושכת של זמן 13. רבים מהצעדים הקריטיים לאמיניםושימוש לשחזור של פרוטוקול זה מודגשים בשלוש הפסקאות הבאות. לtransfection יעיל, ריכוז DNA חייב להיות מתאים. ריכוזים נמוכים מדי ימנעו את תשואת transfection בעוד ריכוזים גבוהים מדי עלולים לגרום להצטברות של חלקיקים. מצרפים של זהב יכולים להפחית באופן דרמטי את יעילות transfection, לגרום להפצות לא אחידות, ויכולים להוביל לרעיל מוגברים וסטרס חמצונים. בעיות עם יעילות ציפוי צפויות בשל פקיעת תוקפו של פתרון spermidine (יש להחליף כל 2 עד 3 חודשים). להתפשטות biolistic נאותה, התיוג חייב להיות אפילו. תיוג הלא הומוגנית של ההשעיה חלקיק זהב / DNA יכול להיות בגלל פתרון PVP. גם זה צריך להיות מוחלף כל 2 עד 3 חודשים. ציפוי של חלקיקי הזהב ניתן לראות על ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כלהקת MW גבוהה 27. כל syst הביולוגישלהם תחת חקירה, כמו גם כל מכשיר אחר המשמש עשוי לדרוש שינויים קטנים בלחץ גז כדי להגיע לרמות מותאמות של transfection והתפשטות biolistic. הפרמטר הקריטי הוא הלחץ של דופק הליום נדרש להתפשט מיקרו או ננו נשאים ממחסנית הפלסטיק ולהניע אותם לרקמה. לחץ גז גבוה ישפיע הישרדות תא, משום שהיא תיצור גלי הלם על פני היעד ולשבש או לנתק את הרקמה מהמטריצה ​​17. מכוון את קנה רובה גן ויש להם המנגנון בדיוק בניצב לרקמה חשוב למסירת biolistic מדויקת. האזור שנבחר צריך להיות ממוקם במרכז הישיר של החבית בדיוק 10 מ&quot;מ מהפתח החיצוני. התוצאה היא בקוטר 3 מ&quot;מ של משלוח חלקיקי זהב סביב מוקד הרעש. קנה אקדח הגן יש לנקות עם אתנול 70% לאחר כל שימוש. כדי להגן על הרקמות מאגרגטים חלקיקים גדולים, החבית מכילה גם רשת ניילון שshoULD להיות מוחלף באופן קבוע כדי לשמור על רמת ביצועים אופטימליים. על מנת להחליף את הרשת לפתוח את המכסה ואז להכניס רשת ניילון חדשה בין הכובע וO-הטבעת. Fluorescently תאים שכותרתו צריכים להיות גלויים לפחות 1 - 2 ימים לאחר transfection סביב המוקד. עדר או חוסר תיאום של תיוג יכול להיגרם כתוצאה מהכנה וחוסר היציבות מספקת של הרכבת אקדח הגן. התצפיות של תאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal תלויה במספר הגורמים: אורך הגל של אור עירור / הפליטה, גודל חריר, NA של העדשה האובייקטיבית, מקדם שבירה של רכיבים בנתיב האור, עומק הרקמה, והיישור של המכשיר. גורמים אלו צריכים להיות מותאמים לכל מערכת תחת חקירה. התקדמות שחלה באחרונה בbiolistics נוצלה להצלחה של שיטה זו. קנה אקדח הגן שימש במחקר זה היה שונה על מנת להפחית את הלחץ הדרוש, כמו גם לנתב biolisticדפוס פיזור לאזור יותר מוגבל וספציפי 17,19. שינויי חבית אחרים לא ניסו להגביל את התפשטות biolistic ולהפחית את לחץ יצוא 28 עדיין חבית זו מעוצבת בהתאמה אישית גן האקדח תוכננה על ידי ד&quot;ר אובריאן היא מצויד לאקדח הליוס ג&#39;ין הסטנדרטי רכיב בודד. בהמשך לכך, חלקיקי זהב תת מיקרומטר שמשו כדי להפחית את הפולשנות של חלקיקי מיקרומטר שקבענו בעבר שנגרמו נזק לתאים וסופו של דבר, אובדן של ביטוי גני Heterologous המתמשך. שינויים אלה להליך biolistic שיפרו את ההיתכנות ואת שחזור הכולל של השיטה 13. שיפורים אחרים בהכנת פרוסה כגון פתרון בעיות מעמיקות של הליך החיתוך, באמצעות מטריצת DMEM-Agarose לשמר את המוח, והתקדמות שימושית רבות אחרת בהכנת פרוסה מוח organotypic שדווחו בעבר 13 אפשרו לנו לחקור את השימוש בפרוסות מבוגרות ש פיתח בוגררשתות הסינפטי. במחקר שלנו אנו משמשים בעיקר צבעים והגנים Heterologous ניאון לדמיין מורפולוגיה של תאים כקריאה על יעילות transfection ויכולת תמונת המאפיינים מורפולוגיים של תאי עצב ברקמות מוח עכבר. יחס האות לרעש של המשלוח סטוכסטיים ברדיוס מוגדר אפשרה לנו לבודד את נמל dentritic של תא בודד לחלוטין בהקשר המקורי שלו. מאמצים רבים נעשו שימוש כדי לחקור מאפיינים מורפולוגיים אלה, &#39;connectomics&#39; המיפוי או לתייג תאים בודדים עבור ניתוחים שונים, שיטה זו יכולה היתה בקלות להיות משולבת עם פרוטוקולים קיימים כגון מדידות אלקטרופיזיולוגיה וneurite 29,30. ככל הנראה, שילוב של גני Heterologous ניאון יכול לאפשר הרבה יותר חזק תיחום של תאים בודדים כהפצה סטוכסטיים של חלבוני ניאון, והשילוב שלהם היה לקבוע את הצבע של התאים הבודדים 31,32. השימוש במקדמי תא ספציפיים כגון synapsin וחלבון חומצת fibrillary גליה במעלה הזרם של אקסון גן Heterologous יכול גם להגביל את הביטוי לאוכלוסיות 33. ואכן, מגוון בלתי פוסק של חומר גנטי יכול גם להיות מועבר באופן regioselective על ידי חלקיקי זהב תוך שימוש באותו הליך זה. סך הכל transfected האזורים ובכך יכולים להיות מנותחים בשיטות מסורתיות, כגון נתיחה והגשת שהאזור לimmunoblotting המערבי כדי לנתח את ההשפעות נקודתיות של גן Heterologous. שיפורים בנהלים פרוס organotypic גם יאפשר שימוש רחב יותר של רקמות מוח לניסויים לטווח ארוך, כמו גם היתר השימוש ברקמות וcocultures אחרים והיה להקל על הליכי transfection. שומנים בדם וtransfection פולימר כבר דיווחו בעבר להשפיע על הומאוסטזיס קרום, הפנמה, חדירות חלבון 34 ולעתים קרובות להראות יעילות נמוכה מאוד לtransfect terminally מובחן תאי עצב. מיקוד מטען ספציפי תא הוא גם נוח רק לתאים המבטאים את הקולטנים בתא השטח דרושים להפנמה, ולמרות ששיטה זו יכולה להיות מאוד סלקטיבית, יכול לחסור ממוקד זה regioselectivity 35. וקטורים ויראליים אחרים הם לעתים קרובות קשים ויקרים לייצור, דורשים תקנות מחמירות ויש מדי פעם הפגינו חששות בטיחות. לכן יש משלוח Biolistic יכולת שאין כמו transfect regioselectively נוירונים וסוגי תאים אחרים בתוך רקמות קיימא. כזהב הוא לא התקדמות רעילה, נוספת בשימוש בbiolistics יכולה לסלול את הדרך לשימושים ביו כגון משלוח דרך העור תרופות, in vivo מסירת גן לא פולשנית, כמו גם טיפולי גן nonviral מקומיים.

במקור טכניקת biolistic, ביטוי Turn-of-ל&quot; בליסטיקה הביולוגית &quot;, הוקמה להעברת גנים בתיווך חלקיקים לתאי צמח 1. שיטה פיזית זה של שינוי התא מאיצה מיקרו או חלקיקים במהירות גבוהה כדי להתגבר על המחסומים הפיזיים של קרום התא אטום כדי לספק מטענים כגון DNA או צבעים. כי זה לא תלוי בליגנד-קולטנים ספציפיים ו / או את התכונות הביוכימיות בקרומי תא השטח, העברת גנים בתיווך חלקיק יכולה להיות מיושמת בקלות למגוון רחב של מערכות ביולוגיות כגון פרוסות מוח organotypic. יש לי פרוסות organotypic באמצעות יתרונות על פני אחרים בפלטפורמות מבחנה שכן הם לשמור על מאפיינים אנטומיים ויוכימיים רבים כי הם רלוונטיים לin vivo הביולוגיה 2-4. פרוסות בעיקר לשמר את המאפיינים אדריכליים המקומיים משם יש להם המקור וpreserve פעילות וקישוריות של סינפסות neurochemical. השימוש בפרוסות מוח למחקר בסיסי, ובמאמצי תרופות, גדלו במקביל עם מספר המניפולציות ביוטכנולוגיים ניתן למדוד ולעקוב אחר ההתנהגויות הנוירוביולוגי של המוח בin vivo כמו הקשר 3,5-7. היתרונות העיקריים לשימוש במערכות מבוססת assay פרוס organotypic הוא שהיא מספקת שליטה ניסיונית קלה ומאפשרת מניפולציות מדויקות של סביבות תאיים. פורה, מערכות תרבות הפרוסה organotypic הוקמו ממגוון רחב של אזורים במוח כגון, אך לא מוגבלת ל, קליפה, חוט השדרה, ו8-10 המוח הקטן. יתר על כן, מספר cocultures הוכח, המאפשר ההערכה של תקשורת בין תאית על פני אזורי מוח דיסטלי, כמו גם בין תאי עצב ותאים פתולוגיים 11,12. פרוטוקולים רבים כבר הוקמו ליםuccessfully פרוסות organotypic התרבות ויכול לשמור על יכולת קיום לטווח ארוך ורבים מחקרים שנעשה לאחרונה עם החברה לנצל את שיטות ממשק קרום ושינויים שונים לזה 13. עיקרון זה שומר את פרוסות organotypic בממשק שבין הבינוני והאווירה humidified של החממה על ידי הצבת את הפרוסות על מסנן קרום נקבובי. כך הבינוני יכול לספק חומרים מזינים מספיק כדי להאכיל את פרוסות organotypic באמצעות תנועת נימים. בדרך כלל פרוסות הוכנו מבעלי החיים המוקדמים שלאחר לידה (3 - בן 9 ימים; P3 - 9). עם זאת, רקמות מוח מפרוסות אלה להציג רמה גבוהה של גמישות סלולרית ויש לי התנגדות טבועה לחצים מכאניים, שהוא מועיל להשגת תרבויות קיימא, עדיין סינפסות הבוגרת ומעגלי neuroanatomical לא פיתחו באופן מלא בגוף חי עד 2 עד 3 שבועות של גיל 14. לדוגמא, תצפיות קודמות שהראו כי פרוסות בהיפוקמפוס המתקבלות מP0 - 1 ילודים, למרות שמאוד viable הבא הכנה, איבד בהדרגה חלק ממאפיינים מורפולוגיים. בעיקרו של דבר, הם הוצגו להיות מתאימים לטווח ארוך תרבויות המצביעות על תאים לא בוגרים נטו יותר דה להבחין בהשוואה לתרבויות organotypic מבעלי חיים מבוגרים 15,16. מסיבה זו השיטה שלנו כבר מותאמת לפרוסות מוח organotypic מבוגרות שבהתבגרות והתפתחות אדריכלית הגיעו שלבי המסוף שלהם 13,17-21. עם זאת, שיטה זו מתאימה גם לילוד ופרוסות organotypic לנוער. ברגע שפרוסות organotypic קיימא הופקו כולו הצלחת המכילה את הפרוסות ניתן להביא להר biolistic והוגשה לregioselective משלוח וtransfection. הרכבה נכונה של אקדח הגן (כמתואר באיור 1), בכיוון 90 ° במרחק של 10 מ&quot;מ ישירות מעל את הפרוסות (מהצוהר לרקמות), מאפשרת משלוח biolistic המהיר של 40 ננומטר ללכתחלקיקי ld מצופים מטענים. מטענים אלה כגון צבעים ווקטורי DNA ניאון, כמו גם כל גן של עניין, מועברים בקלות לתוך פרוסות קיימא בקלות. שיטה זו ובכך מתארת ​​את הפרוטוקול נחוץ כדי לספק, באופן regioselective, חלקיקי זהב מטען מצופים לפרוסות מוח organotypic קיימא. קנה אקדח הגן וההרכבה אופטימלית שניתן לראות באיור 1. למידע נוסף לגבי בליסטיקה החבית והחלקיק השתפרה, אנא ראו אובריאן, et al. 17. חידודים לאחר גם מצוינים עבור המשתמש כדי לייעל את התנאים כגון הכמות הנכונה של זהב נמסרה לאזור היעד, מוגדרת ככמות טוען microcarrier (MLQ), ולקבוע את הסכום של DNA הטעון למ&quot;ג של זהב, שהוגדר כיחס טוען DNA (DLR). לפני מזרז DNA על חלקיקי זהב וטעינתם בצינורות TEFZEL שכולל מחסניות &quot;אקדח הגן בפועל9 ;, יש צורך לחשב את כמות DNA והזהב הנדרשת לכל transfection שיכול להשתנות מעט בין רקמות ותנאים (יחס צריך להישמר בין מ&quot;ג זהב 1 וDNA מיקרוגרם 1 עד 1: 5). זה חיוני כדי להכין את היחס הראוי של MLQ לDLR אחרת חלקיקי זהב DNA מצופים יכולים לדבוק יחד יוצרים גדול יותר ממסכת צפויה, אשר יכול להפחית את ההומוגניות הכוללת של התפשטות biolistic כמו גם נזק ורעיל רקמת גידול. שיטה זו מציגה את השיפורים האחרונים במסירת biolistic, שנבדקו ונקבעו להיות נוח עבור פרוסות מוח organotypic בילוד, לנוער ולמבוגרים. יתר על כן, על ידי ניצול התפשטות biolistic המופחת של קנה רובה הגן, המשתמש יכול transfect סלקטיבי אזור דייקן במוח עכשיו. בעקבות זמן הדגירה המתאים, הביטוי של חלבוני הניאון, אשר מגיע שיעורים מרביים בין 24 ו48שעה, ניתן דמיינה ידי epifluorescence ומיקרוסקופיה confocal. fluorophores אלו מאפשר ניתוח הצורני ולוקליזציה של תאים בודדים בתוך מבנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. עם זאת, אפנון regioselective של פרוסות organotypic על ידי הגנים Heterologous אחרים יכול גם להיות במעקב על ידי בדיקות אחרות ניתנות להכנות אלה. אסטרטגיות עבודה אפשריות למסירת הגן המקומית מוצגות באיור 2.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="656">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Helios gene gun system</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2431</td>
			<td>Gene gun and tube prep station</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">KCl</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S7907-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>P9791-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.2 &#181;m sterile filter unit</td>
			<td style="width:141px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>to filter media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:141px;">Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:141px;">Gibco</td>
			<td>10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N2</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>856568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>277649-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spermidine</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>161-3100EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Vibroslicer</td>
			<td style="width:141px;">Laica</td>
			<td style="width:119px;">VT1200</td>
			<td>We used a custom design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gene gun mount</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Built in house at U of T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Humidified cell culture incubator</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold nanoparticles</td>
			<td style="width:141px;">cytodiagnostics</td>
			<td style="width:119px;">G-40-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEYFP-N1</td>
			<td style="width:141px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tefzel tubing</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Barrel</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made by the LMB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture insert</td>
			<td style="width:141px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>76240 Fluka</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for convenience</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>user defined for usage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass slide</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td>2588-CA48323-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microcover glass</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td colspan="2">2448-CA48366-067-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:141px;">Vector laboratories</td>
			<td>H-1400&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

regioselective biolistic targeting in organotypic brain slices using a modified gene gun

Transfection של DNA כבר לא יסולא בפז למדעים ביולוגיים ועם התקדמות שחלה באחרונה להכנות פרוסה מוח organotypic, ההשפעה של גנים שונים יכולה Heterologous כך להיחקר בקלות, תוך שמירה על היבטים רבים של הביולוגיה in vivo. יש כבר התעניינות גוברת לtransfect תאי עצב סופני הבדיל שלשיטות transfection קונבנציונליים היו כרוכות בקשיים, כגון תשואות נמוכות והפסדים משמעותיים ביכולת קיום. transfection biolistic יכול לעקוף רבים מהקשיים אלה עדיין רק לאחרונה טכניקה זו שונו כך שתהיה נוח לשימוש ברקמות של יונקים. שינויים חדשים לתא המאיץ שיפרו את דיוק הירי של אקדח הגן והגדילו את מעמקיו של חדירה בעת גם מאפשר שימוש בלחץ נמוך יותר גז (50 psi) ללא אובדן יעילות transfection כמו גם מאפשרים התפשטות regioselective ממוקדת של הרשותrticles עד למרחק של 3 מ&quot;מ. בנוסף, טכניקה זו היא ישר קדימה ומהר יותר לבצע מאשר microinjections מייגע. חולף וביטוי יציב שניהם אפשריים עם הפגזת חלקיק שבו ביטוי episomal יכול להתגלות בתוך 24 שעות והישרדות התא הוצגה להיות טוב יותר מאשר, או לפחות שווה ל, שיטות קונבנציונליות. טכניקה זו יש עם זאת יתרון אחד מכריע: הוא מאפשר transfection להיות מקומיים ברדיוס מאופק יחיד ובכך מאפשרים למשתמש לבודד מבחינה אנטומית ההשפעות של גן Heterologous. כאן אנו מציגים פרוטוקול לעומק להכין פרוסות organotypic מבוגרות קיימא ולשלוח אותם לregioselective transfection באמצעות אקדח גנים משופר.

כדאיות הפרוסה organotypic יכולה להיות במעקב עם פעילות dehydrogenase חומצת החלב, תיוג יודיד propidium, ומכתים dUTP כפי שדווחה בעבר 13,22. ככל הנראה, את הכדאיות ואת היושרה של הפרוסות חשובות לביטוי המתמשך לטווח הארוך של המטען הגנטי נמסר. בעקבות מסירת biolistic לפרוסות organotypic, הביטוי של גן Heterologous הניאון היה פיקוח על ידי מיקרוסקופ confocal. האטימות של התפשטות biolistic באמצעות החבית שונה שניתן לראות באיור 3 א. איור 3 ב מציג תמונה מייצגת של אזור ההיפוקמפוס transfected באמצעות חלקיקי זהב DNA מצופים. איור 4 מראה תמונות נציג של פרוסות organotypic עכבר מבוגר transfected. כפי שניתן לראות באיור 4 א, ​​נוירון פורקינג עם נמל דנדריטים מדהים מצא בממשק של שכבת פורקינג והשכבה המולקולרית של CERebellum תערוכות תיוג בולט הבא transfection biolistic החולף עם pEGFP-N1. איור 4 מראה הגדלה גבוהה יותר של דנדריטים אלה שבי ניתן לצפות קוצים. איור 4C מראה תא פירמידה נמצא באזור CA1 של ההיפוקמפוס לאחר לידת biolistic של חלקיקי זהב pDSredFP מצופים . גם צבעים במקום מטעני DNA מקודד ניאון יכולים לשמש באופן דומה כדי להמחיש מאפיינים מורפולוגיים בפרוסות organotypic. Dio, אשר תוויות ממברנות הפלזמה, יכול במהירות רבה יותר להתוות מורפולוגיות תא בודדות או יכול לשמש בשילוב עם biolistic DNA המצופה לאותו האזור כדי לאשר את regioselection. כפי שניתן לראות באיור 5A נוירון מוכתם בדיו בהיפוקמפוס גם מראה דנדריטים ארוכים עם שדרות רבות. חץ מצביע על האקסון שמזוהה על ידי הנוכחות של boutons הסינפטי בהשוואה לdentritic קוצים על neurites האחרות. איור 5 מציג דוגמא נוספת לCA1, אשר מדגיש את תחזיות בהיפוקמפוס רבות עם כתם דלפק DAPI לתייג את הגרעין. איור 5 ג תערוכות הגדלה גבוהה יותר של סוגים אלה של הדנדריטים מקבילים עם שדרות רבות. ככל הנראה, התמונות האלה ממחישות מאפיינים מורפולוגיים הבאים תיוג סלולארי. שום דבר לא מונע אותן השיטות ממיושם כדי לספק כל מספר של גנים אקסוגניים המצופים על חלקיקי הזהב. כדי לאפשר אישור חזותי של transfection המוצלח, פלסמיד בודד ניתן לבנות לשתף להביע את שניהם את הגן של עניין וחלבון כתב ניאון באותו הווקטור. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig1highres.jpg" /> איור ג&#39;ין 1 קנה רובה והרכבה. () לשפר את<html> חבית ד שפותחה על ידי ד&quot;ר אובריאן בMRC-LMB שיש התפשטות biolistic מוגבלת שממזערת את ניזק לרקמות על ידי הורדת הלחץ הדרוש להאצת חלקיקים. (B) המבט מהצד של אקדח גן מותאם עלתה בי שפותחה על ידי ד&quot;ר הנדרסון וד&quot;ר אנדראס נאגי באוניברסיטת טורונטו. ההרכבה מחזיקה אקדח הגן בדיוק 90˚ ניצב לפרוסות organotypic תוך התרת למשתמש לשלוט בצורה מדויקת את המרחק של משלוח biolistic. תנאי biolistic אופטימליים צמצם החבית צריך להיות ממוקם ישירות מעל האזור של עניין במרחק 10 מ&quot;מ מפרוסות organotypic. נוף מאחור (C) של אקדח גן הרכבה. האזור של עניין להיות transfected צריך להיות ממוקם ישירות מתחת לצמצם החבית. מיקוד יכול להיות מאושר עם צבע (diolistic) או tranfection ניאון חלבון (biolistic).ank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig2highres.jpg" /> איור הכנת .2 Organotypic הפרוסה ומיקוד regioselective. () מוח עכבר מבוגר DMEM המוטבע מוכן לחיתוך. (B) העובש היה מודבק על vibroslicer גובר עם הלהב מוכן לחתוך פרוסה. (C) Regioselective ביטוי גני Heterologous אסטרטגיות למסירת biolistic לפרוסות מוח organotypic העטרה. תמונות שהוכנו מתמונות שהתקבלו מאטלס ההתייחסות אנטומיים אלן מוח אטלס 23. לוח שמאלי מציג שני אזורי המוח שונים הממוקדים לדוגמא ירושלים. כדי להגביל את ביטוי גנים (1) לאזור בקליפת המוח של האונה השמאלית. כדי להגביל את ביטוי Heterologous הגן (2) לאזור ההיפותלמוס במוח. פנל אמצעי מראה that את הביטוי של שני גני Heterologous (3 ו -4) יכולים להיות מבודדים ומשווים את ההיפוקמפוס של שתי ההמיספרות באותה הפרוסה organotypic, בעצם ביטול הטיה כלשהי משימוש בחלקים שונים ו / או מתן האפשרות לטיפול בcrosstalk דיסטלי מההשפעות של את אותם גנים. פנל ימני מראה את החפיפה האפשרית של משלוח מהונדס להביע את הגן הראשון (5) באזור קליפת המוח מדויק תוך הבעת גן אחר (6) בשונה אזור בקליפת המוח עדיין חופף. זה מאפשר לנתח את ההשפעה של אפנון הגנטי של כל גן Heterologous לבד וגם בשילוב בתוך אותו פרוסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig3highres.jpg" /> ראה .3 דפוס פיזור Biolistic איור על filtאה נייר ותמונה בהגדלה נמוכה. החבית () השתפרה פוטרה על נייר סינון כדי לקבוע את התפשטות חלקיקי זהב. צד שמאלי מציג את ההתפלגות של החבית השתפרה בזמן שהפנל הימני מראה חבית הרגילה. פס שחור: 1 סנטימטר. תמונה נלקחה מאובריאן, et al. 17. תמונה (B) נמוכה הגדלה מראה את להג transfection סטוכסטיים בתוך 3 מ&quot;מ התפשטות biolistic בתוך האזור בהיפוקמפוס של עכברים זקנים 6 בשבוע. בר לבן:. 100 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig4highres.jpg" /> איור 4 משלוח Biolistic של DNA חלבון פלואורסצנטי מקודד לפרוסות organotypic של עכברים זקנים 6 בשבוע. () Inverteתמונות confocal ד של פרוסת organotypic קבועה של המוח הקטן של תא פורקינג pEGFP-N1 חלקיקי זהב מצופה transfected. תמונה צולמה ב40X הגדלה. פס שחור:. 30 מיקרומטר (ב) מראה הגדלה 60x של נמל dentritic אחר של תא פורקינג כדי להדגיש את עמוד השדרה. פס שחור:. 5 מיקרומטר (C) מציג תמונת confocal של פרוסות קבועות שנלקחו מהאזור בהיפוקמפוס ב60x הגדלה של ארבעה DSredFP transfected תאים פירמידליים. פס שחור:. 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig5highres.jpg" /> .5 משלוח איור Diolistic של צבעי ניאון תיוג קרום לפרוסות organotypic. (א) מראה ההדמיה החיה של ליטר נוירון היפוקמפוסabeled עם DIO תחת הגדלת 20X. בבירור ניתן לראות קוצי dentritic כמו גם האקסון כפי שזוהה על ידי ההיעדרות של עמוד השדרה dentritic ואת הנוכחות של boutons הסינפטי שצוין על ידי חץ לבן. בר לבן: מכתים 30 מיקרומטר (B) מבוטא באזור בהיפוקמפוס שכותרתו עם DIO וcounterstained עם DAPI.. בר לבן:. 30 מיקרומטר הגדלה (C) גבוהה (60x) של dentritic הקוצים שנמצאו באזור CA1 של ההיפוקמפוס. בר לבן:. 5 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun at JoVE.com

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.

Regioselective Biolistic המיקוד בOrganotypic פרוסות המוח באמצעות אקדח ג&#39;ין השתנה

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

regioselective-biolistic-targeting-organotypic-brain-slices-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Views.  University of Toronto. Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices. 

Video: Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when neural circuits are matured and refined. Misregulation at this stage may lead to neurological and psychiatric disorders such as autism 
and schizophrenia1,2. Many genes have been studied in the prenatal brain and found crucial to many developmental processes3-5. However, their 
function in the postnatal brain is largely unknown, partly because their deletion in mice often leads to lethality during neonatal development, and partly because their requirement in early development hampers the postnatal analysis. To overcome these obstacles, floxed alleles of these genes are currently being generated in mice 6. When combined with transgenic alleles that express Cre recombinase in specific cell types, conditional deletion can be achieved to study gene function in the postnatal brain. However, this method requires additional alleles and extra time (3-6 months) to generate the mice with appropriate genotypes, thereby limiting the expansion of the genetic analysis to a large scale in the mouse brain.
Here we demonstrate a complementary approach that uses virally-expressed Cre to study these floxed alleles rapidly and 
systematically in postnatal brain development. By injecting recombinant adeno-associated viruses (rAAVs)7,8 encoding Cre into the neonatal brain, 
we are able to delete the gene of interest in different regions of the brain. By controlling the viral titer and coexpressing a fluorescent 
protein marker, we can simultaneously achieve mosaic gene inactivation and sparse neuronal labeling. This method bypasses the requirement of 
many genes in early development, and allows us to study their cell autonomous function in many critical processes in postnatal brain development,
 including axonal and dendritic growth, branching, and tiling, as well as synapse formation and refinement. This method has been used successfully 
in our own lab (unpublished results) and others8,9, and can be extended to other viruses, such as lentivirus 9, as well as to the expression of 
shRNA or dominant active proteins 10. Furthermore, by combining this technique with electrophysiology as well as recently-developed optical 
imaging tools 11, this method provides a new strategy to study how genetic pathways influence neural circuit development and function in mice 
and rats.

An in vivo method to test gene function in postnatal brain is described. Recombinant AAVs expressing Cre and/or a fluorescent protein are injected into neonatal mouse brain. Mosaic gene inactivation and sparse neuronal labeling are achieved, allowing rapid analysis of gene function in processes critical to neural circuit development.

פסיפס ניתוח פונקציה ג&#39;ין בפיתוח עכבר אחרי לידה המוח על ידי שימוש וירוס מבוססי רקומבינציה Cre

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and amphetamine), the role it plays in psychiatric illnesses (e.g. schizophrenia and Attention Deficit Hyperactivity Disorder), and its involvement in degenerative disorders like Parkinson's and Huntington's disease. Under normal physiological conditions, dopamine is known to regulate locomotor activity, cognition, learning, emotional affect, and neuroendocrine hormone secretion. One of the largest densities of dopamine neurons is within the striatum, which can be divided in two distinct neuroanatomical regions known as the nucleus accumbens and the caudate-putamen. The objective is to illustrate a general protocol for slice fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) within the mouse striatum. FSCV is a well-defined electrochemical technique providing the opportunity to measure dopamine release and uptake in real time in discrete brain regions. Carbon fiber microelectrodes (diameter of ~ 7 &mu;m) are used in FSCV to detect dopamine oxidation. The analytical advantage of using FSCV to detect dopamine is its enhanced temporal resolution of 100 milliseconds and spatial resolution of less than ten microns, providing complementary information to in vivo microdialysis.

Using fast-scan cyclic voltammetry to measure electrically evoked presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices.

דופמין Dynamics Presynaptic בתוך פרוסות המוח striatal עם Voltammetry סריקה מהירה מחזורי

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced tools currently used to study neurons, have only partly been taken on by oligodendrocyte researchers. Cell type-specific staining by viral transduction is a useful approach to study live organelle dynamics. This paper describes a protocol for visualizing oligodendrocyte mitochondria in organotypic brain slices by transduction with adeno-associated virus (AAV) carrying genes for mitochondrial targeted fluorescent proteins under the transcriptional control of the myelin basic protein promoter. It includes the protocol for making organotypic coronal mouse brain slices. A procedure for time-lapse imaging of mitochondria then follows. These methods can be transferred to other organelles and may be particularly useful for studying organelles in the myelin sheath. Finally, we describe a readily available technique for visualization of unstained myelin in living slices by Confocal Reflectance microscopy (CoRe). CoRe requires no extra equipment and can be useful to identify the myelin sheath during live imaging.

Myelinating oligodendrocytes promote rapid action potential propagation and neuronal survival. Described here is a protocol for oligodendrocyte-specific expression of fluorescent proteins in organotypic brain slices with subsequent time-lapse imaging. Further, a simple procedure for visualizing unstained myelin is presented.

ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...