כאשר פונקציית חלבון מסוימת משתנה על ידי מניפולציה גנים, תיאום של כשל גירוי ליקוי ריצה מוטורית נחשב תנאי הכרחי עבור קשר סיבתי בין LTD ולמידה מוטורית. כאן אנו מדגימים את השימוש בפרוטוקולים מרובים כדי להעריך בע"מ אשר יכול להיות המושרה באמצעות מנגנוני פיצוי בבעלי חיים גנים מניפולציה. לפני קצירת המוח, לצנן ולחמצן שתי 50 מיליליטר מקורים של ACSF על קרח.
כאשר טמפרטורת הפתרון מגיעה מתחת לארבע מעלות צלזיוס, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של טטרודוטוקסין מילימולרי אחד לאחת הנקניקיות הקרות בקרח. כדי לקצור את המוח, להחזיק את הראש ולהשתמש מספריים עיניים לחתוך את העור השטחי לאורך קו האמצע. באופן ידני לסגת את העור כדי לחשוף באופן נרחב את פני השטח של הגולגולת ולהשתמש במספריים לחתוך לאורך הגולגולת אופקית מן החור spinocerebellar הגדול רק מעל העיניים והאוזניים לפני חיתוך הגולגולת לאורך קו מעל שתי העיניים.
השתמש באזמל כדי לחתוך את המוח באמצע המוח הגדול ולבודד את החלק caudal של המוח, כולל המוח הקטן, מהגולגולת. לטבול את המדגם בפקעת קרה קרח של ACSF ולהתאים את צינורות הבועה, כך שהוא לא לעורר את בלוק המוח בפקעת. לאחר שבע דקות לפחות, השתמש במתת כדי להרים את בלוק המוח ולהשתמש בפיסת נייר סינון כדי לספוג כל ACSF עודף.
הר את הצד הגחוני של הרקמה על חתיכת אגר באורך 2 על 2 ס"מ עם דבק רפואי מתאים. השתמש בלהב כדי לחתוך את חצי הכדור הימני של רקמת המוח במקביל למישור הדני של תאי Purkinje ככל האפשר. חותכים ומסירים את הצד השני של חצי הכדור וחותכים את המוח בין הקוליקולי העליון והנחיתות.
חותכים את חוט השדרה ולהדביק את הצד הימני של המוח הקטן גזוז עם בלוק אגר על מגש הדגימה מקורר מראש. לאחר מכן, הטיית מגש הדגימה, יוצקים ACSF על המדגם כדי לתקן את הרקמה ולשטוף כל דבק עודף. כדי לחתוך את דגימת המוח, לכוון את הדגימה כך הצד הגבי של המוח הקטן הוא בחזית ויוצקים מספיק של קרח קר חיתוך ACSF בתוספת tetrodotoxin לחלוטין לטבול את המוח הקטן.
מניחים צינור גז לתוך פתרון החיתוך וליזום מבעבע עם תערובת גז פחמן דו חמצני חמצן. באמצעות פינצטה עדין וזכוכית מגדלת, להסיר את מאטר ארכנואידים בלו את peduncle המוח הקטן. לאחר הסרת גזע המוח וגוש אגר, לסובב את המגש 180 מעלות, כך פני השטח הגביים של המוח הקטן פונה סכין הגילוח של הרטט ולהתאים את מיקום החיתוך הראשון.
הגדר את משרעת הרטט ל-5.5 ותדירות ל-85 הרץ, את המהירות ל-3 עד 4 ואת עובי הפרוסה ל-300 מיקרומטר. כאשר הפרוסות המוח הקטן מתקבלות, השתמש ברשת ניילון כדי להעביר את החלקים לחממה אקרילית באמבט מים של 26 מעלות צלזיוס ולטבול לחלוטין את הדגימות ב- ACSF מחומצן טרי למשך שעה אחת לפחות. עבור דיווח מהדק תיקון תא שלם, להמיס picrotoxin מיקרומולרי אחד ב- ACSF על ידי אולטסוניקה במשך שלוש דקות לפני perfusing תא הקלטה 30 מעלות צלזיוס עם פתרון רעלן בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה.
לאחר מספר דקות, מעבירים פרוסה מוחית לתא ההקלטה ומסדרים את הרקמה עם משקל פלטינה וחוט ניילון. לאחר מכן מלאו אלקטרודה מגרה ב-ACSF טרי. כדי לעורר את הסיבים המקבילים, מניחים את האלקטרודה הממריצה על פני השטח של השכבה המולקולרית כ -50 מיקרומטרים משכבת התא Purkinje.
לגירוי של סיבי הטיפוס, מניחים את האלקטרודה המעוררת בתחתית שכבת התא Purkinje ולהשתמש microloader כדי למלא אלקטרודה הקלטה עם שמונה microliters של 0.45 מיקרומטר אשלגן מסונן או פתרון פנימי מבוסס צסיום. החל לחץ חיובי חלש על האלקטרודה הקלטה לפני טבילת האלקטרודה לתוך ACSF. ההתנגדות לאלקטרודה צריכה להיות 2-4 מגה-ם ויש לתקן את פוטנציאל הצומת הנוזלי.
התקרב לגוף התא הבהיר הבריא של תא Purkinje עם האלקטרודה הקלטה ולדחוף את פני השטח של התא Purkinje מעט. לאחר מכן להפסיק להפעיל את הלחץ החיובי ולהחיל לחץ שלילי עד חותם gigaohm נוצר. לאחר מכן השתמש בלחץ שלילי כדי ליצור תצורת תא שלם, שמירה על פוטנציאל הממברנה במינוס 70 מילי-וולט והחלת מינוס שני פולסים של מילי-וולט 100 אלפיות שנייה ב- 0.1 הרץ, ניטור רציף של התנגדות הקלט, התנגדות לסדרה ו קיבוליות קלט.
עבור אינדוקציה דיכאון לטווח ארוך, לעורר את השכבה המולקולרית עם דופק 0.1 אלפית השנייה ולהחיל גירוי דופק כפול כדי לזהות את זרמים סינפטית סינפטית סיבים מקבילים. יש לצפות בהנחיית דופק מזווגת ובעלייה הדרגתית משרעת ביחס לעלייה בעוצמת הגירוי. כדי לתעד את תגובת הבדיקה, יש למרוח פעימת הרץ יחידה של 0.1 ולהתאים את עוצמת הגירוי כך משרעת המעוררת היא סביב 200 picoamps.
לעורר את הסיבים המטפסים בתחתית שכבת התא Purkinje ולזהות את הזרמים הפוסט סינפטיים המעוררים סיבים מקבילים על ידי הפעלת סיבים מטפסים, להחיל גירוי דופק כפול. דיכאון דופק מזווג יש לראות באופן כל או אף אחד בקורלציה עם העלייה בעוצמת הגירוי. בניסוי מייצג זה, בשילוב של גירוי סיבים מקביל אחד וגירוי סיב טיפוס אחד בתנאי מהדק הנוכחי שימשו להכנת הפרוסה.
צורתו של היתד המורכבת שהושרתה על ידי הגירוי ההחדרה הייתה דומה לזו שהושרתה על ידי גירוי הסיבים המטפס לבדו עם הספימלט התלול הראשון ואחריו שניים עד שלושה ספייפלים. ספייק מורכב בצורת דומה נצפתה כאשר גירוי סיבים מקביל אחד היה אחריו 50 אלפיות שנייה מאוחר יותר על ידי מקבילה שנייה משכנעת וגירוי סיבים מטפס. בבדיקה זו בתנאי מהדק מתח באמצעות פתרון פנימי מבוסס צסיום, גירוי סיבים מקבילים היה ואחריו 50 אלפיות שנייה מאוחר יותר על ידי יישום במקביל של גירוי סיבים מקבילים שני depolarization סומטי.
זרם פנימי התעורר על דפולאריזציה סומטית ממינוס 70 לאפס מיליבולטים זרם הזנב התעורר גם לאחר קוטביות. לבסוף, חמישה גירויים סיבים מקבילים ב 100 הרץ ניתנו בו זמנית עם depolarization סומטי בתנאי מהדק מתח. שוב, דור חוזר ונשנה של זרמים פנימיים עורר במהלך depolarization ואת זרם הזנב היה המושרה לאחר repolarization.
כדי להעריך את הקשר בין cerebellar בע"מ ולמידה מוטורית בבעלי חיים גנים מניפולציה, פרוטוקולים מרובים יש להשתמש כדי לגרום בע"מ בתנאים פיזיולוגיים נעימים. אם המוח הקטן בע"מ הוא דמיינה בבעלי חיים שעברו מניפולציה גנטית לאחר למידה מוטורית, הקשר הסיבתי ביניהם יכול להיבדק באופן ישיר יותר.
