T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

1. גן מיקוד עיצוב <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין שיבוט מתאים BAC המכסה את האזור הגנומי של עניין. ודאו שזה isogenic לסוג של תאי גזע עובריים להיות שונה למשל, שיבוטים RPCI-23 וRPCI-24 BAC לגן מיקוד עם C57BL / 6 ES תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל גן קונבנציונלי מיקוד קריטריונים בעת תכנון וקטור המיקוד. פרמטרים עיקריים כוללים אם נדרש השינוי להיות מכונן או מותנה, הגדרת אקסונים קריטיים (CE) למחיקה באסטרטגיה גן בנוקאאוט ומרווח ומיקום של קלטות אינטרוניים. הערה: כל אחד מהם כבר דן בפירוט במקום אחר 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזורים הגנומי כל אחד מ5-6 קילו איגוף אתר שינוי היעד. הערה: הגודל של להכניס את subcloned לכן בדרך כלל 10-12 קילו, אם כי הגבול העליון יכול להיות גבוה ככל 80 kb עם העתק נמוך subcloning פלסמיד כמו p15A, pBR322 וכו &#39;ועד 200 kb עם BACוקטור. </li></ol> 2. Multiplex Recombineering oligos <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> oligos עיצוב לשדרת פלסמיד (פלסמיד subcloning) והסמן לבחירה (קלטת הכנסה). עיצוב כל אוליגו כך שהוא מכיל 180 HA נ&quot;ב איגוף אתר היעד הגנומי ו -20 נ&quot;ב של רצף תחול ספציפי של קלטת ההכנסה או פלסמיד subcloning (איור 2). הערה: זרועות הומולוגיה לא צריכים להכיל את כל אלמנטים חוזרים, הנוכחות של אלמנטים חוזרים תגרום למיקוד וsubcloning שגויים. ניתן לאתר אלמנטים חוזרים על ידי שימוש בכלים מבוסס אינטרנט כגון &#39;&#39; חזור Masker &#39;&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל אתר ייחודי אנזים הגבלה (RE) באחת מoligos הווקטור כדי linearize וקטור גן מיקוד לתאי גזע עובריים מיקוד (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו פרמטרים אוליגו באמצעות תכנית מנתח אוליגו. תשמור על עצמך, כדי למנוע מבנים משניים באזור תחולs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצר יותר HA (50 נ&quot;ב) של קלטת ההכנסה נסבלת ומניב מספר נמוך יותר של recombinants אבל להבטיח שפלסמיד subcloning HA הוא תמיד ארוך יותר (180 נ&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכיוון של להכניס את הדנ&quot;א הגנומי של השיבוט בפרט BAC תוך שימוש בכלים מבוסס אינטרנט כמו &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. להקים את הכיוון של שכפול מOris על ידי לבדוק את המפה של עמוד השדרה פלסמיד BAC המשמשת לבניית ספריית BAC. הערה: Oris הוא בדרך כלל הפוך לכיוון תעתיק של סמן כלורמפניקול (CHL) לכל פלסמידים BAC הנפוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שתי איגרות חוב מסוף phosphorothioate (PTO) עד סוף &#39;5 של אוליגו שהוא מנוגד לכיוון של שכפול על שיבוט BAC. הוסף שינוי 5 פוספט &#39;לאוליגו ההפוך (איור 2). הערה: קלטת PCR phosphorothioated א-סימטרית על עיכול אדום מייצרת ssDNA ביניים שראש יכול גדיל מפגרשל מזלג השכפול. הערה: מקסימאלי תדירות רקומבינציה זמנית הוא ציין עם הקלטות מוגנות הגדיל המפגר. גדיל מוביל מוגן או קלטות מוגנות כפולים לא יכולות לייצר את יעילות רקומבינציה שווה בכמה לוקוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין oligos עם עמוד או טיהור HPLC. </li></ol> 3. שינוי Clone BAC עם pSC101 BADgbaA Recombineering פלסמיד. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפוך את ה זן coli הנושא את recombineering BAC הבקיא, להפוך אותו עם פלסמיד pSC101 BADgbaA המכיל את הגנים אדומים 16. הערה: פלסמיד pSC101 BADgbaA מכיל את הגנים אדומים וRecA תחת השליטה של אמרגן arabinose מושרה ARAÇ-P BAD, סמן בחירת טטרציקלין וreplicon pSC101 רגיש לטמפרטורה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדקור קצה פיפטה סטרילית בתרבות אגר BAC ולחסן 5.0 מיליליטר של מרק lysogeny pH 8.0 המכיל 12.5 (LB)56; g מיליליטר -1 Chl. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות רועדות ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל 10% (v / v) פתרון גליצרול, צינורות microcentrifuge וcuvettes electroporation על קרח. מגניב צנטריפוגה בקירור גדולה וmicrocentrifuge עד 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הצפיפות האופטית (OD) של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר ולמדוד הספיגה ב 600 ננומטר. הכן תאי electrocompetent (כמפורט להלן) כאשר מגיעה קריאת 600 OD של 0.3 עד 0.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר בצנטריפוגה גדולה ב1,216 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של גליצרול 10% המצוננים ומסובב את תאים ב17949 XG במשך 20 שניות על 4 מעלות צלזיוס. לבצע שטיפת צעד כוללת של 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בהיקף כולל של 50 μl של גליצרול 10% ולהוסיף 10-200 ng של פלסמיד recombineering pSC101 BADgbaA. לקבל השעיה תא בודדת על ידי pipettingמעלה ומטה מספר פעמים ולאחר מכן להעביר את התאים קובט electroporation פער 1 מ&quot;מ טרום צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate התאים עם הגדרה של 1.8 KV, 25 μF ו -200 Ω. הערה: בדוק את ההגדרות הנכונות עבור כל מותג של electroporator. קבוע זמן של electroporation פחות מ -4 מעיד על קיומו של מלח וזיהומים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לשחזר את התאים ב 1 מיליליטר של LB ולהעביר את תאי צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות gbaA BAC ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות רועדות ב 200 סל&quot;ד. הערה: פלסמיד pSC101 BADgbaA הולך לאיבוד כאשר תאים גדלים על 37 מעלות צלזיוס בשל איון של גורם שכפול RepE הטמפרטורה רגישה. לגדל תאי gbaA על 30 מעלות צלזיוס כדי לשמור על פונקציות recombineering. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מיליליטר של LB המכיל 12.5 מיקרוגרם מיליליטר -1 Chl ו -4 מיקרוגרם מיליליטר -1 טטרציקלין (ט) לתרבות gbaA BAC התאוששה. לגדולO BAC gbaA התרבות / N ליום 30 ב &#160; ° C רועד ב 200 סל&quot;ד. הערה: יעילות השינוי של electroporating פלסמיד gbaA supercoiled היא גבוהה מספיק כדי לאפשר O צמיחת הרוויה / N בתקשורת נוזלית. </li></ol></li></ol> 4. הכנת הכנסת קלטות וsubcloning פלסמידים <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב HA לקלטת ההכנסה (ים) ופלסמיד subcloning, לבצע תגובת השרשרת של פולימראז (PCR), תוך שימוש oligos הארוכה שונה כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי למנוע שריד פלסמיד לתגובת recombineering, להשתמש מוצא R6K או תבנית פלסמיד טווח מארח הצר דומה כדי להגביר את קלטת ההכנסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, linearize תבנית פלסמיד באמצעות לעכל RE (טבלה 2). בחר RE שחותך מחוץ לאזור ההגברה PCR וחום מומת. חום להשבית RE כפי שהומלץ על ידי manufacturer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת השרשרת של פולימראז (PCR), תוך שימוש במערכת ה- DNA פולימראז hotstart באיכות גבוהה. הכן תערובת אמן PCR כמפורט (לוח 3). לבצע רכיבה תרמית כפי שמוצג (לוח 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוצרי ה- PCR על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. עומס 1-5 μl של כל PCR על 1% (w / v) agarose ג&#39;ל המכיל 0.5 מ&quot;ג מיליליטר -1 Ethidium ברומיד (EtBr). הערה: הנוכחות של מוצרי הגברה שאינן ספציפיים אינה מתערבת בתגובת recombineering. במקרים מסוימים עם זאת, פריימר-הדימרים עלולים להפחית את יעילות recombineering. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להסיר את תבנית פלסמיד מPCRs על ידי טיפול עם DpnI אחריו לנקות PCR. DNA Elute בנפח מינימאלי של מים ללא יונים סטרילי (כפי שהומלץ על ידי היצרן). הערה: תוספת של DpnI לקנה בלתי תוצאות PCR תגובות ביעילות מופחתת של מחשוף של התבנית ה- DNA פלסמיד מפוגל דואר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת DNA PCR מוגבר על ידי ניתוח agarose ג&#39;ל נגד קבוצה ידועה של תקני ה- DNA למשל, λ HindIII לעכל או באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop. </li></ol> 5. subcloning Plus הכנסה <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את O / לקפל N BAC gbaA תרבות 50 על ידי הוספת 200 μl 10 מיליליטר LB + Chl + ט. לגדול ב 30 &#160; ° C רועד ב 200 סל&quot;ד עבור שעה 1 50 דקות. כולל מדגם לשמש כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל כל חומרים והציוד לrecombineering 4 ° C כמתואר בשלב 3.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים pH אגר LB 8 צלחות המכילות ריכוז הנכון של האנטיביוטיקה המתאימה סלקטיבית (ים) שתאפשר בחירה של בר דנ&quot;א, כמו גם לבחירה של וקטור subcloning (לוח 4). הערה: אנטיביוטיקה חלקם pH רגיש. השימוש LBpH אגר 8 ככלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% (w / v) פתרון של L-arabinose. סנן לעקר דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר. הערה: arabinose גורם ביטוי של חלבוני recombineering מפלסמיד gbaA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את OD של תרבות gbaA BAC באמצעות ספקטרופוטומטר. ברגע שOD 600 של .25-0.3 הוא הגיע, לגרום לחלבוני recombineering כפי שמתוארת בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון arabinose 10% עד 10 מיליליטר של תרבות BAC כדי להשיג ריכוז סופי של arabinose של 0.2%. כולל תרבות uninduced (ללא arabinose) לשמש כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תרבות BAC ל-37 &#160; ° רועד C חממה וגורם לביטוי אדום במשך 45 דקות רועדות בסל&quot;ד 230. הערה: הביטוי של חלבונים אדומים הוא לא יעיל ליום 30 במעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים ולשטוף עם גליצרול 10% 3 פעמים כמתואר בשלב 3.1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600-1,000 ng כל אחד מפלסמיד subcloning וקלטת ההכנסה (ים) תגובת recombineering. כולל וקטור בלבד ווקטור תוספת בקרות להוסיף יחידים לבדוק את מיומנות רקומבינציה ויושרה של הווקטור והקלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבל השעיה תא בודדת על ידי pipetting מעלה ומטה. בצע electroporation כמתואר בשלב 3.1.7 והתאוששות שלאחר מכן ב 1 מיליליטר LB ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לרב-עותק פלסמידים או 10 מיליליטר של LB ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות עבור וקטורי BAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים שונים צלחת למשל התרבות התאושש, 90%, 10%, 1% על הצלחות אגר בחירה הכפולה ולגדול ב 37 &#160; ° C במשך 16 שעות. </li></ol> 6. ניתוח של recombinants <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: בחר 6-12 מושבות ולבצע מושבה PCR באמצעות פריימר איגוף HA ופריימר הספציפי להוסיף. כולל פלסמיד subcloning וCAS ההכנסהפלסמיד Sette כמו גם שיבוט BAC ההורה כפקדים שליליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח agarose ג&#39;ל של PCRs המושבה. לזהות שיבוטים חיוביים על ידי הנוכחות של להקה בהירה בגודל הצפוי. הערה: היעילות הגבוהה של תהליך שיבוט SPI מייצרת recombinants הנכון בעיקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות לתוך 5 מיליליטר pH LB 8 המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית ולגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן minipreps DNA באמצעות ערכת טיהור עמודה לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BAC miniprep DNA באמצעות בידוד פנול, כלורופורם סטנדרטי או פרוטוקול דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מעכלים RE על DNA miniprep. DNA נפרד על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. לנתח את דפוסי RE לזהות שיבוטים המכילים את גדלי שברים הצפויים של וקטור המיקוד הנכון. בחר RE שמפלה בין להכניס הווקטור חסר (ים) ואת הווקטור המכיל את התוסף (ים) באופן ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Optioסופי: להשיג תאים שהם מחוסרים BAC, שעדיין קיים בE. coli לאחר recombineering, להשתמש DNA פלסמיד miniprep להפוך DH5alpha או DH10B E. תאי coli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע רצפי DNA על פני HA וקלטת הכנסה כדי לבדוק שגיאות סינתזת אוליגו. </li></ol>

<ol>
	<li>Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+1+(HDAC1),+but+not+HDAC2,+controls+embryonic+stem+cell+differentiation.">Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).</li><li>Harvey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+and+carcinogen-induced+tumorigenesis+in+p53-deficient+mice.">Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice.</a> Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).</li><li>Waterhouse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoproliferative+disorders+with+early+lethality+in+mice+deficient+in+Ctla-4.">Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4.</a> Science. 270, 985-988 (1995).</li><li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells.">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li><li>Hasty, P., Rivera-P&#233;rez, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+of+homology+required+for+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells.">The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).</li><li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+beta-globin+locus+by+homologous+recombination.">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317, 230-234 (1985).</li><li>Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+transgene+insertion+into+human+chromosomes+by+adeno-associated+virus+vectors.">Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors.</a> Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).</li><li>Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-strand-break+repair+model+for+recombination.">The double-strand-break repair model for recombination.</a> Cell. 33, 25-35 (1983).</li><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-256 (1984).</li><li>Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F., Soriano, P. M., Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombineering+pipeline+to+make+conditional+targeting+constructs.">A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs.</a> Methods Enzymol. 477, 125-144 (2010).</li><li>Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+logic+for+DNA+engineering+using+recombination+in+Escherichia+coli.">A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).</li><li>Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics.">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li><li>Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+by+ET-recombination.">Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli.">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).</li><li>Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+homologous+recombination-based+method+of+genetic+engineering.">Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering.</a> Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+recombineering+approach+by+adding+RecA+to+&#955;+red+recombination.">An improved recombineering approach by adding RecA to &#955; red recombination.</a> Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).</li><li>Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+recombineering+plasmids+for+gram-negative+bacteria.">A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.</a> Gene. 379, 109-115 (2006).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RecE+enhances+linear-linear+homologous+recombination+and+facilitates+direct+cloning+for+bioprospecting.">Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.</a> Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).</li><li>Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecE/RecT+and+Redalpha/Redbeta+initiate+double-stranded+break+repair+by+specifically+interacting+with+their+respective+partners.">RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners.</a> Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).</li><li>Maresca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+heteroduplex+intermediates+in+lambda+Red+homologous+recombination.">Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination.</a> BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).</li><li>Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda+Red+recombineering+in+Escherichia+coli+occurs+through+a+fully+single-stranded+intermediate.">Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate.</a> Genetics. 186, 791-799 (2010).</li><li>Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+recombineering-based+method+for+generating+conditional+knockout+mutations.">A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations.</a> Genome Res. 13, 476-484 (2003).</li><li>Chan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombineering+based+approach+for+high-throughput+conditional+knockout+targeting+vector+construction.">A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction.</a> Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).</li><li>Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cloning+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli.">DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).</li><li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA.">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73, 56-65 (2001).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Valenzuela, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+of+the+mouse+genome+coupled+with+high-resolution+expression+analysis.">High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.</a> Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomics+profiling+of+HDAC+inhibitors+reveals+selective+targeting+of+HDAC+complexes.">Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes.</a> Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).</li><li>Mulryan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vas+deferens+contraction+and+male+infertility+in+mice+lacking+P2X1+receptors.">Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors.</a> Nature. 403, 86-89 (2000).</li><li>Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enzymatic+basis+of+processivity+in+lambda+exonuclease.">The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).</li><li>Antoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue.">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li><li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells.">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).</li><li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+use+of+YACs,+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals.">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li><li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+trimming:+minimizing+clone+overlaps.">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li></ol>

T.R.R is the inventor of a British patent application on multiplex recombineering technology.

בנייה של שורות תאי גזע עובריים ומודלי עכבר היסטורי מעורבת גן המיקוד באמצעות בונה פלסמיד המכילה את האלל שונה 4. עם זאת, הבנייה של וקטורי גן המיקוד המורכבים אלה הוכיחה את עצמו צוואר בקבוק משמעותי בזמן הייצור של מודלים כאלה. פיתוח אסטרטגיות בניית וקטור recombineering מבוסס אפשר עיצובי וקטור משופרים והרכבת וקטור יעילה יותר. עם זאת, פרוטוקולי recombineering הנוכחיים עדיין כרוכים שלבים מרובים, דורשים טיהור פלסמיד ביניים ולהשתמש זני חיידקים שונים. Subcloning הכנסה בתוספת מציע גישה חדשנית לבניית וקטור שניתן לבצע באירוע electroporation אחד בזן מארח BAC תושב. השירות של SPI במיקוד גן נבדק כאן במגוון רחב של יישומי בניית וקטור. בכל המקרים שנבדקו כאן, SPI הוכיח להיות יעיל ופלסמיד רקומביננטי הנכון הופק.ברוב המכריע של המקרים, הקלטות שונות מרובות הוכנסו בצורה נכונה בוקטור המיקוד. קלטות DNA גדולות ווקטורים שוכנו בקלות בפרוטוקול SPI והפגינו הגמישות של מערכת זו. SPI מסתמך על השימוש ברצפי הומולוגיה ארוכים והגנת phosphorothioate (PTO) של קלטות DNA ליניארי. שינוי PTO מקנה הגנה מפני exonucleases לDNA ליניארי 20,21 וHA הארוך מגביר את יעילות רקומבינציה להתיר ריבוב. עם זאת, סינתזה של רצפי אוליגו יותר מגדילה את הסיכוי של צבירת שגיאות במיוחד מחיקות. מוטציות באוליגו יכולות להיות הרסניות, במיוחד אם הם מכסים אזורי חלבון קידוד. רצפי DNA על פני HA ומכסה את האורך המלא של הקלטת הוכנסה מומלץ מאוד לחסל את השיבוטים עם כל שינויי רצף. שימוש במערכת ה- DNA פולימראז באיכות גבוהה גם הציעה להימנע מהקדמה שלשגיאות y PCR. האורך ובהרכב של HA של פלסמיד subcloning הוא יותר קריטי ביחס לזה של קלטת ההכנסה (מידע לא מוצג). עבור יישומים רגישים במיוחד כמו הבנייה של וקטורים להתרפק, שבו מוטציות כל באזורי אקסון אינן נסבלות, HA של קלטת ההכנסה יכול להתקצר (50-120 נ&quot;ב), כדי למנוע בעיות הקשורות לoligos הארוכה. קלטת ההכנסה גם ניתן להשאיר phosphorothioated ללא שינוי או הכפול (שבו ידע של הכיוון של שכפול אינו זמין). אבל ריבוב במקרים אלה עדיין דורש מוגנים ארוך פלסמידים subcloning HA. אזהרה של אסטרטגיה המסוימת הזה היא הפחתת יעילות ריבוב שעשוי להשפיע על שיבוט SPI בלוקוסים שונים. האורך של קלטת ההכנסה ופלסמיד subcloning הוא עוד פרמטר חשוב בשיבוט SPI. מולקולות DNA גדולות electroporate פחות ביעילות ובהשפעה מצטברת, ניתנו מחדשquirement להציג את כל הקלטות באותו התא (מידע לא מוצג). הריבוב הוא יעיל ביותר עם קלטות הכנסה קטנות יותר. DNA שברים גדולים יותר מאשר 3 kb גם להציב גבול על עיבוד ssDNA האדום בתיווך, שהוא יעיל ביותר עד 3 kb 30. קלטות הכנסה עולה על 3 קילו הן כפולים resected ולשלב מחדש בצורה פחות יעיל באמצעות מסלול עצמאי בטא 20. לכן, הקרנה של מושבות מספיק כדי לזהות את השיבוט הנכון הופכת להיות חשובה במקרים אלה. משך זמן ארוך יותר של פוסט electroporation רקומבינציה גם מגדיל את סיכויי ההחלמה של השיבוט הנכון בתרגילי SPI קשים. עד ארבע קלטות קטנות (&lt;1.5 kb) יכול להיות מוכנסת בו זמנית עם תהליך SPI, אם כי יעילות הריבוב יורדת עם כל קלטת נוספת (מידע לא מוצג). עם זאת, זה משקף את התוצאה של ניסוי SPI אופטימלי ורצוי לשקול את גבולות ריבוב בעת שימוש רבים קלטות גדולות. </p&gt; הפיתוח של כלים לעריכת הגנום כמו חזרות palindromic קצרות interspaced באופן קבוע התקבצו מערכת (CRISPR) endonuclease -cas9 אפשרה יצירת שינויי הגנום רומן והובילה להנדסת הגנום יעילה יותר 36. עם זאת, טכנולוגיות חדשות יותר אלה משלימים וקטורי גן מיקוד ולא תפסו את מקומן. זה שחזה כי מערכת CRISPR-CAS יכולה להחליף בחירת אנטיביוטיקה ולהמשיך ולעדכן את פרוטוקול recombineering זמנית.

הפיתוח של טכנולוגיות מיקוד גן אפשר הבנייה של שורות תאים ובמודלים עכבר כדי לחקור מערכות ביולוגיות שונות 1-3. שלב ראשון מפתח בשינוי של רצף הגנומי הוא התכנון והבנייה של גן מיקוד וקטור 4. וקטורי מיקוד הם בונה פלסמיד הנושאות את האלל של עניין המכיל את השינויים הרצויים (ים) מוקף סמן בחירה (למשל, נאומיצין), ואזורים הגנומי ארוכים הנדרשים לרקומבינציה ההומולוגית יעילה בתאי יונקים 5. שינוי גנטי מדויק מושגת על ידי כניסתה של וקטור המיקוד לתאי גזע עוברי (ES) 6 או 7 תאים סומטיים, לפי רקומבינציה הומולוגית בין מתיחות זהות של רצף ה- DNA על וקטור המיקוד ואת תוצאות המוקד הגנומי בהעברת השינוי המיועד לגנום על ידי המרה גן 8. modifi כזהניתן להזריק תאי גזע עובריים לed blastocysts עכבר כדי לייצר צאצאים (תעתועים), כי אז יכולים לשדר אללים שונה אלה באמצעות תאי המין 9. תוואי חלופי כדי לייצר עכברים הטרנסגניים כרוך microinjection של וקטור ביטוי גנים לzygotes עכבר תאי יחיד, מה שמוביל לשילוב של הווקטור בגנום העכבר 10 האקראי. שיטות מסורתיות של בניית וקטור יש לסמוך על קונבנציונלי &quot;לגזור ולהדביק&quot; שיבוט באמצעות אנזימי הגבלה וligases DNA לשבט הסמן שונה בחירה ושברים הגנומי לשדרת וקטור. עם זאת, גורם טבוע הגבלה של שיבוט מסורתי הוא הבחירה של אתרי הגבלה והמיצוב, במיוחד עם רצפי DNA עוד. זה לעתים קרובות מחייב צעדי subcloning מרובים וגם מציג רצפי DNA זרים לתוך הווקטור, אשר מוביל לעתים קרובות ליעילות נמוכה של גן המיקוד. Recombineering (eng recombinogenicineering) היא טכנולוגית הנדסת DNA שמתגברת על מגבלות אלה באמצעות רקומבינציה ההומולוגית (HR) בתיווכו של חלבוני רקומבינציה הפאג בE. תאי coli 11,12. מאז כל אזור של רצף הומולוגי יכול לשמש כמצע של recombineering, אילוצי הזמינות של אתרי הגבלה יוסרו. רצפי DNA גדולים יכולים להיות שונה בצורה חלקה ישירות in vivo, וכך גם שמירה על השלמות המבנית שלהם 13. Recombineering הוא מאוד יעיל עם הומולוגיות קצרות (50 נ&quot;ב) 14 ולכן זרועות הומולוגיה (HA) יכולות להיות משולבות בצורה נוחה רצפי אוליגו סינטטיים. בניסוי טיפוסי recombineering, אוליגו או שבר כפול DNA גדילים (dsDNA) המכיל HA הוא electroporated לתוך E. המוסמך recombineering תאי coli המכילים את היעד ממוקם גם על כרומוזום או על פלסמיד 15. פוטנציאל רקומבינציה מוענק על ידי ביטוי מושרה של rec האדוםombination חלבונים של הפאג 16,17 או חלבוני RecET של prophage RAC 18. Exonuclease האדום / Rece ממיר dsDNA ליניארי לדנ&quot;א חד-גדילים (ssDNA) ביניים, שהוא חייב לאחר מכן על ידי שותפתה, אדום / rect, חלבון חד-גדילי חישול (SSAP) 19. חישול של ssDNA ארוך או קצר לאוליגו רצף היעד המשלים שלה מתרחש בגדיל המפגר של מזלג השכפול ומוביל לשילוב של הרצף באתר היעד. מפגר רקומבינציה ssDNA גדיל הוא בסיס ליעילות הגבוהה של recombineering ויכול להיות מתואר על ידי 20,21 מודל רקומבינציה &#39;ביתא&#39;. עבודה recombineering אופיינית לבנות וקטור גן מיקוד כרוך אחד משני המסלולים הבאים. מסלול אחד כרוך subcloning אזור גנומי הרצוי משיבוט BAC העכבר לפלסמיד ואחרי ההחדרה רציפה של אתרי רקומבינציה LoxP, סמן בחירה <sעד&gt; 22 וכו &#39;, או את המסלול החלופי כרוך מיקוד המוקד הגנומי BAC עם אלמנטי וקטור מיקוד השונים על ידי מספר סיבובים של recombineering 10,23 ולאחר מכן subcloning המוקד שונה לפלסמיד על ידי תיקון פער ​​שיבוט 24,25. וריאציות על הנושא הזה כבר בשימוש בצינורות recombineering תפוקה גבוהה שונים, כחלק מתוכניות ייצור עכבר גדול 26,27. עם זאת, הליכים אלה כרוכים בשלבים מסובכים וארוכים, דורשים השימוש בוקטורים מיוחדים וא coli זנים (למשל, Cre לבטא בתאים) ולנצל את צעדי ביניים אחת או יותר מטיהור DNA וקטור מחדש שינוי (טבלה 1). Subcloning הכנסה בתוספת (SPI) הוא טכניקת recombineering רומן המשלבת רקומבינציה בטא ותיקון פער ​​שיבוט לתהליך יחיד (איור 1). ההרכבה וקטור SPI היא פשוטה, מהירה וגמישה, ומציעה שיפור משמעותי בrecombi הסטנדרטיneering גישות (טבלת 1). הנה, אנחנו מדגימים את הקלות ואת השירות של שימוש SPI עבור יישומי בניית וקטור שונים עם דגש מיוחד על בניית עיצובי וקטור שאינם סטנדרטיים ומאתגרים. מקרי מבחן כללו בניית וקטור להתרפק כתב ניאון, וקטור להתרפק ביטוי חלבון מתויג כפול, וקטור כתב ניאון BAC ווקטור נוקאאוט מותנה. אלה בחנו דרכים שונות הדרישה למקם קולט פני תא, לטהר מורכב חלבון גרעיני או על תנאי לקטוע הביטוי של גן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:941px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:315px;">Antibiotics except Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">Ampicillin, A9518-5G; 
			Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; 
			Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Invivogen:&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ant-zn-1</td>
			<td>Zeocin is also available from Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">C57BL/6 BAC clones</td>
			<td style="width:127px;">CHORI: https://bacpac.chori.org/&#160;</td>
			<td style="width:216px;">RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries</td>
			<td>129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">KOD hotstart DNA polymerase system</td>
			<td style="width:127px;">Millipore: https://www.merckmillipore.com</td>
			<td style="width:216px;">71086-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">L-Arabinose</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:315px;">Long oligos</td>
			<td style="width:127px;">IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com</td>
			<td style="width:216px;">IDT Ultramers or Gene Link long oligos</td>
			<td>PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">MinElute PCR purification kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">28004</td>
			<td>Minimum elution PCR purifications kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">QIAPrep Spin Mini Prep kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">27104</td>
			<td>Silica column or similar matrix kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:127px;">NEB: https://www.neb.com</td>
			<td style="width:216px;">DpnI: R0176L</td>
			<td>See NEB website for a list of RE.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

Watch this Scientific Journal Video about Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors at JoVE.com

Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

subcloning-plus-insertion-spi-novel-recombineering-method-for-rapid

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

16.4K Views.  University of Leicester. Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Video: Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering הומולוגי רקומבינציה בבונה<em&gt; דרוזופילה</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...