T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

デザインをターゲット1.ジーン<ol style="margin-left: 40px;"><li>興味のあるゲノム領域をカバーする適切なBACクローンを注文。これは、ES細胞などを修正する、RPCI-23およびC57BL / 6 ES細胞を用いて遺伝子ターゲティングのためのRPCI-24 BACクローンのタイプに同質遺伝子であることを確認してください。 </li><li>ターゲティングベクターを設計する際の基準を対象に従来の遺伝子を適用します。主なパラメータは、変更がイントロンカセットの遺伝子ノックアウト戦略との間隔と配置に削除のための重要なエクソン（CE）を定義する、構成的または条件付きであることが要求されているかどうかが含まれる。 注：これらの各々は、他の場所10で詳細に論じられている。 </li><li>ターゲット修飾部位に隣接する5〜6キロバイトの各ゲノム領域を選択してください。 注：上限等をp15A、pBR322のようなプラスミドをサブクローニング低コピーと80キロバイトとBACと、最大200キロバイトの高さであり得るが、サブクローン挿入物の大きさは、通常、そのため10〜12キロバイトですベクトル。 </li></ol> 2.マルチプレックス遺伝子改変オリゴ<ol style="margin-left: 40px;"><li>プラスミド骨格（サブクローニングプラスミド）および選択マーカー（挿入カセット）の設計上のオリゴ。それは180 bpのHA隣接するゲノム標的部位と挿入カセットまたはサブクローニングプラスミド（ 図2）の具体的なプライミング配列の20塩基対を含むように各オリゴを設計します。 注：相同アームは、任意の反復要素を含むべきではない、反復的な要素の存在が間違っターゲティングおよびサブクローニングになります。反復要素 &#39;は、&#39;リピートマスカー」などのウェブベースのツールを使用して検出することができる。 </li><li> （ 図2）を標的ES細胞のための遺伝子ターゲッティングベクターを線形化するベクトルオリゴの1にユニークな制限酵素（RE）サイトもあります。 </li><li>オリゴアナライザプログラムを使用して、オリゴパラメータを確認してください。プライミング領域での二次構造を避けるように注意してくださいS。 </li><li>挿入カセットの短いHA（50 bp）が許容され、組換え体の下側の数を出したが、サブクローニングプラスミドHAが長い（180 bp）を常にであることを保証されている。 </li><li> &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;のようなウェブベースのツールを使用して、特定のBACクローンのゲノムDNAインサートの向きを決定します。 BACライブラリーの構築に使用されるBACプラスミドバックボーンのマップをチェックして、オリスからのレプリケーションの方向を確立します。 注：オリスは、すべての一般的に使用されるBACプラスミドのためのクロラムフェニコール（クロロフィル）マーカーの転写方向とは、通常は反対である。 </li><li> BACクローンのレプリケーションの方向と反対であるオリゴの5 &#39;末端に二つの末端ホスホロチオエート（PTO）結合を追加する。リバースオリゴ（ 図2）に5 &#39;リン酸修飾を追加します。 メモ：Red消化の際に非対称ホスホロチオエートPCRカセットは、その缶プライムラギング鎖のssDNA中間生成複製フォークの。 注：最大多重組換え頻度は、ラギング鎖保護されたカセットを用いて観察される。リーディング鎖は、保護またはデュアル保護されたカセットは、いくつかの遺伝子座で同等の再結合効率を得られないことがあります。 </li><li>ページまたはHPLC精製とオリゴを注文。 </li></ol>はpSC101 BADgbaA遺伝子改変プラスミド3. BACクローン変換。 <ol style="margin-left: 40px;"><li> E.を作成するには熟練したBACのコンビを有する大腸菌株は、赤遺伝子16を含むBADgbaAはpSC101プラスミドとそれを変換する。 注：はpSC101 BADgbaAプラスミドはアラビノース誘導のaraC-P BADプロモーター、テトラサイクリン選択マーカーおよび温度感受性はpSC101レプリコンの制御下に赤とのRecA遺伝子が含まれています。 <ol><li> BAC寒天培養におけるスタブの滅菌ピペットチップおよび12.5を含有するLB培地（LB）pH8.0で5.0mlの接種56; G ml -1のクロロフィル。 200rpmで振盪し、5時間37℃で成長する。 </li><li>氷上で10％（v / v） のグリセロール溶液、マイクロチューブ、エレクトロポレーションキュベットを冷却する。 4℃の冷蔵大型遠心機およびマイクロ遠心クール。 </li><li>分光光度計を使用して培養物の光学密度（OD）を決定し、600nmで吸光度を測定する。 0.3〜0.8のOD 600読み取りに達したとき（後述）エレクトロコンピテント細胞を調製する。 </li><li> 4℃で5分間、1216×gで大きな遠心分離機で50mlの遠心チューブに細胞をスピンダウンする。 </li><li>チルド10％グリセロール1mlで細胞を洗浄し、4℃で20秒間17949×gで細胞をスピンダウン。洗浄工程を3回の合計を実行します。 </li><li> 10％グリセロールの全量50μlで細胞を再懸濁し、はpSC101 BADgbaAのコンビプラスミドの10-200 ngのを追加します。ピペッティングにより単一細胞懸濁液を得数回上下した後、予備冷却1ミリメートルギャップエレクトロポレーションキュベットに細胞を移す。 </li><li> 1.8 KV、25μFと200Ωの設定で細胞をエレクトロポレーション。 注：エレクトロの各ブランドの正しい設定を確認してください。エレクトロポレーションの時定数は、4未満の塩および他の不純物の存在を示している。 </li><li>直ちにLB 1mlの細胞を回収し、50 ml遠心チューブに細胞を移す。 </li><li> 200 rpmで振とう2時間、30℃でBAC gbaA文化を育てる。 注：細胞は、温度感受性REPEの複製因子の不活性化を37℃で増殖させた場合はpSC101 BADgbaAプラスミドが失われた。コンビ機能を維持するために30℃でgbaA細胞を増殖。 </li><li>回収されたBAC gbaA培養液に12.5μgのml -1のクロロフィルを含むLBの9ミリリットルと4μgのmlの-1テトラサイクリン（テト）を追加します。成長する30でのBAC gbaA文化O / N &#160; ℃、200 rpmで振とう。 注：スーパーコイルgbaAプラスミドをエレクトロポレーションの形質転換効率は、液体培地中で飽和成長O / Nを可能にするのに十分に高い。 </li></ol></li></ol>挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドの4準備<ol style="margin-left: 40px;"><li>以下に説明するように、挿入カセット（複数可）およびサブクローニングプラスミドにHAを組み込むことが、長い修飾オリゴを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う。 <ol><li>オプション：コンビ反応へのプラスミドのキャリーオーバーを防止するために、挿入カセットを増幅するためにR6K起源または類似の狭い宿主域プラスミドテンプレートを使用します。 </li><li>代替的に、RE消化物（ 表2）を用いてプラスミド鋳型を線形。 PCR増幅領域の外側にカットして、熱不活性化されるREを選択してください。 MANUFにより推奨されるように熱がREを不活性化acturer。 </li><li>忠実度の高いホットスタートDNAポリメラーゼ系を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を設定する。 （ 表3）に詳述するようにPCRマスターミックスを調製する。 （ 表3）に示すように、熱サイクルを実行します。 </li></ol></li><li>アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を分析する。 0.5mgのml -1の臭化エチジウム（EtBrを）を含む1％（w / v）アガロースゲル上に、各PCRの負荷1-5μlの。 NOTE：非特異的増幅産物の存在は、リコンビ反応に干渉しない。しかし、いくつかの場合において、プライマーダイマーはコンビ効率を減少させることができる。 </li><li> PCR精製キットを用いてPCR産物を精製する。 <ol><li>オプション：PCRクリーンアップに続いてDpnIで処理することにより、PCRのからプラスミドテンプレートを削除。 （製造業者によって推奨されるように）滅菌脱イオン水の最小量のDNAを溶出する。 注：のDpnIを添加すると、目の切断の効率の低下にPCR反応の結果を未精製のためメチル化プラスミドDNA鋳型を電子。 </li></ol></li><li> DNA標準、例えば 、λのHindIII消化物の既知のセットに対して、またはナノドロップ分光光度計を用いて、アガロースゲル分析によってPCR増幅されたDNAを定量化する。 </li></ol> 5.サブクローニングプラスの挿入<ol style="margin-left: 40px;"><li> 10mlのLB +クロロフィル+テトに200μlのを追加することによって、O / N BAC gbaA文化50倍に希釈する。 30で成長する&#160; ℃で1時間50分間200rpmで振盪。ネガティブコントロールとして使用されるべきサンプルを含む。 </li><li>ステップ3.1.2で説明したように4℃にすべてのリコンビの資機材を冷やす。 </li><li> LB寒天のpHをサブクローニングベクター（ 表4）を選択するための、ならびに挿入されたDNA断片の選択を可能にする適切な選択的抗生物質（単数または複数）の正確な濃度を含む8のプレートを注ぐ。 注：一部の抗生物質は、pH感受性である。 LBを使用してくださいルールとして寒天のpH 8。 </li><li> L-アラビノースの10％（w / v）の溶液を調製する。 0.2μmのシリンジフィルターに通して滅菌フィルター。 NOTE：アラビノースgbaAプラスミドからコンビタンパク質の発現を誘導する。 </li><li>分光光度計を用いてBAC gbaA文化のODを確認してください。 0.25〜0.3のOD 600に到達すると、次のステップで説明するように、リコンビニアリングタンパク質を誘導する。 </li><li> 0.2％のアラビノースの最終濃度を達成するためにBAC培養液10mlに10％のアラビノース溶液200μlを加える。 （アラビノースを含まない）非誘導培養物が含まれるが、陰性対照として使用する。 </li><li> 37にBAC文化を転送&#160; C振盪インキュベーター°、230 rpmで振とう45分間レッド発現を誘導する。 注：赤のタンパク質の発現は、30℃において非効率的である。 </li><li>細胞をスピンダウンし、ステップ3.1.5で説明したように、10％グリセロールで3回洗浄する。 </li><li> 、600-1追加000コンビ反応にサブクローニングプラスミドおよび挿入カセット（複数）の各々ngの。ベクター及びカセットの再結合能力との整合性をチェックするための唯一のベクトルとベクトルプラス単一のINSERTコントロールを含めます。 </li><li>上下にピペッティングすることによって単一細胞懸濁液を得た。 BACベクターの3時間37℃で、多コピープラスミドまたはLB 10ml中で1時間、37℃で1 mlのLB中にステップ3.1.7およびその後の回復に記載のようにエレクトロポレーションを行う。 </li><li>デュアル選択寒天プレート上で回収した培養プレートの異なる希釈例えば、90％、10％、1％及び37で成長&#160; 16時間のC°。 </li></ol>組換え体の6.分析<ol style="margin-left: 40px;"><li>オプション：6から12個のコロニーを選び、HAフランキングプライマーとインサート特異的プライマーを用いたコロニーPCRを行う。サブクローニングプラスミドと挿入CASを含めるセッテプラスミドだけでなく、ネガティブコントロールとして、親BACクローン。 <ol><li>コロニーPCRのアガロースゲル分析を実行します。予想されたサイズの明るいバンドの存在により陽性クローンを特定します。 注：SPIクローニングプロセスの高効率化は、主に正しい組換え体を生成します。 </li></ol></li><li>選択的な抗生物質を含む5 mlのLBのpHを8にコロニーをピックアップし、37℃でO / Nを育てる。 </li><li>製造業者の指示に従ってカラム精製キットを用いてDNAミニプレップを準備します。 </li><li>標準的なフェノール - クロロホルム離または類似のプロトコルを使用してBACミニプレップDNAを準備します。 </li><li>ミニプレップDNA上REダイジェストを実行します。アガロースゲル電気泳動によって別々のDNA。正確なターゲティングベクターの期待断片サイズを有するクローンを同定するためにREパターンを分析。はっきり挿入欠けているベクトル（S）とインサート（複数可）を含有するベクターを区別するREを選択してください。 </li><li>オプティオナル：E.依然として存在しているBAC、を欠いている細胞を得るためにコンビ後コリ DH5アルファまたはDH10B 大腸菌を形質転換し、ミニプレッププラスミドDNAを使用してcoli細胞 。 </li><li>オリゴ合成のエラーをチェックするために、HAと挿入カセット間でDNA配列決定を行います。 </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue.">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li><li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells.">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).</li><li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+use+of+YACs,+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals.">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li><li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+trimming:+minimizing+clone+overlaps.">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li></ol>

T.R.R is the inventor of a British patent application on multiplex recombineering technology.

ES細胞株およびマウスモデルの構築は、歴史的に修飾された対立遺伝子4を含むプラスミド構築物を用いて標的化遺伝子を含んでいた。しかし、これらの複雑な遺伝子ターゲティングベクターの構築は、このようなモデルのタイムリーな生産の大幅なボトルネックであることが判明した。コンビ基づくベクター構築戦略の開発は、改良されたベクターの設計と、より効率的なベクターの組み立てを可能にした。それにもかかわらず、現在のコンビニアリングプロトコルはまだ、複数のステップを伴う中間プラスミド精製を必要とし、別の細菌の菌株を使用しています。プラスの挿入をサブクローニングすることは常駐BAC宿主株で1エレクトロポレーションイベントで実行することができるベクターの構築への新しいアプローチを提供しています。遺伝子ターゲティングにおけるSPIの有用性は、ベクター構築のさまざまなアプリケーションで、ここで試験した。ここで調べたすべての場合において、SPIは、効率的であることが証明され、正しい組み換えプラスミドを作製した。多くの場合、複数の異なるカセットを正しくターゲティングベクターに挿入した。大きなDNAカセットおよびベクターを容易SPIプロトコルに収容し、このシステムの柔軟性を実証した。 SPIは、直鎖DNAカセットの長い相同性配列、およびホスホロチオエート（PTO）保護の使用に依存している。 PTO修飾は、線形DNA 20,21にエキソヌクレアーゼに対する保護を与え、長いHAの多重化を可能にするために再結合効率を増加させる。しかし、より長いオリゴ配列の合成は、エラーを特に欠失を蓄積する可能性を増大させる。それらはタンパク質コード領域をカバーしている場合、オリゴ中の変異は、特に有害である。 DNAのHA全体のシーケンシングおよび挿入されたカセットの全長をカバーするには非常にすべての配列変化を有するクローンを排除することをお勧めします。高忠実度DNAポリメラーゼシステムの使用はまた、導入を回避することが提案されているY PCRエラー。サブクローニングプラスミドのHAの長さおよび組成は、挿入カセット（データは示していない）のものと比較してより重要である。エクソン領域内の任意の変異が許容されていないノックインベクターの構築などの特に敏感なアプリケーションでは、挿入カセットのHAは、長いオリゴに伴う問題を回避するために、（50〜120 bp）を短縮することができる。 （複製の方向の知識が利用できない場合）、挿入カセットはまた、ホスホロチオエート修飾されていないまたはデュアル残すことができる。しかし、これらの場合の多重化はまだ長いHAサブクローニングプラスミドが保護された必要があります。この特定の戦略の注意点は、潜在的に異なる遺伝子座でのSPIクローニングに影響を与える可能性が多重化効率の低下である。 挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドの長さは、SPIクローニングにおける別の重要なパラメータである。より大きなDNA分子が少なく効率的にエレクトロポレーションおよび効果は、再指定された、累積され同じセル内のすべてのカセットを導入するquirement（データは示さず）。多重化は、より小さな挿入カセットと最も効率的です。 DNAは3キロバイト30までの最も効率的であるのssDNA処理を、仲介3キロバイトより大きく、また赤に制限を置く断片化します。 3キロバイトを超える挿入カセットを切除デュアルであり、ベータ独立した経路20を介して、より少ない効率的に再結合する。したがって、正しいクローンを同定するのに十分なコロニーのスクリーニングは、これらの場合に重要になる。組み換えポストエレクトロポレーションの長い持続時間も難しいのSPI演習で正しいクローンの回復の可能性が高くなります。四つの小カセット（&lt;1.5キロバイト）多重化効率は、各追加のカセットと共に減少するものの、SPI処理と同時に挿入することができるまで（データは示さず）。しかしながら、これは最適なSPIの実験の結果を反映し、多くの大規模なカセットを使用する場合には、多重化の限界を考慮することが望ましい。 </P&gt; クラスタ化された定期的にinterspaced短い回文反復（CRISPR）のようなゲノム編集ツール-cas9エンドヌクレアーゼシステムの開発は、新規ゲノム修飾の作成 ​​を可能にした、より効率的なゲノム工学36につながっている。しかし、これらの新しい技術は、遺伝子ターゲッティングベクターを補完するのではなく、それらに取って代わっている。これは、CRISPR-casのシステムは、抗生物質選択を交換し、さらに多重コンビプロトコルを絞り込むことが想定される。

遺伝子ターゲティング技術の開発は、異なる生物学的システム1-3を調査するために、細胞株およびマウスモデルの構築を可能にした。ゲノム配列の修飾において重要第一段階は、ベクトル4遺伝子ターゲティングの設計および構築である。ターゲティングベクターは、選択マーカー（ 例えば、ネオマイシン ）、および哺乳動物細胞5における効率的な相同組換えのために必要な長いゲノム領域に隣接し、所望の修飾（複数可）を含む関心のある対立遺伝子を担持するプラスミド構築物である。正確な遺伝子改変は、胚性幹（ES）細胞を6または体細胞7、意図された変更の転送におけるターゲティングベクター上のDNA配列の同一ストレッチおよびゲノム遺伝子座の結果とすることにより、相同組換えにターゲティングベクターを導入することにより達成される遺伝子変換8によるゲノムへ。このようなMODIFIES細胞は、その後の生殖細胞9を介してこれらの修飾された対立遺伝子を伝達することができる子孫（キメラ）を生成するために、マウスの胚盤胞に注入することができる編。トランスジェニックマウスを作製するための代替経路は、マウスゲノム10中のベクターのランダムな組込みをもたらす単細胞マウス接合体への遺伝子発現ベクターのマイクロインジェクションを含む。ベクター構築の従来の方法は、ベクターバックボーンに異なる選択マーカーとゲノム断片をクローニングするために制限酵素およびDNAリガーゼを使用してクローニング「カット＆ペースト」従来に頼ってきた。しかし、伝統的なクローニングの固有の制限要因は、特に、より長いDNA配列と、制限部位の位置および選択である。これは多くの場合、複数のサブクローニングステップを必要とし、また、多くの場合、遺伝子ターゲティングの低い効率につながるベクターに、外来DNA配列が導入されています。 コンビ（組換えENGineering）E.ファージの組換えタンパク質によって媒介される相同組換え（HR）を使用してこれらの制限を克服するDNA工学技術である大腸菌細胞 11,12。相同配列の任意の領域をリコンビニアリングの基質として働くことができるので、制限部位の利用可能性の制約が取り除かれる。大型DNA配列は、シームレス従って、それらの構造的完全性を維持13、インビボで直接改変することができる。遺伝子改変は、短い相同性（50塩基対）14、したがって相同性ア ​​ーム（HA）との非常に効率的で便利な合成オリゴ配列に組み込むことができる。典型的なコンビ実験、オリゴまたはHAを含む二本鎖DNA（dsDNAの）断片でコンビテントE.にエレクトロポレーションされている染色体上またはプラスミド15のいずれかに位置して標的を含有する大腸菌細胞 。再結合の可能性は、Red RECの誘導発現によって付与されるombinationファージ16,17のタンパク質またはRACプロファージ18のRecETタンパク質。赤/のRecEエキソヌクレアーゼは、そのパートナー、赤/ RECT、一本鎖アニーリングタンパク質（SSAP）19によって結合される一本鎖DNA（ssDNA）の中間に線形のdsDNAに変換する。長い一本鎖DNAまたはその相補的標的配列への短いオリゴのアニーリングは複製フォークのラギング鎖上に発生し、標的部位での配列の組み込みをもたらす。鎖のssDNA換えを遅れはコンビの高効率の基礎であり、「ベータ」再結合モデル20,21によって記述することができる。 遺伝子ターゲッティングベクターを構築するための典型的なコンビニアリングワークフローでは、次の二つの経路のいずれかを伴う。一つの経路は、loxP組換え部位の順次挿入したプラスミドへのマウスBACクローンから目的のゲノム領域、選択マーカーをサブクローニング含ま<s&gt; 22等まで、または代替ルートが10,23のコンビ、その後24,25のクローンを作成するギャップ修復によってプラスミドに変更された軌跡をサブクローニング複数回によって異なるターゲティングベクター要素とBACゲノム遺伝子座を標的にすることを含む。このテーマの変形が大きいマウスの生産プログラム26,27の一部として別の高スループットコンビパイプラインで使用されてきた。しかしながら、これらの手順は、複雑で長い段階を含む特殊なベクターおよびE.を使用する必要が大腸菌株（ 例えば、Creを発現する細胞）およびベクターDNAの精製と再変換した（ 表1）の一つ以上の中間ステップを利用する。サブクローニングプラス挿入（SPI）は、ベータ再結合し、単一のプロセス（ 図1）へのクローニングのギャップ修復を組み合わせた新しいコンビ技術です。 SPIベクトルアセンブリは、簡単、迅速かつ柔軟であり、標準recombiに有意な改善を提供するエンジニアリング（ 表1）に近づく。ここでは、使いやすさと非標準と挑戦的なベクトルのデザインの構築に特に重点を置いて異なるベクター構築アプリケーションのためのSPIを使用することの有用性を実証する。テストケースは、蛍光レポーターノックインベクターの構築は、二重タグ付きタンパク質の発現ノックインベクター、BAC蛍光レポーターベクターおよび条件付きノックアウトベクターを含んでいた。これらの要件は、細胞表面受容体を局在化する核タンパク質複合体を精製または条件付きの遺伝子の発現を焼灼するために種々検討した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:941px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:315px;">Antibiotics except Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">Ampicillin, A9518-5G; 
			Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; 
			Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Invivogen:&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ant-zn-1</td>
			<td>Zeocin is also available from Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">C57BL/6 BAC clones</td>
			<td style="width:127px;">CHORI: https://bacpac.chori.org/&#160;</td>
			<td style="width:216px;">RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries</td>
			<td>129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">KOD hotstart DNA polymerase system</td>
			<td style="width:127px;">Millipore: https://www.merckmillipore.com</td>
			<td style="width:216px;">71086-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">L-Arabinose</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:315px;">Long oligos</td>
			<td style="width:127px;">IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com</td>
			<td style="width:216px;">IDT Ultramers or Gene Link long oligos</td>
			<td>PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">MinElute PCR purification kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">28004</td>
			<td>Minimum elution PCR purifications kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">QIAPrep Spin Mini Prep kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">27104</td>
			<td>Silica column or similar matrix kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:127px;">NEB: https://www.neb.com</td>
			<td style="width:216px;">DpnI: R0176L</td>
			<td>See NEB website for a list of RE.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

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Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

subcloning-plus-insertion-spi-novel-recombineering-method-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biology

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

16.3K ビュー.  University of Leicester. Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

生物学

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

人間の腸粘膜の外植片の文化と偏刺激する新規な方法

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

における相同組換えコンストラクトを遺伝子改変<em&gt;ショウジョウバエ</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

ヒト胚性幹細胞におけるターゲティングジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子の強化

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

細胞由来の細胞外マトリックスの急速な、単離、機能性研究のためのスケーラブルな方法、および分析

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

蚊を殺虫化合物小説の毒性試験のプロトコル

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...